BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y -KHÁNH THỊ NHI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊMLIPOSOME DOXORUBICIN Chuyên ngành CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC Mã số : 62 72 04 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI- NĂM 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ PGS.TS Nguyễn Minh Chính Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội Phản biện 2: PGS.TS Trần Hữu Dũng Trường Đại học Y Dược Huế Phản biện 3: GS.TS Võ Xuân Minh Trường Đại học Dược Hà Nội Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Học viện Quân y vào hồi: 00 ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt ADN ARN BP DC DĐVN DOPE DDAB DOX DPPC DPPE DPPS DSPA DSPC DSPE DSPE– PEG DSPG EPC EPG FDA HEPES HPC HPI HPLC KHV KTTP LUV MLV MVV PC Từ/cụm từ đầy đủ Acid deoxiribinucleic Acid ribonucleic Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoeia) Dược chất Dược điển Việt Nam Dioleoylphosphatidyl ethanolamin Dimethyldioctadecylammonium bromid Doxorubicin hydroclorid Dipalmitoylphosphatidylcholin 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid Distearoyl phosphatidylcholin Distearoyl phosphatidylethanolamin Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol Distearoyl phosphatidyl glycerol Egg-derived phosphatidylcholin Egg-derived phosphatidylglycerol Cục Quản Lý Thực Phẩm Dược Phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration) N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid Phosphatidylcholin hydrogen hóa Phosphatidylinositolhydrogen hóa Sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance liquid chromatography) Kính hiển vi Kích thước tiểu phân Liposome đơn lớp lớn (Large unilamellar vesicle) Liposome nhiều lớp đồng trục (Multilamellar vesicle) Liposome kép (liposome liposome) (Multivesicular vesicle) Phosphatidyl cholin PDI PEG SPC SUV TCCS Tf Tm USP UTTLT Chỉ số đa phân tán (polydispersity index) Polyethylenglycol Phosphatidyl cholin dầu đậu tương(Soy phospatidyl cholin ) Liposome đơn lớp nhỏ (Small unilamellar vesicle) Tiêu chuẩn sở Nhiệt chảy hoàn toàn Nhiệt chảy lỏng (melting temperature) Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia) Ung thư tiền liệt tuyến ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, thuốc tác dụng đích để điều trị bệnh ung thư lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu thuốc khối u giảm độc tính tế bào lành Một hệ đưa thuốc đích trọng phát triển bào chế đại dạng thuốc liposome Ngoài đặc điểm dạng thuốc hướng đích, liposome có ưu điểm lớn tính tương hợp sinh học cao có cấu tạo phospholipid Trên giới có vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin ứng dụng lâm sàng biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox… với nhiều cải tiến mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng giảm độc tính Tuy nhiên Việt Nam, nghiên cứu liposome chưa nhiều, chưa có chế phẩm đưa vào nhằm phát triển hệ thuốc cho ngành Dược Việt Nam Hiện nay, dạng bào chế liposome trọng phát triển có tiềm lớn cho tương lai Vì nghiên cứu liposome doxorubicin vấn đề cấp thiết Với lý trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế đánh giá tác dụng khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” tiến hành với mục tiêu: Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml quy mô phòng thí nghiệm xây dựng TCCS, đánh giá độ ổn định chế phẩm Đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin khối u chuột thực nghiệm *Những đóng góp luận án: Đã xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin với tá dược: Phosphatydin cholin, cholesterol Liposome bào chế phương pháp hydrat hóa film có kích thước 150 nm; hiệu suất mang thuốc 85% Đã xây dựng qui trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml qui mô phòng thí nghiệm Thuốc tiêm đạt tiêu chuẩn chung thuốc tiêm tĩnh mạch tiêu chuẩn hệ nano mang thuốc Đã xây dựng phương pháp đánh giá hóa lý tác dụng in vivo động vật thực nghiệm hệ nano liposome mang thuốc Phương pháp áp dụng để xây dựng công thức đánh giá hệ liposome mang thuốc khác *Nội dung cấu trúc luận án: Luận án bao gồm 133 trang Đặt vấn đề: trang; chương (tổng quan): 35 trang; chương (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng phương pháp nghiên cứu): 19 trang; chương (kết nghiên cứu): 55 trang; chương (bàn luận): 20 trang; kết luận đề xuất: trang * Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 153 tài liệu: 13 tài liệu tiếng Việt 140 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan luận án cập nhật vấn đề: Về dược chất: Các tính chất hóa lý độ ổn định doxorubicin; tác dụng dược lý, dược động học dạng bào chế lưu hành thị trường doxorubicin Liposome: khái niệm; phân loại liposome theo cấu trúc; phát triển công nghệ liposome nhằm tăng cường khả hướng đích kiểm soát giải phóng dược chất; thành phần cấu tạo liposome; phương pháp bào chế liposome; phương pháp đánh giá liposome Mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro invivo: tổng quan mô hình nghiên cứu nước giới loại tế bào ung thư động vật thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm, cách xử lý số liệu biện giải kết CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Nguyên vật liệu - Nguyên liệu: Doxorubicin hydroclorid (DOX) đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ USP 28 Phosphatydin cholin đậu tương (SPC) cholesterol (CHL) đạt tiêu chuẩn pha tiêm Nguyên liệu, hóa chất khác đạt tiêu chuẩn dược điển tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo mục đích sử dụng) - Thuốc đối chiếu: Dung dịch tiêm doxorubicin “Ebewe” nhà sản xuất Ebewe, Áo; hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin- Lipodox hãng TTYBiopharm, Đài Loan - Động vật thí nghiệm: • Chuột nhắt trắng dòng Swiss, BAL C57/6, giống đực, khỏe mạnh, đủ tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng trung bình 20,0 ± 1,0 g Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp • Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mouse): chuột nhắt đực BALB/c, tế bào lympho T (nude mice, Foxn1 nu), nhập từ Công ty Charlie-River, Hoa Kỳ - Tế bào ung thư: • Dòng tế bào ung thư Sarcoma TG180, phòng thí nghiệm thực nghiệm chuột bạch Bộ môn mô phôi – tế bào, khoa Sinh học, đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp • Tế bào ung thư tiền liệt tuyến (UTTTL) người dòng PC-3 (CRL1435), ATCC, Hoa Kỳ 1.2 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu Các trang thiết bị sử dụng đạt yêu cầu cho nghiên cứu bào chế, kiểm nghiệm đánh giá sinh khả dụng Các thiết bị đặc thù cho bào chế liposome: máy cất quay chân không, máy siêu âm, thiết bị ép qua màng (extruder), thiết bị lọc tiếp tuyến, hệ thống thẩm tích, tủ an toàn sinh học cấp III Các thiết bị cho phân tích đánh giá: thiết bị đo kích thước tiểu phân, kính hiển vi điện tử truyền qua, máy đo quang phổ UV-vis, hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao số thiết bị dụng cụ thông thường khác 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu bào chế 2.3.1.1 Bào chế liposome doxorubicin *Phương pháp bào chế liposome chưa mang dược chất: - Hòa tan phospholipid, cholesterol cloroform bốc dung môi thiết bị cất quay 40 oC 12h để tạo lớp film mỏng thành bình cầu Hydrat hóa lớp film dung dịch đệm citrat 50oC với tốc độ 80 vòng/phút 2h để tạo hỗn dịch liposome - Giảm kích thước liposome tạo siêu âm thiết bị nén nhiều lần qua màng polycarbonat có kích thước giảm dần từ 1000 nm đến 100nm *Đưa DOX vào