TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM ******** Công nghệ sinh học thực vật Đề tài KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẠO RỄ IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA) Giáo viên hướng dẫn: TS Trịnh Ngọc Nam Lớp: DHSH10 Thành phố Hồ Chí Minh, 14 tháng năm 2017 Page TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC-THỰC PHẨM MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT DANH SÁCH NHÓM Stt Họ Và Tên MSSV Nguyễn Đỗ Uyên 14127641 Nguyễn Lê Anh Thương 14061111 Trần Thị Minh Trang 14013101 Nguyễn Thị Thu Thủy 14057121 Page LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập trường Đại học Công nghiệp Tp.HCM, nhóm em xin chân thành cảm ơn trường, khoa tận tình giảng dạy Bài tiểu luận sở để nhóm em vận dụng kiến thức học, từ rút học kinh nghiệm vô giá Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, lần nhóm em xin chân thành cảm ơn thầy Trịnh Ngọc Nam tận tình bảo hướng dẫn nhóm em nhiều để nhóm em hoàn thành tiểu luận Với trình độ, khả hạn chế kinh nghiệm làm tiểu luận chưa nhiều, chắn nhóm có thiếu sót định tiểu luận Nhóm em kính mong nhận bảo thầy Cuối nhóm em xin chúc thầy gia đình có nhiều thành công sức khỏe sống Page LỜI NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN Page MỤC LỤC MỞ ĐẦU Cây Đương quy nhật (Angelica acutiloba (Sieb & Zucc.) Kitagawa) thuốc quí, đầu vị thiếu y học cổ truyền việc điều trị bệnh phụ nữ bồi bổ khí huyết, đồng thời thuốc trị bệnh thuốc chữa thiếu máu, đau đầu, kháng viêm, tăng cường miễn dịch Dược tính Đương quy đến từ phận rễ nơi có chứa nhiều hợp chất thứ cấp, bao gồm 47 hợp chất khác nhau, ligustilide (22,8%) butylidenephthalide (19,5%) hai hợp chất Rễ Đương quy có chứa nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng giúp giảm đau, điều hoà nội tiết, kháng viêm, tăng cường miễn dịch, bồi bổ khí huyết Nhu cầu sử dụng chiết xuất hợp chất thứ cấp từ loại thảo dược (như Nhân sâm, Đương quy) ngày tăng theo thời gian, để thu hoạch rễ Đương quy cần phải từ – năm, nhân công lao động chi phí chăm sóc đồng ruộng làm tăng giá thành sản phẩm lên cao (Fukuda cs, 2009) Cây Đương quy nhật du nhập vào trồng Việt Nam với diện tích mở rộng từ Tây Bắc đến khu vực sông Hồng gần Hà Nội Cây ưa khí hậu ẩm mát, việc gieo hạt sinh trưởng cần trùng với thời gian có nhiệt độ thấp năm Thời gian gieo hạt Việt Nam tốt đầu tháng 10 Việc gieo hạt vào thời điểm muộn (tháng 11 đến tháng 2) dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm giảm đáng kể nhiệt độ giảm mạnh thời điểm Ngoài ra, hạt Đương quy dễ khả nảy mầm khiến việc sử dụng hạt để nhân giống gặp nhiều khó khăn Nhu cầu rễ Đương Quy lớn giới cần tìm phương pháp nhân nhanh hữu hiệu Đương quy mà đảm bảo đồng mặt di truyền Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật từ đời đem đến khả làm tăng hệ số nhân giống thực vật thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy quan hay mô, tế bào thực vật giúp nhà nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp có giá trị y dược với hiệu suất cao sản xuất