Header Page of 145 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG HUỲNH NGỌC BÍCH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA AXIT HYDROXYCITRIC VÀ CÁC MUỐI HYDROXYCITRAT Chuyên ngành : Hóa hữu Mã số : 60.44.27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng – Năm 2014 Footer Page of 145 Header Page of 145 Công trình hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 1: TS HUỲNH THỊ KIM CÚC Phản biện 2: TS NGUYỄN ĐÌNH ANH Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 29 tháng 06 năm 2014 * Có thể tìm hiểu luận văn tại:  Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng  Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Footer Page of 145 Header Page of 145 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày 19/5/2014, phát biểu phiên họp lần thứ 67 Đại hội đồng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) diễn Geneva, Thụy Sỹ, Tổng giám đốc Tổ chức Y tế giới (WHO) Margaret Chan bày tỏ quan ngại sâu sắc tình trạng gia tăng bệnh béo phì trẻ em giới, đặc biệt nƣớc phát triển Bà Margaret Chan cảnh báo bệnh vấn nạn toàn cầu với chi phí chữa trị cao Béo phì cửa ngõ số bệnh mãn tính không lây nhƣ tiểu đƣờng, tim mạch, tăng huyết áp, xơ vữa động mạch,… gây nhiều hậu nghiêm trọng Đây không bi kịch ngƣời bệnh mà ảnh hƣởng xấu tới kinh tế đất nƣớc, khoản chi phí khổng lồ ngành y tế Do vậy, nghiên cứu bứa, việc chiết tách, xác định thành phần hóa học hợp chất hữu cơ, cấu tử có khối lƣợng nhỏ, phức tạp đƣợc chiết từ nhiều loài bứa (Garcinia Cowa, Garcinia Cambogia, Garcinia india, Garcinia antroViridis) có axit (-)-hydroxycitric (HCA; 1,2-đihydroxy propan-1,2,3tricacboxylic axit) lacton axit hydroxy citric có hoạt tính sinh học lý thú gây ý nhà hóa sinh, bác sĩ chuyên khoa sức khỏe Đó khả điều chỉnh trình tổng hợp axit béo, hình thành lipit, ngon miệng giảm cân Đồng phân (-)-HCA có vai trò quan trọng việc bảo vệ tim mạch, hiệu chỉnh trạng thái bất bình thƣờng lipit khả chịu đựng luyện tập thể thao Trong vài nghiên cứu cho thấy, HCA làm giảm thèm ăn Footer Page of 145 Header Page of 145 cách tăng lƣợng serotonin thể Serotonin chất dẫn truyền thần kinh có vai trò kiểm soát ngon miệng Ngoài ra, HCA ngăn ngừa viêm loét dày cách giảm lƣợng tiết dịch axit dày tăng khả chống lại tổn hại đến niêm mạc dày Tuy nhiên, nghiên cứu chiết tách nguồn HCA phần lớn thực loài bứa Ấn Độ Vì vậy, khám phá axit hữu bứa Việt Nam cần thiết HCA dạng tự có hoạt tính sinh học nhƣng không bền, dễ hút ẩm tự nhiên, điều gây khó khăn việc sấy khô mẫu nhƣ bảo quản (-)-HCA Vì vậy, cần phải tạo HCA dạng dẫn xuất, bền có hoạt tính sinh học nhƣ muối kali hydroxycitrat, muối canxi hydroxycitrat muối magie hydroxycitrat Hiện nay, nghiên cứu chiết tách dịch chiết từ vỏ, thân bứa khô đƣợc thực Việt Nam, nhằm xác định hàm lƣợng axit hydroxycitric, axit citric có vỏ, thân bứa khô; khả tạo muối axit hydroxycitric Tuy nhiên, axit hydroxycitric dịch chiết có hàm lƣợng chƣa cao Vậy vấn đề đặt làm để nâng cao