liposome: - Tạo chênh lệch pH hai bên màng liposome cách điểu chỉnh pH tới 7,4 NaOH cách đổi môi trường đệm citrat thành đệm HEPES pH 7,4 Quá trình đổi đệm tiến hành thiết bị lọc tiếp tuyến thiết bị thẩm tích - Đưa DOX vào liposome: Sử dụng bể điều nhiệt nâng nhiệt độ hỗn dịch liposome tạo chênh lệch pH lên 60 oC, hòa tan DOX vào cho đạt nồng độ yêu cầu Ủ thời gian định để dược chất khuếch tán vào bên liposome Sau để mẫu trở nhiệt độ phòng bảo quản nhiệt độ2-8oC 2.3.1.2 Phương pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin Thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml bào chế tương tự có kết hợp với biện pháp tiệt khuẩn phù hợp công đoạn pha chế điều kiện vô khuẩn 2.3.2 Phương pháp đánh giá đặc tính liposome doxorubicin 2.3.2.1 Đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân (KTTP) phân bố KTTP Hình thức: Đánh giá cảm quan Cấu trúc: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm cắt siêu mỏng Kích thước tiểu phân phân bố kích thước tiểu phân: sử dụng phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị đánh giá kích thước tiểu phân phân bố kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 Sử dụng thông số đường kính trung bình (dnm) hệ số đa phân tán (PDI) để đánh giá 2.3.2.3 Phương pháp định lượng doxorubicin * Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS Nguyên tắc: Phá vỡ cấu trúc liposome dung dịch Triton X100 10% pha loãng tới nồng độ 10 µg/ml đo quang phổ tử ngoại bước sóng 482 nm Với dược chất tự đo bước sóng 234 nm * Phương pháp HPLC Điều kiện: Cột C18, tốc độc dòng 1,3ml/ph, detector UV 254nm; pha động: Hỗn hợp dung môi acetonitril : methanol : nước : acid phosphoric theo tỉ lệ 450: 150 : 400 : Hòa tan 1g natri lauryl sulfat lít hỗn hợp dùng dung dịch NaOH 2M điều chỉnh pH 3,6±0,1 Căn diện tích pic mẫu chuẩn mẫu thử tính toán nồng độ doxorubicin chế phẩm *Định lượng dược chất tự do: Sử dụng phương pháp thẩm tích (Molecular weight cut offMWCO = 12 – 14 kD) để tách riêng dược chất tự khỏi liposome Định lượng doxorubicin môi trường túi thẩm tích phương pháp đo quang phổ HPLC 2.3.2.4 Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa Hiệu suất liposome hóa phần trăm dược chất gắn vào bên liposome Tách doxorubicin tự túi thẩm tích, sau định lượng doxorubicin liposome lại túi, so sánh với lượng doxorubicin ban đầu (toàn phần) để tính hiệu suất liposome hóa 2.3.2.6 Phương pháp đánh giá độ ổn định liposome Bảo quản liposome nhiệt độ 2-8oC Đánh giá tiêu: hình thái, cấu trúc tiểu phân, kích thước phân bố kích thước tiểu phân, hàm lượng doxorubicin 2.3.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin Với thuốc tiêm liposome doxorubicin, đánh giá toàn tiêu giống liposome doxorubicin đánh giá thêm tiêu sau: pH, độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn:Theo DĐVN IV 13 - Liposome sau gắn DOX tiệt khuẩn phương pháp lọc hấp tiệt khuẩn Do cần phải sử dụng nguyên liệu vô khuẩn - DOX hydroclorid có tốc độ hòa tan kém, dễ bị vón cục tiếp xúc với nước tượng dime hóa Quá trình hòa tan DOX thực tế phải rắc từ từ dược chất vào hỗn dịch liposome tan hết để tránh bị vón cục, thời gian hòa tan DOX kéo dài có nguy ảnh hưởng đến độ bền dược chất nhiệt độ Để giải khó khăn này, dược chất đông khô trước nhằm mục đích tăng tốc độ hòa tan kiểm soát độ vô khuẩn cho DOX Công thức đông khô không sử dụng tá dược tạo khung, qua khảo sát, lựa chọn thông số thiết bị theo qui trình sơ đồ hình 3.9 14 Hình 3.9 Sơ đồ bào chế lọ vô khuẩnchứa doxorubicin đông khô Với kết thu được, nghiên cứu đưa qui trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin mg/ml với qui mô 50 lọ /mẻ trình bày hình 3.10 15 Hình 3.10 Sơ đồ tóm tắt qui trình bào chế thuốc tiêm liposome DOX 2mg/ml Chế phẩm sau bào