BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica VÀ Phellinus pini Ở BẮC TRUNG BỘ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica VÀ Phellinus pini Ở BẮC TRUNG BỘ Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS TS TRẦN ĐÌNH THẮNG GS TS TIAN-SHUNG WU NGHỆ AN - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Vinh, ngày 25 tháng năm 2017 Ký tên Nguyễn Ngọc Tuấn LỜI CẢM ƠN Luận án đƣợc thực phịng thí nghiệm chun đề Hố hữu khoa Hố học, phịng thí nghiệm Trung tâm Phân tích thực phẩm Mơi trƣờng, Trƣờng Đại học Vinh, Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, khoa Công nghệ sinh học, khoa Hóa học - Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến GS TS Trần Đình Thắng - Trƣờng Đại học Vinh, GS TS Tian-Shung Wu - Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan ngƣời thầy giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất, giúp tơi bƣớc q trình thực luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Hoa Du, PGS TS Hoàng Văn Lựu tạo điều kiện thuận lợi, động viên tơi q trình làm luận án Tơi bày tỏ lịng biết ơn PGS TS Ping-Chung Kuo - Đại học Quốc gia Cheng-Kung, Đài Loan giúp đánh giá kết PGS TS Trần Ngọc Lân - Viện Nghiên cứu Phát triển vùng - Bộ Khoa học Công nghệ (MOST) PGS TS Ngô Anh khoa Sinh học, Đại học Khoa học Huế giúp định danh mẫu nấm Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phịng ban chức năng, thầy cơ, cán phịng Đào tạo Sau đại học, khoa Hố học, trƣờng Đại học Vinh, bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình ngƣời thân động viên giúp đỡ tơi hồn thành luận án Nghệ An, ngày 25 tháng năm 2017 Nguyễn Ngọc Tuấn i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi DANH SÁCH SƠ ĐỒ viii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm kí sinh trùng 1.1.1 Các polyketide 1.1.1.1 Các polyketide không bị khử 1.1.1.2 Các polyketide bị khử khơng hồn tồn bị khử hoàn toàn 1.1.2 Các nonribosomal peptide 10 1.1.2.1 Các nonribosomal peptide mạch thẳng 11 1.1.2.2 Các nonribosomal (depsi)peptide dạng vòng 12 1.1.2.3 Các cyclooligomer (depsi)peptide 15 1.1.3 Các hợp chất chuyển hóa kết hợp polyketide–nonribosomal peptide 15 1.1.4 Terpenoid 17 1.1.5 Một số hợp chất khác 20 1.2 Nấm Isaria japonica Yasuda 20 1.2.1 Đặc điểm 20 1.2.2 Thành phần hóa học nấm ký sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) 21 1.2.3 Hoạt tính sinh học nấm kí sinh côn trùng (Isaria japonica Yasuda) 22 1.3 Các hợp chất chuyển hóa bậc hai phân lập từ nấm Phellinus 23 1.3.1 Polysaccharide protein-polysaccharide 23 1.3.2 Steroid 24 1.3.3 Terpenoid 26 1.3.3.1 Sesquiterpenoid 26 1.3.3.2 Diterpenoid 29 ii 1.3.3.3 Triterpenoid 30 1.3.4 Flavone 31 1.3.5 Styrylpyrone 32 1.3.6 Furane 36 1.3.7 Polychlorinat 36 1.3.8 Một số hợp chất khác 36 1.4 Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 36 1.4.1 Đặc điểm loài nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 36 1.4.2 Thành phần hóa học Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 37 Chƣơng 38 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 38 2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.1.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 38 2.1.2 Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập 38 2.1.3 Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hợp chất 38 2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học 38 2.2 Hóa chất thiết bị 38 2.2.1 Hoá chất 38 2.2.2 Thiết bị 38 2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 38 2.2.2.2 Sắc ký cột (CC) 39 2.2.2.