hàm lƣợng axit hydroxycitric dịch chiết, từ nâng cao hiệu suất tạo muối hydroxycitrat làm tăng hoạt tính sinh học muối hydroxycitrat Xuất phát từ vấn đề trên, chọn đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc axit hydroxycitric muối hydroxycitrat ” Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập để thu nhận đƣợc hợp chất HCA muối HCA; - Đánh giá, kiểm tra hàm lƣợng cấu trúc sản phẩm Footer Page of 145 Header Page of 145 phân lập Đối tƣợng nghiên cứu Vỏ bứa (Garcinia oblongifolia Champ ex Benth, thuộc họ Măng cụt – Clusiaceae) thu hái xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu lý thuyết Phƣơng pháp thực nghiệm Ý nghĩa đề tài Ý nghĩa khoa học Ý nghĩa thực tiễn Bố cục luận văn Luận văn gồm 81 trang, có 10 bảng 51 hình Phần mở đầu 06 trang, kết luận kiến nghị 02 trang, tài liệu tham khảo 04 trang Nội dung luận văn chia làm 03 chƣơng: Chƣơng – TỔNG QUAN (24 trang) Chƣơng – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (14 trang) Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (31 trang) Footer Page of 145 Header Page of 145 CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 CÂY BỨA 1.1.1 Bộ chè 1.1.2 Bứa 1.1.3 Phân loại bứa 1.2 GIỚI THIỆU AXIT HYDROXYCITRIC (HCA) 1.2.1 Nguồn gốc (-)-HCA (-)-HCA đƣợc tìm thấy vỏ vài loài bứa, bao gồm tai chua (G cowa), G cambogia, G indica G atroViridis Các loài mọc nhiều lục địa Ấn Độ phía tây Sri Lanka 1.2.2 Hóa học (-)-HCA COOH HO C H HO C H C COOH H C OH COOH HOOC C OH COOH H C COOH H H Axit (-)-hydroxycitric (I) Axit (+)-hydroxycitric (II) COOH COOH HO C H HOOC C OH H C COOH H Axit (+)-allo-hydroxycitric (III) H C OH HO C COOH H C COOH H Axit (-)-allo-hydroxycitric (IV) Hình 1.8 Cấu trúc đồng phân axit hydroxycitric Footer Page of 145 Header Page of 145 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU Quả bứa đƣợc hái từ xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng Sau thu hoạch, rửa bứa để loại bỏ tạp chất bụi bẩn bám bề mặt bứa Hong khô bề mặt khô hoàn toàn, tách bỏ phần ruột quả, cắt nhỏ tiến hành sấy khô nhiệt độ 80oC vòng 36 Xay nhỏ nguyên liệu để chiết tách, thu nhận chuyển hóa axit (-)-HCA 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xác định số số vật lý a Độ ẩm b Hàm lượng tro c Xác định hàm lượng số kim loại phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) d Chiết tách axit (-)-HCA phương pháp chưng ninh e Khảo sát tổng lượng axit thu phương pháp chuẩn độ axit – bazơ f Xác định hàm lượng HCA mẫu phương pháp HPLC g Chuyển hóa tạo muối magie axit (-)-HCA (HCMg) h Kiểm tra sản phẩm muối tạo thành phương pháp HPLC 2.2.2 Phân lập xác định cấu trúc a Sắc ký mỏng b Sắc ký cột c Xác định cấu trúc cấu tử tách Footer Page of 145 Header Page of 145 Xác định cấu trúc cấu tử tách đƣợc phƣơng pháp phổ: IR,1H-NMR, 13C-NMR, DEPT… 2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU  Phân lập, xác định cấu trúc HCA Vỏ bứa Nguyên liệu xử lý Xác định tính chất vật lý Chƣng ninh Cảm quan Thành phần kim loại Hàm lƣợng tro Độ ẩm Dịch chiết vỏ bứa khô Tổng hàm lƣợng axit Hàm lƣợng HCA Nƣớc Lựa chọn hệ dung môi Axit formic n-butanol Phân lập HCA (TLC, CC) Xác định cấu trúc (IR) Footer Page of 145 Header Page of 145  Phân lập, xác định cấu trúc muối HCA Cảm quan Muối HCMg n-butanol Lựa chọn hệ dung môi Axit formic Nƣớc Phân lập muối HCA (TLC, CC, HPLC) Xác định cấu trúc (IR, 1H-NMR, 13C-NMR) Footer Page of 145 Kiểm tra, đánh giá hàm lƣợng sản phẩm phân lập Header Page 10 of 145 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ 3.1.1 Độ ẩm nguyên liệu Độ ẩm trung bình vỏ bứa 11,34% Độ ẩm tƣơng đối thấp, chứng tỏ trình sấy làm cho nguyên liệu khô nhƣng không bị cháy Với độ ẩm này, bảo quản nguyên liệu thời gian dài nhƣng không bị mốc, thay đổi mặt cảm quan, nguyên liệu có độ ổn định tốt 3.1.2 Hàm lƣợng tro Hàm lƣợng tro trung bình vỏ bứa khô 1,16% Hàm lƣợng tro thấp chiếm khoảng 1,2% khối lƣợng vỏ khô Điều dự báo hàm lƣợng kim loại có bứa nói chung vỏ bứa khô nói riêng 3.1.3 Hàm lƣợng số kim loại nặng Kết xác định hàm lƣợng số kim loại nặng vỏ bứa khô phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết xác định thành phần kim loại nặng vỏ bứa khô TT Tên kim loại Phƣơng pháp AAS Pb TCVN 6193-1996 Cu TCVN 6193-1996 Zn TCVN 6193-1996 Fe TCVN 6193-1996 Sn TCVN 6193-1996 As TCVN 6193-1996 Tổng Cu, Zn Fe Kết (mg/kg) 0,0108 0,0406 0,0191 0,0605 0,0070 KPH 0,1202 Ghi chú: “KPH”: không phát Footer Page 10 of 145 Tiêu chuẩn CODEX STAN 1641989 (mg/kg) 0,3 5,0 5,0 15,0 200,0 0,2 20,0 Hàm lƣợng cho phép (mg/kg) 30 40 40 Header Page 12 of 145 10 Đƣờng chuẩn đƣợc xác định cách thay đổi nồng độ mẫu chuẩn Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng với nồng độ từ 10 đến 320 ppm Phƣơng trình đƣờng chuẩn HCA: C = 0,0159H + 0,377 Trong đó: H chiều cao peak HCA; C nồng độ HCA; hệ số tƣơng quan R2 = 0,999948 3.3.2 Kết xác định hàm lƣợng HCA vỏ bứa HPLC Thành phần axit hữu xác định phƣơng pháp HPLC đƣợc tính công thức sau: C(ppm) = (0,0159*H + 0,377)*Vđm*Kpl/Mm C% = C(ppm)/10000 Trong đó: C(ppm) : Nồng độ tính ppm C% : Nồng độ phần trăm H : Chiều cao peak sắc ký A : Diện tích peak sắc ký Vđm : Thể tích mẫu cô đặc (ml) Kpl : Hệ số pha loãng Mm : Trọng lƣợng mẫu thử (g) Kết xác định axit hydroxycitric vỏ bứa khô mẫu chƣng ninh phƣơng pháp HPLC đƣợc thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết xác định HCA vỏ bứa khô mẫu chưng ninh phương pháp HPLC M mẫu V đm Kpl H C% 10,002 100 400 217,137 2,6386 Footer Page 12 of 145 Header Page 13 of 145 11 Sắc ký đồ mẫu HCA sau chƣng ninh so sánh thời gian lƣu với sắc ký đồ chuẩn Nhận xét: Axit đƣợc tìm thấy chủ yếu vỏ bứa axit hydroxycitric đƣợc thể sắc ký đồ hình 3.3, có thời gian lƣu 4,300 phút, ứng với thời gian lƣu chuẩn 4,317 phút Ngoài xuất peak có thời gian lƣu 3,720 chƣa đƣợc định danh Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu HCA 3.4 KẾT QUẢ PHÂN LẬP AXIT HYDROXYCITRIC 3.4.1 Kết kiểm tra sắc ký mỏng chọn hệ dung môi Kiểm tra màu dịch chiết thuốc