chế có hiệu suất liposome hóa 86,93± 0,4%, kích thước liposome 86,57 ± 1,03 d.nm, PDI= 0,274 ±0,03 Đánh giá thời gian hòa tan ban đầu hiệu suất liposome hóa sau tuần bảo quản 2-8 oC, kết thu sau: Bảng 3.27 Thời gian hòa tan DOX hiệu suất liposome hóa sử dụng dược chất đông khô Thời gian hòa tan DOX (phút) Hiệu suất liposome hóa (%) DOX thô DOX đông khô 10 ± 2 ± 0,5 76,58 ± 0,68 86,65 ± 0,27 3.5.Kết quảđề xuất tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome doxorubicin 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn Dựa kết nghiên cứu khảo sát trên, đề xuất tiêu chuẩn liposome cho thuốc tiêm liposome doxorubicin sau: 3.5.1.1 Tiêu chuẩn liposome chưa mang dược chất Tính chất: Hỗn dịch liposome không màu, đục mờ, đóng lọ thủy tinh có nắp hàn kín.pH: 6,5 – 7,5.Kích thước tiểu phân: Các tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 120 nm, PDI ≤ 0,30 3.5.1.2 Tiêu chuẩn liposome doxorubicin Tính chất:Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, đục mờ, đóng lọ thủy tinh có nắp hàn kín pH: 6,0 – 8,0 Định tính: Phải thể phép thử định tính doxorubicin hydroclorid KTTP: Các tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 150 nm, PDI ≤ 0,30 Định lượng: Dược chất liposome hóa: không 80%; Dược chất toàn 16 phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0- 115,0% lượng doxorubicin hydroclorid so với lượng ghi nhãn 3.5.1.3 Tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml Tính chất: Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, đục mờ, đóng lọ thủy tinh có nắp hàn kín.Thể tích: 10ml + 10 %.pH: 6,0 – 8,0.Định tính: Phải thể phép thử định tính doxorubicin hydroclorid.Kích thước tiểu phân: Các tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 150 nm; PDI ≤ 0,30.Định lượng:Dược chất liposome hóa: không 80%; dược chất toàn phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0115,0% lượng doxorubicin hydroclorid so với lượng ghi nhãn.Độ vô khuẩn: phải vô khuẩn Nội độc tố vi khuẩn: không nhiều 2,2 EU/mg hoạt chất Tiêu chuẩn thẩm định Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương 3.5.2 Đánh giá độ ổn định Trong thời gian theo dõi, mẫu liposome bảo quản điều kiện khác có biến đổi khác Ở nhiệt độ 2-8 oC nhiệt độ phòng, hàm lượng dược chất toàn phần mẫu thay đổi dược chất ổn định nhiệt độ thấp bao phủ phần lớn lớp vỏ phospholipid với pH thấp Ở điều kiện 2-8 oC, biến đổi kích thước tiểu phân không nhiều, điều kiện nhiệt độ phòng, có tượng kết tụ làm tăng kích thước liposome, đồng thời lượng dược chất bị rò rỉ khỏi liposome lớn Vì chế phẩm cần phải khống chế điều kiện bảo quản nghiêm ngặt, dùng biện pháp lão hóa cấp tốc để dự đoán tuổi thọ thuốc Với kết thu được, sơ kết luận thuốc có tuổi thọ 24 tháng 17 3.6 Kết đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin khối u động vật thực nghiệm: Thuốc tiêm liposome doxorubicin (ký hiệu Li-do) đánh giá khối u chuột, so sánh với thuốc đối chiếu Lipodox dung dịch tiêm DOX tự 3.6.1 Đánh giá chuột nhắt mang ung thư Sacoma TG 180 - Với u da: So với nhóm chứng không dùng thuốc, nhóm điều trị có tác dụng nâng cao tỉ lệ sống sót chuột mang u Số chuột sống sót sau 30 ngày nhóm nhận thuốc nghiên cứu tăng gần lần, tương đương với kết thu chuột nhận Lipodox đối chiếu cao có ý nghĩa so với nhóm dùng DOX tự Các nhóm chuột điều trị có thời gian sống cao so với nhóm chứng (p0,05) Trên mô hình gây u da, tác dụng Li-Do nghiên cứu Lipodox chút, song so với nhóm chứng, tác dụng rõ rệt (p0,05) (Hình 3.13, 3.14) 18 Hình 3.13 Khối lượng khối u Hình 3.14 Thể tích khối u da chuột sau 30 ngày da chuột sau 30 ngày - Trên khối u (Hình 3.15, 3.16): Về tiêu khối lượng khối u cơ, nhóm nhận Li-Do nghiên cứu Lipodox có khác biệt rõ ràng so với nhóm chứng (p0.05