Thực tập vi sinh đại cương BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí vi sinh vật tăng trưởng hình thành điều kiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí diện mẫu thị mức độ vệ sinh thực phẩm,đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật,nguy hư hỏng ,thời hạn bảo quản sản phẩm,mức độ vệ sinh trình chế biến bảo quản thực phẩm Sự tăng trưởng vi sinh vật thực phẩm dẫn đến biến đổi chất lượng : 106 tế bào/g(ml) ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=10 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng mặt hóa học.Đặc biệt sữa có 105 tế bào/g(ml) sữa bị chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất thực phẩm có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi cấu trúc 3.Quy trình kiểm tra: Trang Thực tập vi sinh đại cương 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trùng 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trùng Stomacher 10gr thực phẩm 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85% (10-1) Bước 1: đồng mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H 20 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng máy stomacher 30” thu nồng độ 10-1 Trang Thực tập vi sinh đại cương Bước : pha loãng mẫu Chuẩn bị ống nghiệm pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy ml NaCl vô trùng vào ống nghiệm Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ Tiến hành rung lắc ống nghiệm máy rung ống nghiệm votex, thu nồng độ 10-2 Làm tương tự với nồng độ Lưu ý pha loãng mẫu: -Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm… -Tiến hành thao tác bên lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng micropipet 1ml/ nồng độ pha loãng mẫu để tránh tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu Nuôi cấy nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít đĩa/nồng độ Chuẩn bị môi trường tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào đĩa chứa 1ml dịch mẫu Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn dịch mẫu với môi trường để thu khuẩn lạc tách rời.Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong tủ ổn nhiệt Memmert Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A N.A Trang Thực tập vi sinh đại cương Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A Sabouraund Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc 72h/30-370C Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa) Kết thí nghiệm Nồng độ Số khuẩn lạc 10-1 Đĩa Đĩa 48 10-2 Đĩa Đĩa 130 113 125 10-3 Đĩa Đĩa 105 Bước 5: tính kết theo công thức n = c/(n1+0.1n2)*d n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml)) c : tổng số khuẩn lạc đếm n1 : số đĩa đếm nồng độ thư n2 : số đĩa đếm nồng độ thư hai d : nồng độ pha loãng thứ đếm   120).100 =>n==2104521000 (113  125  105 (2  0,1.2) cfu/g(ml) 4.Môi trường sử dụng 4.1.Môi trường Nutrient Agar Peptone :5.0g Meat extract :3.0g Agar :12.0g Nước cất :1000ml pH sau trùng : 7.00.2 Hấp trùng 1210C/15 phút Trang 120 Thực tập vi sinh đại cương 4.2.Môi trường Plate Count agar Peptone :5.0g Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g Agar :14.0g Nước cất vừa đủ :1000ml 7.00.2 pH sau trùng : Hấp trùng 1210C/15 phút 4.3.Môi trường