Page từ tế bào vi sinh vật tổng hợp đường hoá học Với mục đích vậy, để tạo nguồn sản phẩm sạch, tinh khiết nhằm khai thác công dụng chữa bệnh phục vụ cho việc bào chế dược phẩm từ Đương quy, giảm giá thành sản phẩm sau nhóm chúng em giúp thầy bạn hiểu rõ cách nuôi cấy invitro Đương Quy qua báo cáo NỘI DUNG Tổng quát 1.1 1.1.1 Giới thiệu Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) Phân loại Theo Nguyễn Bá (2007), Đương quy Nhật Bản phân loại sau: Giới : Plantae (Thực vật) Ngành : Magnoliophyta (Thực vật có hoa) Lớp : Magnoliopsida (Ngọc lan) Bộ : Apiales (Hoa tán) Họ : Apiaceae (Hoa tán) Chi : Angelica (Bạch chỉ) Tên khoa học: Angelica acutiloba ên tiếng Việt Kitaga : Đương quy Nhật Bản, Đông Đương Quy Tên gọi khác : Yamato Touki (Nhật Bản); Ribendanggui (Trung Quốc) Phân bố : tìm thấy đảo Honshu Shikoku (Nhật Bản) Số lượng nhiễm sắc thể: 2n = 22 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) loài thực vật sống lâu năm, thân thảo lớn, cao 40 – 80 cm, có thân hình trụ, rãnh dọc màu tím, – ngấn, ngấn mọc thành mầm cành con, hình thành cá thể nhiều cành nhánh Thân chia thành thân sinh dưỡng thân hoa Thân sinh dưỡng tồn thời kì sinh trưởng sinh dưỡng Thân ngắn, chưa có phân hoá ngấn thân chưa phân cọng rõ ràng Lá mọc so le, xẻ lông chim lần; cuống dài 10 – 30 cm, có bẹ ngắn, dạng máng ôm lấy thân; chét phân thùy hình mác dài – cm, rộng – cm, phía có cuống ngắn không cuống, thùy lại phân nhỏ, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có to sắc, phía tiêu giảm Rễ có mùi Page hương đặc biệt, rễ năm tuổi thu hoạch vào mùa thu mùa đông đem phơi sấy khô để bảo quản Cây cho hoa hoa nở lần từ tháng – hàng năm, cụm hoa tán kép gồm 25 – 40 tán nhỏ dài ngắn không đều; tổng bao tiểu bao giống nhau, có bắc dạng sợi, hoa nhỏ màu trắng hay lục nhạt, cánh lõm đầu, nhị, bầu hình chóp ngược, có gân lồi, cuống dài Quả bế đôi dẹt, có cạnh gân lồi, gân mép rộng dạng cánh, rìa màu tím nhạt (Đỗ Huy Bích cs, 2004) 1.1.3 Đặc điểm phân bố, sinh thái Chi Angelica phân bố chủ yếu vùng ôn đới Bắc bán cầu New Zealand Việt Nam nhập giống Đương quy Trung Quốc Angelica sinensis (Oliv.) (Diels.) (1960), Đương quy Triều Tiên Angelica uchyamana Yabe (1978) gần Đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba Kit (1996) Giống Đương quy Trung Quốc không còn, hai giống lại trồng tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích cs 2003) Cây Đương quy ưa khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn phần mặt đất tàn lụi, phần củ mặt đất chịu đựng băng tuyết mọc lại vào mùa xuân năm sau Cây Đương quy trồng Việt Nam thường phải lựa chọn thời vụ, cho mùa gieo hạt sinh trưởng trùng với thời gian có nhiệt độ thấp năm (Phạm Văn Ý, 2000) 1.1.4 1.1.4.1 Thành phần hóa học hoạt tính sinh học Thành phần tinh dầu Ở rễ có ligustilide, n – butylphtalide, n – butylidenphtalide, cnidilide, p – cymen Trong Đương quy Nhật Bản trồng Thanh Trì (Hà Nội), tinh dầu có chứa ligustilid, γ – terpinen, mycren, β – ocimen, limonen, caryophylen oxyde Trong Đương quy Nhật Bản trồng Thái