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 39 2.2.2.4 Phổ tử ngoại (UV) 39 2.2.2.5 Phổ hồng ngoại (FT-IR) 39 2.2.2.6 Phổ khối lƣợng (MS) 39 2.2.2.7 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 39 2.2.2.8 Điểm nóng chảy 39 2.2.2.9 Độ quay cực riêng 39 2.3 Nghiên cứu hợp chất từ sợi nấm kí sinh trùng (Isaria japonica Yasuda) 40 2.3.1 Quy trình nghiên cứu 40 2.3.2 Phƣơng pháp phân lập 42 2.3.2.1 Môi trường PDA phương pháp nuôi cấy 42 iii 2.3.2.2 Môi trường lên men lỏng phương pháp nuôi cấy nấm 43 2.3.3 Phân lập hợp chất 44 2.3.4 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc 48 2.3.4.1 Hợp chất IJM-1 (Chất mới) 48 2.3.4.2 Hợp chất IJM-2 48 2.3.4.3 Hợp chất IJM-3 49 2.3.4.4 Hợp chất IJM-4 50 2.3.4.5 Hợp chất IJM-5 50 2.3.4.6 Hợp chất IJM-6 51 2.3.4.7 Hợp chất IJM-7 51 2.3.4.8 Hợp chất IJM-8 51 2.3.4.9 Hợp chất IJM-9 52 2.3.4.10 Hợp chất IJM-10 53 2.3.4.11 Hợp chất IJM-11 53 2.3.4.12 Hợp chất IJM-12 54 2.3.4.13 Hợp chất IJM-13 54 2.3.4.14 Hợp chất IJM-14 54 2.3.4.15 Hợp chất IJM-15 55 2.4 Nghiên cứu hợp chất từ thể nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 55 2.4.1 Mẫu nấm 55 2.4.2 Phân lập hợp chất 55 2.4.3 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc 58 2.4.3.1 Hợp chất PPH-1 58 2.4.3.2 Hợp chất PPH-2 58 2.4.3.3 Hợp chất PPE-1 59 2.4.3.4 Hợp chất PPE-2 59 2.4.3.5 Hợp chất PPE-3 60 2.5 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kháng nấm hợp chất 60 Chƣơng 62 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62 3.1 Nấm Isaria japonica Yasuda 62 iv 3.1.1 Phân lập hợp chất 62 3.1.2 Xác định cấu trúc hợp chất 62 3.1.2.1 Hợp chất IJM-1 (chất mới) 62 3.1.2.2 Hợp chất IJM-2 74 3.1.2.3 Hợp chất IJM-3 78 3.1.2.4 Hợp chất IJM-4 81 3.1.2.5 Hợp chất IJM-5 82 3.1.2.6 Hợp chất IJM-6 83 3.1.2.7 Hợp chất IJM-7 84 3.1.2.8 Hợp chất IJM-8 86 3.1.2.9 Hợp chất IJM-9 89 3.1.2.10 Hợp chất IJM-10 92 3.1.2.11 Hợp chất IJM-11 94 3.1.2.12 Hợp chất IJM-12 95 3.1.2.13 Hợp chất IJM-13 96 3.1.2.14 Hợp chất IJM-14 97 3.1.2.15 Hợp chất IJM-15 98 3.2 Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 98 3.2.1 Phân lập hợp chất 98 3.2.2 Xác định cấu trúc hợp chất 99 3.2.2.1 Hợp chất PPH-1 99 3.2.2.2 Hợp chất PPH-2 107 3.2.2.3 Hợp chất PPE-1 107 3.2.2.4 Hợp chất PPE-2 116 3.2.2.5 Hợp chất PPE -3 118 3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kháng nấm hợp chất 118 KẾT LUẬN 123 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 PHỤ LỤC 148 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất styrylpyrone từ lồi Phellinus hoạt tính sinh học chúng 32 Bảng 3.1 Các hợp chất phân lập từ sợi nấm Isaria japonica Yasuda 62 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR IJM-1 70 Bảng 3.3: Tính chất lý hóa IJM-1, IJM-2, beauveriolides I 72 Bảng 3.4: So sánh số liệu phổ 1H-NMR, 13 C-NMR phần cấu trúc leucine, 3- hidroxyl-4-methyloctanoic, alanine IJM-1 beauveriolides I 73 Bảng 3.5: Số liệu phổ NMR hợp chất IJM-2 77 Bảng 3.6: Số liệu phổ NMR hợp chất IJM-3 80 Bảng 3.7: Số liệu phổ 1H-NMR hợp chất IJM-4 82 Bảng 3.8: Số liệu phổ 1H-NMR hợp chất IJM-6 83 Bảng 3.9: Số liệu phổ 1H-NMR hợp chất IJM-7 85 Bảng 3.10: Số liệu phổ NMR hợp chất IJM-8 87 Bảng 3.11: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất IJM-9 90 Bảng 3.12: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất IJM-10 93 Bảng 3.13: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất IJM-11 94 Bảng 3.14: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất IJM-13 96 Bảng 3.15: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất IJM-14 97 Bảng 3.16: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất IJM-15 98 Bảng 3.17: Các hợp chất phân lập từ nấm Phellinus pini 99 Bảng 3.18: Bảng số liệu phổ NMR hợp chất PPH-1 105 Bảng 3.19: Số liệu phổ NMR hợp chất PPE-1 115 Bảng 3.20: Số liệu phổ NMR hợp chất PPE-2 117 Bảng 3.21: Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học hợp chất 119 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1 Nấm Isaria japonica Yasuda 21 Hình 1.2 Nấm Phellinus pini (Brot.) Bondartsev & Singer 37 Hình 2.1 Ni cấy nấm môi trƣờng PDA 43 Hình 2.2 Mơ tả bƣớc cấy nấm môi trƣờng lỏng 44 Hình 3.1 Phổ khối lƣợng (HR-ESI-MS ESI-MS) hợp chất IJM-1 63 Hình 3.2 Phổ hồng ngoại (IR) hợp chất IJM-1 64 Hình 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất IJM-1 64 Hình 3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất IJM-1 65 Hình 3.5 Phổ DEPT hợp chất IJM-1 65 Hình 3.6 Các phần cấu trúc I đến VI hợp chất IJM-1 66 Hình 3.7 Phổ COSY hợp chất IJM-1 66 Hình 3.8 Phần cấu trúc axit amin leucine hợp chất IJM-1 67 Hình 3.9 Phổ HMBC hợp chất IJM-1 67 Hình 3.10 Phổ HMBC hợp chất IJM-1 68 Hình 3.11 Phổ HSQC hợp chất IJM-1 68 Hình 3.12 Phần cấu trúc axit amin tritophan hợp chất IJM-1 69 Hình 3.13 Phần cấu trúc axit amin alanine hợp chất IJM-1 69 Hình 3.14 Phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methyloctanoyl hợp chất IJM-1 70 Hình 3.15 Tƣơng quan tƣơng tác xa hợp chất IJM-1 72 Hình 3.16 Các phần cấu trúc I đến VI hợp chất IJM-2 75 Hình 3.17 Phần cấu trúc axit amin phenylalanine hợp chất IJM-2 76 Hình 3.18 Phần cấu trúc axit amin alanine hợp chất IJM-2 76 Hình 3.19 Phần cấu trúc 3-hydroxyl-4-methyloctanoyl hợp chất IJM-2 77 Hình 3.20 Phần cấu trúc vòng A B hợp chất IJM-3 79 Hình 3.21 Phần cấu trúc vịng B C hợp chất IJM-3 79 Hình 3.22 Phần cấu trúc vịng C D hợp chất IJM-3 79 Hình 3.23 Phần cấu trúc vịng D E hợp chất IJM-3 80 Hình 3.24 Phần cấu trúc vịng A B hợp chất IJM-8 86 Hình 3.25 Phần cấu trúc vịng B C hợp chất IJM-8 87 Hình 3.26 Phần cấu trúc vòng C D hợp chất IJM-8 87 Hình 3.27 Phần cấu trúc vòng D mạch carbon dài hợp chất IJM-8 87 68 Phụ lục 134: Phổ DEPT hợp chất axit 3-amino butanoic (IJM-15) PL17 Phụ lục phổ hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) Phụ lục 135: Phổ 1H-NMR hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) 69 Phụ lục 136: Phổ 1H-NMR hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) Phụ lục 137: Phổ 1H-NMR hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) 70 Phụ lục 138: Phổ 13C-NMR hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) Phụ lục 139: Phổ 13C-NMR hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) 71 Phụ lục 140: Phổ 13C-NMR hợp chất ergosta-7,22-dien-3-ol (PPE-2) 72 Phụ lục 141: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kháng nấm 73 PL18 Phụ lục phổ hợp chất Isarin (IJM-1) Phụ lục 142: Phổ 1H-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 143: Phổ 1H-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) 74 Phụ lục 144: Phổ 1H-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 145: Phổ 1H-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) 75 Phụ lục 146: Phổ 13C-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 147: Phổ 13C-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) 76 Phụ lục 148: Phổ DEPT hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 149: Phổ DEPT hợp chất Isaria (IJM-1) 77 Phụ lục 150: Phổ HMBC hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 151: Phổ HMBC hợp chất Isaria (IJM-1) 78 Phụ lục 152: Phổ HMBC hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 153: Phổ HMBC hợp chất Isaria (IJM-1) 79 Phụ lục 154: Phổ HSQC hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 155: Phổ HSQC hợp chất Isaria (IJM-1) 80 Phụ lục 156: Phổ HSQC hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 157: Phổ COSY hợp chất Isaria (IJM-1) 81 Phụ lục 158: Phổ COSY hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 159: Phổ 1H-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) 82 Phụ lục 160: Phổ COSY hợp chất Isaria (IJM-1) Phụ lục 161: Phổ 1H-NMR hợp chất Isaria (IJM-1) ...1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA NẤM Isaria japonica VÀ Phellinus pini Ở BẮC TRUNG BỘ Chuyên... đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật nấm Isaria japonica Phellinus pini vùng Bắc Trung Bộ? ?? Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu luận án nấm Isaria japonica. .. dò hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kháng nấm Những đóng góp luận án - Đây nghiên cứu có hệ thống Vi? ??t Nam thành phần hóa học lồi nấm Isaria japonica nấm Phellinus pini khu vực Bắc Trung Bộ