Sabouraund Peptone :20g Glucose :40g Agar :20g Nước :1000ml Hấp trùng 1210C/15 phút BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM 1.Những kiến thức chung COLIFORM Coliform nhóm trực khuẩn gram- , không bào tử , hiếu khí hoă ăc kị khí tùy ý, có khả lên men đường lactose, sinh 37oC /24 – 48h Coliform Feacal coliform (coliform phân) nhóm vi sinh vâ tă dùng để thị khả có hiê ăn diê ăn vi sinh vâ ăt gây bê ănh thực phẩm Nhóm coliform gồm vi sinh vâ ăt hiếu khí kị khí tùy ý, gram - , không bào tử , hình que, lên men đường lactose sinh môi trường lỏng, dựa vào nhiê ăt dô ă tăng trưởng, nhóm chia thành nhóm nhỏ coliform coliform phân có nguồn gốc từ phân loài đô ăng vâ ăt Trên thực tế kiểm nghiê ăm coliform phân quan tâm nhiều coliform Coliform phân có nguồn gốc từ ruô ăt người đô ăng vâ ăt máu nóng bao gồm giống escherichia, kebsiella, enterobater Khi coliform Trang Thực tập vi sinh đại cương phân hiê ăn diê ăn mô ăt số lượng lớn mẫu mẫu có khả chứa vi sinh vâ ăt gây bê ănh hiê ăn diê ăn phân Chỉ tiêu tổng coliform không thích hợp để làm tiêu thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước phân Tuy nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform sai lệch có số vi sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) phát triển nhiệt độ 44 oC Do số lượng E coli coi tiêu thích hợp cho việc quản lý nguồn nước Trong thành viên nhóm coliform phân E.coli loài quan tâm nhiều vê ă sinh an toàn thực phẩm Loài vi sinh vâ ăt phân bố nơi, có ruô ăt người đô ăng vâ ăt máu nóng *mô ôt số hình ảnh coliform: Fecal Coliform 375 x 294 ﾧ Chromocult® Coliform Agar ES Trang Thực tập vi sinh đại cương 297 x 300 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tiêu Coliform xem nhóm vi sinh vâ ăt thị Số lượng hiê ăn diê ăn chúng thực phẩm, nước dùng để thị cho khả hiê ăn diê ăn vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác Số lượng coliforms cao khả hiê ăn diê ăn vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác cao Colifrorm chịu nhiê ăt( coliform phân):  Là thành phần ă vi sinh vâ ăt đường ruô ăt người đô ăng vâ ăt máu nóng  Được xem vi sinh vâ ăt thị mức đô ă vê ă sinh trình chế biến, bảo quản , vâ ăn chuyển thực phẩm, nước uống cũng thị ô nhiễm phân môi trường  Lên men đường lactose môi trường E.C 44.5oC  Có khả sinh indol 24h/44.5oC  Kết sinh hóa nghiê ăm pháp imvic + + - - 3.Quy trình kiểm tra Phương pháp MPN : Nguyên tắc: Mẫu pha loãng thành mô ăt dãy thâ ăp phân , nồng đô ă khác 10 lần Mẫu ủ môi trường thích hợp có ống durham Mỗi nồng đô ă pha loãng lă ăp lại ống Theo dõi sinh ống nghiê ăm Xác định ống dương tính nồng đô ă pha loãng dựa vào bảng MPN để suy số lượng nhóm vi sinh vâ ăt tương ứng hiê ăn diê ăn 1g hoă ăc 1ml mẫu ban đầu Trang Thực tập vi sinh đại cương Sơ đồ quy trình kiểm tra : 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-2)+ 9ml nước vô trùng nước vô trùng Stomacher 10gr thực phẩm 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85%( 10-1 ) hình 1.1 Bước 1: 10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoă ăc nước vô trùng, stomacher thu nồng đô ă 10-1 mục đích đồng để phân bố vi sinh vâ ăt Bước 2: Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vâ ăt có mẫu ban dầu Lấy 1ml mẫu nồng đô ă 10-1 cho vào ống nghiê ăm thứ nhất, sau cho 9ml nước vô trùng Ta ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-2 Sau lấy 1ml mẫu nồng 10-2 cho vào ống nghiê ăm thứ hai + 9ml nước vô trùng thu ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-3 tương tự ta thu ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-4, 10-5… Trang Thực tập vi sinh đại cương Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu môi trường Laury Tryptose (LT) nồng đô ă liên tiếp(10-1,10-2,10-3) sau : Mỗi nồng đô ă lấy ống nghiê ăm Cho vào ống nghiệm ống durham, cho môi trường LT vào ống nghiê ăm cho ngâ ăp ống durham Ghi nồng đô ă liên tiếp bên ống nghiê ăm(mỗi nồng đô ă ống nghiê ăm) Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu nồng đô ă 10-1 vào ống nghiê ăm có ghi nồng đô ă 10-1(chứa môi trường LT),tương tự cho ống nghiê ăm nồng đô ă (hình 1.1) ủ 37oC/24h Những lưu ý tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): -Tiến hành gần lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn - Nhớ lắc mẫu trước tiến hành nuôi cấy vi khuẩn môi trường Laury Trytose - Không lắc ống có ống durham Bước 4: Đọc kết ống Laury Tryptose Có trường hợp xảy ra: + ống durham không thay đổi + ống durham lên + ống durham sinh Đọc kết ống LT dương tính, sau cấy chuyền ống LT dương tính vào ống môi trường BGBL 2% cách lấy que cấy vòng nhúng vào môi trường LT dương tính trên,rồi cho vào ống có môi trường BGBL Ghi nồng đô ă sản phẩm Ủ 37oC /24h Ống LT + : môi trường đục ống durham ( ống chuông) hoă ăc có bọt khí ống chuông (thể tích bọt khí ống chuông =1/10 thể tích ống chuông) Trang Thực tập vi sinh đại cương Ống LT - : hiê ăn tượng xảy Bước 5: Đọc kết ống BGBL dương tính Lâ ăp tỷ lê ă ống BGBL dương tính nồng đô ă liên tiếp Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng + ống BGBL dương tính: môi trường đục ống durham ( ống chuông) hoă ăc có bọt khí ống chuông( thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống chuông) + ống BGBL âm tính: hiê ăn tượng xảy Bước 6: Tính kết quả: Tổng số coliform (cfu/g hoă ăccfu/ml)= số MPN 10n n số nguyên dương nồng đô ă pha loãng nuôi cấy Bước 7: Từ kết tính được, so sánh với tiêu chuẩn an toàn vê ă sinh thực phẩm Môi trường sử dụng: Môi trường BGBL 2% : môi trường dùng để phát hiê ăn đếm coliforms, coliforms phân, E.coli sữa, thực phẩm, nước Nguyên tắc: Mâ ăt bò ( bile) brilliant green ức chế hầu hết vi khuẩn gram + vi khuẩn gram – coliform Brilliant green có nồng đô ă đă ăc hiê ău nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trưởng 44 0C , Tránh hiê ăn tượng dương giả, lúc coliform phát triển làm đục môi trường sinh khí ống durham lên men lactose 5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiê ăm ,nồi autoclave, tủ sấy, ống durham , micropipet, mẫu tương ớt Trang 10 Thực tập vi sinh đại cương 10-2 10-3 10-4 Môi trường Laury Trytose( LT) Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ tủ ấm Ủ 37 oC 24h Sau khoảng thời gian lấy đĩa ủ đếm khuẩn lạc, tính kết Những lưu ý tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): - Tiến hành gần lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn - Nhớ lắc mẫu trước tiến hành nuôi cấy vi khuẩn môi trường Laury Trytose - Không lắc ống có ống durham Bước : Đọc kết ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền ống LT(+) vào ống môi trường E.C Ủ 44ºC/24h E.coli phát triển 44ºC,ở nhiệt độ số vi khuẩn khác bị hạn chế khả sinh trưởng Hơn môi trường E.C muối mật ức chế cá vi khuẩn Gr + vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Ống LT + : môi trường đục ống durham ( ống chuông) hoă ăc có bọt khí ống chuông (thể tích bọt khí ống chuông =1/10 thể tích ống chuông) Trang 19 Thực tập vi sinh đại cương Ống LT - : hiê ăn tượng xảy Từ ống E.C (+), cấy phân lập môi trường endo agar E.M.B agar Ủ 37ºC/24h Những lưu ý tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar E.M.B agar:  Tiến hành gần lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn  Nhớ lắc mẫu trước tiến hành phân lập vi khuẩn môi trường endo agar E.M.B agar Sau khoảng thời gian lấy đem nhận diện khuẩn lạc điển hình: - Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại - Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh kim Bước : Từ khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A Ủ 37ºC/24h Buớc : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn cấy bước I : indol M :methyl red V : V.P C : simon citrat Phản ứng sinh hóa kiểm tra có mặt trực khuẩn đường ruột Gr– có khả sử dụng simon citrat Kết : + + - - : E.coli type I - + - - : E.coli type II BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Trang 20 Thực tập vi sinh đại cương Đặc điểm Stapylococcus aureus: 1.1 lịch sử: Staphylococcus Ogston phát năm 1881 vết thương có mủ.Năm 1884, Rosenbach tiếp tục nghiên cứu 1.2 Phân bố:  Được phân bố rộng rãi, có nhiều sản phẩm động vật thịt, sữa…  Ở người thường có da, tóc, khoang mũi  Bị lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm bệnh  Được xếp vào nhóm vi khuẩn hội(opportunist type) có mặt rộng rãi thường xuyên mô chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập 1.3 Hình dạng tế bào: Là vk gram+, hình cầu không bào tử, hiếu khí kỵ khí tuỳ ý Trong vết thương máu thường thấy hình dạng giống chùm nho 1.4 Đặc điểm điều kiện sinh trưởng: Phát triển tốt môi trường tổng hợp, đặc biệt phát triển tốt môi trường thạch máu huyết Nhiệt độ tối thích 37oC , pHop=7.2 Trên môi trường thạch ,khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ Ở môi trường lỏng, tế bào dạng cặn, vòng nhẫn mờ ống nghiệm bề mặt môi trường 1.5 Đặc điểm sinh hoá:  Lên men đường glucose, lactose, maltose, saccharose, glycerol, manitol  Không lên men salicin, raffinose,inulin  Có khả chịu mặn cao Trang 21 Thực tập vi sinh đại cương  Làm đông tụ sữa  Sinh beta hemolysis môi trường thạch máu  Phản ứng indol-,NH3-, thuỷ phân gelantine, đông huyết tương 1.6 Khả gây bệnh: Gây ngộ độc thực phẩm: Bệnh gây vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm bị ngộ độc Không cần có diện vi khuẩn sống thực phẩm mà cần có độc tố chúng Loại thường có tính chất cục bộ, có khả truyền nhiễm Khi xét nghiệm phân người bệnh bị ngộ độc thực phẩm không thấy có vsv gây bệnh Sinh ngoại độc tố(vi khuẩn tiết độc tố vào thực phẩm, người ăn thực phẩm bị ngộ độc) Bản chất