Nguyên chứa tinh dầu với thành phần p cymen, γ – terpinen (Fukuda cs, 2009) Tinh dầu Đương quy Nhật Bản có tác dụng ức chế co tử cung, làm giảm căng tử cung, từ hạn chế đau bụng kinh nguyệt Ligustilide rễ có tác dụng chống hen, chống co thắt khí quản (Đỗ Huy Bích cs, 2004) 1.1.4.2 Glucid Chủ yếu glucose, sucrose (40%) có polysaccharide (khoảng 8%) có tác dụng điều tiết hệ miễn dịch Thành phần polysaccharide Đương quy Nhật Bản có độ an toàn cao, không độc, tăng cường khả miễn dịch hạch, Page chống lại phát triển tế bào ung thư, nâng cao số lượng tế bào lympho T (Kumazawa cs, 1982) 1.1.4.3 Các loại acid hữu Các nghiên cứu cho thấy Đương quy Nhật Bản có chứa acid ferulic có hoạt tính chống oxi hoá mạnh, loại hết gốc tự do, điều tiết chế sinh lý thể người, hạn chế tạo dung môi phần gốc tự Mặt khác, acid ferulic hạn chế kết tụ tiểu cầu máu, hạn chế acid amin gốc –OH, hạn chế nguy tổn hại gan đồng thời phòng tránh xơ cứng động mạch (Lê Kim Loan cs,1998; Nguyễn Gia Chấn cs, 1998) 1.1.4.4 Một số thành phần khác Trong Đương quy Nhật Bản chứa 23 nguyên tố vô cơ, có 16 loại cần thiết cho thể người Tuy nhiên, vùng đất trồng khác nhau, hàm lượng nguyên tố vô có khác Ngoài có coumarin umbeliferon, scopoletin, xanthotoxin, isopimpinelin, bergapten; 17 loại acid amin có loại mà thể người không tự tổng hợp được; polyacetylen falcarinol, falcarindiol, falcarinolon hợp chất sterol (Nguyễn Gia Chấn cs,1998) 1.1.5 • • Tính vị công dụng dược lý Tính vị: vị ngọt, đắng, cay, mùi thơm, tính ấm Công dụng dược lý: Cây Đương quy Nhật Bản cung cấp vị thuốc dùng phổ biến y học phương đông vị thuốc đầu vị thuốc chữa bệnh phụ nữ, bồi bổ thể trị bệnh thiếu máu, suy tim, mệt mỏi, đau đầu, lưng, ngực bụng Ngoài ra, Đương quy dùng làm thuốc giảm đau, chống co giật, làm mồ hôi, kích thích ăn ngon Các hợp chất thứ cấp Đương quy Nhật Bản di thực trồng Việt Nam có hoạt tính chức nội tiết sinh dục kiểu oestrogen progesteron yếu Rễ hạt gây tăng trương lực biên độ co bóp tử cung Rễ có tác dụng tăng lực, tăng sức đề kháng với ammoni clorid, chống viêm cấp tính mãn tính; có tác Page dụng gây trấn tĩnh, giảm đau đói, giải nhiệt, chống viêm, làm giảm khả đông máu; điều kinh, nhuận tràng; kích thích miễn dịch, gây hoạt hoá tế bào lymphô T, làm tăng sản sinh kháng thể Cây Đương quy Nhật Bản Nhân sâm, thử nghiệm dạng cao chiết với nước nóng, thể hoạt tính điều hoà miễn dịch Độc tính cấp tính rễ hạt Đương quy thấp rễ có độc tính cấp tính thấp so với hạt (Đỗ Huy Bích cs, 2004) Cách thực 2.1.Vật liệu 2.1.1 Thu mẫu ban đầu Nguồn mẫu ban đầu Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) nuôi cấy in vitro nhân giống từ hạt Trung tâm Nghiên cứu Sức khỏe, Môi trường Đồng ruộng Ban đầu, nuôi cấy invitro hạt giống Đương Quy Nhật Bản hạt nảy mầm Sau hạt Đương quy Nhật Bản nẩy mầm ống nghiệm, nuôi cấy tạo cụm chồi môi trường khoáng MS (Murashige Skoog, 1962) vitamin Morel (Morel Wetmore, 1951), bổ sung 30 g l-1 sucrose, CĐHSTTV mg l-1 BA 0,2 mg l-1 IBA, g/l agar pH môi trường trước khử trùng 5,8 Môi trường khử trùng nhiệt độ 121oC, atm 25 phút Sau đó, chồi tách thành chồi đơn nuôi cấy môi trường có thành phần khoáng MS, vitamin Morel, bổ sung 30 g l-1sucrose, mg l-1 agar (không có CĐHSTTV) tuần Các chồi nuôi cấy điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ 24 + oC cường độ ánh sang 50 µmol m-2 s-1 2.1.