ngoại độc tố protein nên chúng chịu nhiệt (trừ độc tố Staphylococcus aureus) kích thích thể sinh kháng thể đặc hiệu(tính kháng nguyên mạnh) phát phản ứng kháng nguyên – kháng thể Độc tố gây viêm dày, viêm ruột Type A D gây ngộ độc thực phẩm cho người Triệu chứng bệnh: Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 30’- 6h (phụ thuộc vào cá thể người bệnh) từ lúc ăn người bị ngộ độc có triệu chứng đau thắt bụng, tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ – 8h, kiệt sức mức nghiêm trọng, đau đầu toát mồ hôi, bủn rủn tay chân.Sự phục hồi xảy sau 24 – 72 h, nạn nhân không chết đau đớn phản ứng dội Ít thấy vi khuẩn phân người bị ngộ độc Trang 22 Thực tập vi sinh đại cương Là độc tố bền nhiệt, biện pháp nấu nướng không làm bất hoạt độc tố 100oC/30’; 137oC/9’độc tố hoạt lực Các loại thực phẩm có chứa nhiều muối Jambon, kem tổng hợp, nước súp (ít sử lý nhiệt độ >40oC) loại thuỷ sản, thực phẩm đóng hộp thường hay nhiễm loại vsv Con đường lây nhiễm chủ yếu thông qua tiếp xúc từ nhà bếp, trình chế biến Biện pháp phòng ngừa:  Kiểm tra sức khoẻ công nhân  Không lấy sữa từ động vật bị viêm vú  Trử lạnh thực phẩm < 8oC, ngăn ngừa khả sinh độc tố  Hạ pH thực phẩm để ức chế vi khuẩn phát triển  toC = 60oC/ 0.5h phá huỷ tế bào, số bị phân huỷ to= 80 oC / 0.5h  Hoá chất: fenol 1%, fenol 2%/15’, hgcl 0.5%/1h, formaldehyt 10%/10’, gentiant violet1:25.000/5 – 10’, xử lý nhiễm vết thương da người động vật Staphylococcus gây dùng dung dịch gentiant violet 2% Một số hình ảnh Staphylococcus aureus ﾧﾧ Ý nghĩa việc kiểm tra vi khuẩn: Trang 23 Thực tập vi sinh đại cương Sự diện với mật độ cao Sta Aureus thực phẩm thị điều kiện vệ sinh kiểm soát nhiệt độ trình chế biến Quy trình kiểm tra: 3.1 Quy trình kiểm tra định tính Bước 1: đồng mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml nước vô trùng stomacher Bước 2: tăng sinh: hút 1ml dịch đồng đưa vào môi trường MSB có màu đỏ Ủ 37oC/ 24h Sau đọc kết quả: -Ống tăng sinh âm:có môi trường MSB giữ màu đỏ -Ống tăng sinh dương: Có môi trường MSB chuyển từ đỏ sang vàng Bước 3: từ ống tăng sinh dương, cấy phân lập lên môi trường baird parker agar (hoặc MSA) Ủ 37oC/24h Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình  Trong môi trường Baird Parker: Sta Aureus có đặc điểm tròn, lồi, có tâm đen, bóng vun có vòng sáng quanh khuẩn lạc  Trong môi trường MSA : môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, vi khuẩn tròn, bóng Bước 5: Từ khuẩn lạc điển hình làm phản ứng pastorex, staphylatex, đọc kết Bước 6: Kết luận 3.2 Quy trình kiểm tra định lượng Bước 1: đồng mẫu: lấy 10ml thực phẩm (nước Sâm ) cho vào 90 ml nước vô trùng stomacher Bước 2:pha loãng mẫu tới nồng độ thích hợp Bước 3:nuôi cấy 0.1 ml dịch mẫu /đĩa đĩa/ nồng độ, tiến hành thao tác que cấy trang Nuôi cấy dịch mẫu môi trường baird parker Ủ 37oC/ 48h Trang 24 Thực tập vi sinh đại cương Bước 4: nhận diện khuẩn lạc điển hình Đánh dấu khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc không điển hình cấy chúng từ môi trường BPA sang môi trường TSA.Ủ 37oC/ 24h Bước 5: cấy chuyển VK sang ống nghiệm có chứa 0.3 ml huyết tương thỏ Ủ 37oC Theo dõi kết phản ứng đông huyết tương sau 1,3,6,24h -Phản ứng dương tính :có khối đông hình thành -Phản ứng âm tính: khối đông hình thành, dịch mẩu giống ban đầu Bước 6: tính kết Số lượng Staphylococci coagulase dương tính: cs=(f1*nt*ht)+(f2*na*ha) cs:số lượng Staphylococci coagulase dương tính f: nồng độ pha loãng mẫu nt:tổng số khuẩn lạc điển hình đĩa na:tổng số khuẩn lạc không điển hình đĩa ht=số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm cho kết +/ số khuẩn lạc điển hình thử nghiệm ha=số khuẩn lạc không điển hình thử nghiệm cho kết +/ khuẩn lạc điển hình thử nghiệm Chú ý : số khuẩn lạc nằm khoảng 20 – 200, đếm số khuẩn lạc điển hình không điển hình, sau tính kết công thức ghi rõ biểu mẫu 3.3 phản ứng sinh hoá Saulatex Dùng để định danh giống loài Sta.aureus Quy trình: Bước 1:lấy dd muối vào tiêu Trang 25 Thực tập vi sinh đại cương Bước 2: lấy Sta.aureus vào giọt nước muối tiêu , trộn nhuyễn Bước 3: lấy giọt saulatex vào bên cạnh giọt nước muối Bước 4: kéo giọt nước lại trộn với Bước 5: Đọc kết quả: - phản ứng dương tính:có màu trắng sữa,lợn cợn hạt nhỏ -phản ứng âm tính:màu trắng sữa ban đầu Mở Rộng : 4.1 môi trường sử dụng: Môi trường Chapman agar(manitol salt agar): Là môi trường chọn lọc dùng để phát hiện, phân lập định lượng tụ cầu khuẩn gây bệnh tronh thực phẩm sữa, thịt , hải sản…cũng sinh phẩm khác Các thí nghiệm koch cho thấy tụ cầu khuẩn chịu nồng độ muối cao 7.5% Sau Chapman xác minh tượng trên, đồng thời ghi nhận tụ cầu khuẩn gây đông tụ huyết tương thỏ hình thành khuẩn lạc vàng môi trường chapman agar, môi trường có khả ức chế hầu hết vi khuẩn khác Nồng độ muối cao ức chế sinh trưởng hầu hết loài vi khuẩn trừ Staphylococcus Vi khuẩn lên men đường manitol sinh axit làm đổi màu thị (fenol red)của môi trường từ đỏ sang vàng Xác định tất loại khuẩn lạc có màu vàng màu trắng vói môi trường xung quanh có màu vàng Tuy nhiên, có thề lẫn khuẩn lạc giống Bacillus nên cần xác định khuẩn lạc cách quan sát kính hiển vi Tụ cầu khuẩn gây bệnh tạo khuẩn lạc có sắc tố vàng, đồng thời môi trường xung quanh đổi từ đỏ sang vàng Trang 26 Thực tập vi sinh đại cương tụ cầu khuẩn gây bệnh thường tạo khuẩn lạc nhỏ có màu đỏ không làm thay đổi màu môi trường Sau 48h nuôi cấy, vài chuẩn cầu khuẩn đường ruột Baciilus, Micrococcus Serratia cũng mọc môi trường Môi trường Baird parker agar Là môi trường dùng để phân lập định lượng vi khuẩn Staphylococcus thực phẩm, dược phẩm Công thức môi trường baird parker khai triển năm 1962 nhằm định lượng Staphylocoagulase Năm 1964, Smith Baird Parker chứng minh bổ sung sulfamerthzine vào môi trường ức chế sinh trưởng vi khuẩn proteus Năm 1971, Tardio Baer quan sát 18 môi trường phân lập chọn lọc thử nghiệm môi trường B.P gây ức chế môi trường khác Thành phần môi trường có lithium chloride tellurite có tác dụng ức chế quần thể vi khuẩn thường diện Staphylococci pyruvate glycine kích thích phát triển Staphylococci Khuẩn lạc Staphylococci có hai đặc điểm:Khuẩn lạc có màu đen khử telurite thành telurium, dạng lồi tạo vòng xung quanh khuẩn lạc,đường kính từ – mm thủy phân protein Sau xuất vòng đục vòng (có tác động lecithinase, loại lipase) Đây đặc tính thường thấy có tính chuyên biệt tụ cầu khuẩn gây bệnh Đặc tính Staphylococcus