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm Nơi tiến hành thí nghiệm: Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Thiết bị - Giàn nuôi cấy gắn bóng đèn (1,4 m x 0,6m) - Bóng đèn huỳnh quang 1,2 m, công suất 40 w (công ty Điện Quang thành phố Hồ Chí Minh) - Nồi hấp Hirayama, model HV – 85 (Hirayama Manufacturing Co., Nhật Bản) Page - Tủ cấy vô trùng, model MV9/91 (ADS Laminaire Co., Pháp) - Máy đo pH hiệu Orion (Orion Research, Inc., Mỹ) - Cân phân tích, model TE1502S (d = 10 mg) TE214S (d = 0,1 mg) (Công ty Satorius, AG Göttingen, Đức) - Tủ sấy Sanyo, model MOV – 212 (Sanyo Electric Co Ltd., Nhật Bản) - Kính hiển vi Nikkon Eclipe 80i (Nikkon Co., Nhật Bản) Dụng cụ - Bình tam giác (V = 350 ml) bình hình trụ (V = 375 ml) dùng cấy chuyền tạo số lượng mẫu cấy ban đầu cho thí nghiệm - Bình thủy tinh (dạng chai nước biển) (V = 130 ml) dùng để nuôi cấy mẫu thí nghiệm - Ống đong dung tích 10 ml, 50 ml, 100 ml 1000 ml (Isolab, Đức) - Đèn cồn, bình cồn cắm kẹp cấy, dao cấy, khăn lau, bình tia 2.1.3 Một số hóa chất dùng thí nghiệm o o - Cồn 96 , 70 - Javel (Công ty Vân Phương, Thành phố Hồ Chí Minh) - Thuốc nhuộm màu đỏ carmin xanh iod - Acid acetic, nước cất - Chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm NAA, IBA, Kinetin, TDZ, BA glucose (Công ty Duchefa Biochemie, Hà Lan) - Sucrose (Công ty Cổ phần Đường Biên Hoà, Đồng Nai), 2.1.4 Giá thể môi trường nuôi cấy - Giá thể: Agar (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh) - Môi trường nuôi cấy: khoáng MS (Murashige and Skoog, 1962), vitamin Morel (Morel Wetmore, 1951), khoáng vitamin Gamborg B5 (Gamborg cs, 1968) (Công ty Duchefa Biochemie, Hà Lan) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến hình thành rễ bất định mẫu cấy phiến cuống Đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro 2.2.1.1 Thí nghiệm 1a: Mẫu cấy phiến 1.Vật liệu Page 10 sinh nhiều sơ khởi rễ nên số lượng rễ hình thành mẫu phiến nhiều so với mẫu cuống Ngược lại với di chuyển auxin, cytokinnin tổng hợp rễ, di chuyển từ mạch mộc đến chồi, lá, phiến đích đến sau cùng, với lượng auxin ngoại sinh tác động phối hợp với cytokinin nội sinh tạo nên tỷ lệ auxin:cytokinin thích hợp cảm ứng hình thành rễ vậy, bổ sung thêm cytokinin ngoại sinh nồng độ không thích hợp gây ức chế hình thành rễ Sự đáp ứng mẫu cấy loại auxin khác nhau, Đương quy Trung Quốc, đáp ứng tạo mô sẹo rễ bất định nhanh nhiều dùng NAA (Yang cs, 1995), điều tương tự kết nuôi cấy Đương quy Nhật Bản thí nghiệm 3.2 Thí nghiệm 2: Sự phát sinh rễ từ mẫu cấy phiến cuống vị trí khác Đương quy Nhật Bản in vitro ảnh hưởng thành phần khoáng vitamin môi trường nuôi cấy 3.2.1 Kết 3.2.1.1 Thí nghiệm 2a: Mẫu cấy phiến Thành phần khoáng vitamin ảnh hưởng rõ rệt lên hình thành