aureus kiểm chứng qua phản ứng coagulase tốt thử nghiệm desoxyribonuclease phosphatase Các loại vsv ngoại lệ khác mọc môi trường như: Staphylococcus epidermis, Bacillus, Micrococci, nấm men Trang 27 Thực tập vi sinh đại cương nhỏ, màu nâu tới đen màu nâu sậm đục, mọc sau 48h trắng Micrococci Bacillus sp nấm men Pastorex: Là thử nghiệm dùng để định danh S.aureus thực trực tiếp với vi khuẩn môi trường nuôi cấy Bằng phản ứng ngưng kết latex kính (latex mẫn cảm với huyết tương người), thử nghiệm cho phép phát đồng thời yếu tố: yếu tố cụm “clumping factor” (một chất có bề mặt tế bào vi khuẩn có lực cao với fibrinogen) protein A Kết nghiên cứu với pastorex với 228 chủng Staphylococci cho thấy:độ nhạy cảm 97.5%, độ đặc hiệu 92.5% BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS 1.Giới thiệu chung 1.1.Lịch sử Vibrio cholera : năm 1883,Robert Kock với vai trò trưởng nhóm nghiên cứu bệnh dịch tả phát vi khuẩn phân bệnh nhân vụ đại dich tả lần thứ vùng Alexandria,Ai cập V.parahaemolyticus Fujino phát lần vào mùa hè năm 1951 vùng ven biển Nhật Bản sau vụ ngộ độc ăn cá ,hào… Người ta xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio,trong có loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm : V.cholera,V.parahaemolyticus ,V.vulnificus,V.alginolyticus 1.2.Đặc điểm phân bố Trang 28 Thực tập vi sinh đại cương V.cholera phân bố rộng khắp với số lượng lớn lan tới chân Mỹ,gây bệnh dịch tả cho số vùng châu Á,Ấn Độ Đông Nam Á.Chúng gây đại dịch lây truyền qua tiếp xúc, nước ,sữa,thực phẩm côn trùng V.parahaemolyticus vi sinh vật biển,tồn tự nhiên nước biển,thường gặp loại hải sản loại nhuyễn thể giáp sát nước biển Trừ V.cholera tồn nước ngọt,còn tất loại Vibrio khác cần muối để tăng trưởng thường xuyên phân lập vùng nước ven biển 1.3.Đặc điểm hình thái Là vi khuẩn Gram -,hình que hai đầu không tạo thành hình dấu phẩy,không sinh bào tử,di động nhờ lông roi 1.4.Đặc điểm sinh trưởng phát triển T0op=370C , pHop=8.6 ,sống kị khí tùy ý, có khả phát triển tốt môi trường kiềm V.cholera bị tiêu diệt nhiệt độ t0=560C 30’, điều kiện khô hạn,ánh sáng chất diệt khuẩn 1.5.Cấu trúc kháng nguyên độc tố V.cholera sinh độc tố ruột nội độc tố đường tiêu hóa,kích thích nghiêm trọng màng nhày tạo dịch dày,gây tiêu chảy nặng ,mất nước,choáng,thậm chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50%.Biện pháp điều trị tốt bổ sung nước chất điện giải thay Phần lớn đợt dịch bệnh V.parahaemolyticus gây thường vào mùa hè,khi nước thủy vực ấm lên.Các triệu chứng tiêu chảy,nôn mửa,hơi ớn lạnh,đau đầu xuất sau 12 h sau ăn lượmg lớn vi sinh vật sống (105 tế bào/g).Cá triệu chứng tương tự triệu chứng Salmonella gây trầm trọng hơn.Salmonella tác dụng lên vùng bụng V.parahaemolyticus tác dụng lên dày người bệnh Trang 29 Thực tập vi sinh đại cương 2.Quy trình kiểm tra Bước 1: Tăng sinh 25 g thực phẩm ( mắm tôm) + 225ml peptone kiềm, stomacher Ủ 370C/24h Rất khó phát Vibrio mẫu,vì ta sử dụng lượng mẫu lớn 25g.Và cũng khó phát nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng cách tăng sinh môi trường pepton kiềm Bước : Phân lập từ phần váng dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar.Ủ370C/24h Bước : nhận diện khuẩn lạc điển hình Vi sinh vật Vibrio cholera Đặc điểm Vàng,chuyển màu môi trường từ xanh sang Vibrio parahaemolyticus vàng,dẹp,2-3mm Không màu,tâm xanh đậm màu Vibrio alginolyticus Vibrio fluvialis,V.vulnificus Pseudomonas,Aeromonas Các loại vk đường ruột khác môi trường,3-4mm Khuẩn lạc vàng lớn Khuẩn lạc vàng lớn Khuẩn lạc xanh dương Khuẩn lạc nhỏ ,trong suốt Bước 4: từ khuẩn lạc nghi ngờ,cấy chuyền sang môi trường N.A Ủ 37 C / 24h Bước : lấy vi khuẩn môi trường N.A làm khánhg huyết Vibrio ,đọc kết phản ứng ngưng kết làm BIS 14 GNE, ủ đọc kêt -Huyết tương thỏ bị đông lại sau 30 phút cấy vi khuẩn vào.Trên vách tế bào bi khuẩn có chứa protein A enzyme Trang 30 Thực tập vi sinh đại cương - BIS 14 GNE gồm 14 phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Gr - ,có 10 giếng (giếng có phản ứng phản ứng sinh H 2S phản ứg Indol) phản ứng bên ngoài.Trong MOB kiểm tra khả di động vi khuẩn MOB- MOB+(mọc lan nhòe đường cấy) 3.Môi trường sử dụng Môi trường TCBS agar môi trường chọn lọc để phân lập Vibrio cholera loài Vibrio gây bệnh đường ruột khác ( đặc biệt Vibrio parahaemolyticus) mẫu bệnh phẩm hoạc mẫu thực phẩm ,hải sản Trang 31 Thực tập vi sinh đại cương Nồng độ cao chất thiosulfate sodium citrate với tính kiềm ức chế tương đối phát triển vi khuẩn đường ruột Mật bò muối mật làm chậm sinh trưởng cầu khuẩn đường ruột ức chế phát triển vi khuẩn Gram + Sự acid hóa môi trường Vibrio lên men saccharose làm thay đổi màu thị bromothymol blue sang vàng Hydrogen sulfide sinh sư diện thiosulfate ferric citrate,tất loài Vibrio không sinh H2S Các vi khuẩn khác cũng mọc TCBS agar : E.coli ,Salmonella typhy, Klebsiella,Shingella…nhưng khuẩn lạc màu vàng MỤC LỤC Trang BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí 3.Quy trình kiểm tra 4.Môi trường sử dụng BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM 1.Những kiến thức chung COLIFORM 2.Ý nghĩa việc kiểm tra tiêu 3.Quy trình kiểm tra Môi trường sử dụng 10 5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm 11 Trang 32 Thực tập vi sinh đại cương 6.Kết thí nghiệm 11 BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI 12 1.Mục đích thí nghiệm 12 Nguyên tắc 12 3.Dụng cụ hóa chất 12 4.Tiến hành thí nghiệm 13 BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 18 Đặc điểm Stapylococcus aureus 18 Ý nghĩa việc kiểm tra vi khuẩn 21 Quy trình kiểm tra 21 Mở Rộng 24 BÀI 5: KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERA,VIBRIO 26 PARAHAEMOLYTICUS 1.Giới thiệu chung 26 2.Quy trình kiểm tra 27 3.Môi trường sử dụng 29 Trang 33 ... micropipet, mẫu tương ớt Trang 10 Thực tập vi sinh đại cương 6.Kết quả thí nghiệm _ _ _ 10-1 Trang 11 Thực tập vi sinh đại cương + + _ 10-2 Trang 12 Thực tập vi sinh đại cương _ _ _ 10-3 Tỷ lê ă BGBL... Thực tập vi sinh đại cương 297 x 300 2.Ý nghĩa vi c kiểm tra tiêu Coliform xem nhóm vi sinh vâ ăt thị Số lượng hiê ăn diê ăn chúng thực phẩm, nước dùng để thị cho khả hiê ăn diê ăn vi sinh vâ... vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác cao Colifrorm chịu nhiê ăt( coliform phân):  Là thành phần ă vi sinh vâ ăt đường ruô ăt người đô ăng vâ ăt máu nóng  Được xem vi sinh vâ ăt thị mức đô ă vê ă sinh