mô sẹo rễ bất định mẫu cấy phiến vị trí khác (hình 3.9) Hình 3.8 Ảnh hưởng thành phần khoáng, vitamin lên mẫu cấy phiến vị trí khác đến khả sống hình thành mô sẹo Đương quy Nhật Bản ngày thứ 42 Ghi chú: M B bên trái đại diện cho khoáng MS , vitamin Morel khoáng B5, vitamin B5, số bên phải đại diện cho vị trí thứ 2,  Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu chết khác biệt ngày thứ 42 mặt thống kê nghiệm thức.Tỷ lệ mẫu chết cao mẫu cấy phiến vị trí thứ 4(11,11%).Các phiến vị trí thứ có tỷ lệ chết thấp.Mẫu cấy nghiệm thức B2 (lá vị trí thứ cấy môi trường có thành phần khoáng B5 kết hợp với vitamin B5)không có mẫu chết Tỷ lệ mẫu chết tăng dần vị trí xa chồi cấy loại môi trường (khoáng MS kết hợp với vitamin Morel khoáng B5 kết hợp với vitamin B5(H3.8)  Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Ở ngày thứ 42, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo nghiệm thức khác biệt mặt thống kê Mẫu cấy nghiệm thức có thành phần môi trường khoáng B5 vitamin B5 cho mô sẹo với tỷ lệ cao phiến lá thứ cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo giảm dần vị trí xa chồi (Hình3.8) Bảng 3.3 Ảnh hưởng thành phần khoáng vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, chiều dài rễ/mẫu TLT, TLK rễ mẫu cấy phiến vị trí khác Đương quy Nhật Bản ngày thứ 42 Nghiệm thứcz Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ/mẫu Chiều dài rễ/mẫu (mm) TLT rễ (mg) TLK rễ (mg) M2 73,61 4,25 8,75 3,04 ex 0,87 M3 44,44 4,50 6,25 5,36 de 0,80 M4 55,56 14,33 9,50 16,52 d 4,10 B2 100,00 39,47 23,47 132,74 a 17,65 B3 90,00 36,40 20,67 71,35 c 11,89 B4 88,89 42,53 21,27 103,36 b 14,10 Khoáng - Vitamin (A) ** ** ** ** ** Vị trí (B) * * ns ** ns AxB ns ns ns ** ns 13,25 19,09 13,08 9,12 31,45 ANOVAy CV (%) Ghi z : M B bên trái đại diện cho khoáng MS vitamin Morel khoáng B5 vitamin B5, số bên phải đại diện cho vị trí thứ 2, y ns,*, **: không khác biệt khác biệt có ý nghĩa p ≤ 0,05 0,01 x Các trị số có chữ giống cột khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test Theo quan sát, đa số mẫu cấy xuất rễ ngày thứ 21 thí nghiệm nghiệm thức Mẫu cấy xuất rễ muộn (ngày thứ 28) nghiệm thức phiến cấy môi trường có thành phần khoáng MS kết hợp với vitamin Morel  Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) Tỷ lệ mẫu tạo rễ ngày thứ 42 khác biệt rõ rệt mặt thống kê nghiệm thức Nghiệm thức có tỷ lệ tạo rễ cao (100%) phiến thứ môi trường khoáng B5 kết hợp với vitamin B5 Mẫu cấy nghiệm thức môi trường có thành phần khoáng MS vitamin Morel có tỷ lệ hình thành rễ thấp so với mẫu cấy môi trường có thành phần khoáng B5 vitamin B5 (Bảng 3.3)  Số rễ/mẫu Số rễ/mẫu hình thành ngày thứ 42 khác biệt ý nghĩa mặt thống kê nghiệm thức Mẫu nuôi cấy môi trường có thành phần khoáng B5 vitamin B5 cho số lượng rễ nhiều (>30 rễ/mẫu) so với mẫu cấy môi trường có thành phần khoáng MS kết hợp với vitamin Morel (30 rễ/mẫu) mẫu cấy môi trường có thành phần khoáng MS kết hợp với vitamin Morel (80%) mẫu cấy môi trường có thành phần khoáng MS vitamin Morel cho tỷ lệ mẫu tạo rễ thấp (