thử Natri metavanadate 1%, thu đƣợc vệt màu cam Sau thử nghiệm chấm mỏng với hệ dung môi khác nhau, tìm thấy hệ dung môi phù hợp nBuOH/HCOOH/H2O Đối với hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O, sau thử nghiệm với tỉ lệ khác nhau, tìm thấy tỉ lệ 4:3,5:4 thu đƣợc vệt cam hình bầu dục, giá trị Rf = 0,36 Vì lựa Footer Page 13 of 145 Header Page 14 of 145 12 chọn tỉ lệ dung môi để tiến hành tách sắc ký cột 3.4.2 Kết tách sắc ký cột Thực phƣơng pháp nhồi cột ƣớt: Cho từ từ 200 g silicagel vào cốc đựng 500 ml hỗn hợp n-BuOH/HCOOH/H2O (4:3,5:4) đồng thời khuấy để đuổi hết bọt khí, thu đƣợc hỗn hợp đồng có độ sệt thích hợp để nhồi vào cột sắc kí Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp khô: Cô cạn 10ml dịch chiết thành keo, lấy ½ phần keo trộn với khoảng 4g silicagen Nghiền hỗn hợp thật mịn Theo dõi trình sắc ký phân tích TLC với thuốc thử màu Natri metavanadate 1% Những ống có kết TLC tƣơng tự gộp chung vào phân đoạn Ta thu đƣợc phân đoạn: H1 (1 – 4); H2 (5 – 7); H3 (8 – 11); H4 (12 – 90) Đun nhẹ phân đoạn thu đƣợc để bay phần dung môi Dùng mao quản chấm dịch mẫu phân đoạn chạy sắc ký mỏng với hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O (4:3,5:4) Dùng thuốc thử màu Natri metavanadate 1%, nhận thấy có phân đoạn H3 vệt cam hình bầu dục, giá trị Rf = 0,35 Các phân đoạn lại không cho kết phù hợp So sánh giá trị Rf lý thuyết axit hydroxycitric với kết thu đƣợc phân đoạn H3, kết luận chứa axit hydroxycitric phân đoạn Cô cạn phân đoạn ta thu đƣợc kết sau: Các phân đoạn Sản phẩm sau cô cạn H1 Không có sản phẩm H2 Cao màu nâu H3 Chất rắn màu trắng (hình 3.8) H4 Không có sản phẩm Footer Page 14 of 145 Header Page 15 of 145 13 Để xác định cấu trúc phân đoạn H3, tiến hành đo phổ IR; phổ NMR: 1H-NMR; 13C-NMR; COSY; DEPT Hình 3.8 Phân đoạn H3 3.5 XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƯNG VẬT LÝ, ĐỊNH DANH CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT H3 PHÂN LẬP ĐƯỢC 3.5.1 Các đặc trƣng vật lý - Là chất rắn màu trắng - Sắc ký mỏng màu với thuốc thử Natri metavanadate 1%: màu cam - Giải ly hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O (4:3,5:4) cho vết màu cam hình bầu dục, có giá trị Rf = 0,36 3.5.2 Nhận danh cấu trúc H3 a Kết đo phổ hồng ngoại IR Kiểm tra kết đo hồng ngoại IR Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng 2, ta thấy peak đặc trƣng gần nhƣ trùng với phổ IR HCA chuẩn Footer Page 15 of 145 Header Page 16 of 145 14 Hình 3.10 Phổ IR hợp chất H3 b Kết đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Sản phẩm kiểm tra sắc ký mỏng tiến hành phân lập sắc ký cột nhiều lần nhƣng không thu đƣợc sản phẩm tinh khiết Do đó, sản phẩm không đạt chuẩn để đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Sản phẩm sau phân lập đƣợc kiểm tra HPLC phổ HPLC đƣợc thể hình 3.11 Hình 3.11 Sắc ký đồ phân đoạn H3 Footer Page 16 of 145 Header Page 17 of 145 15 Chất đƣợc tìm thấy phân đoạn H3 đƣợc thể sắc ký đồ hình 3.11 Trên sắc ký đồ xuất hai peak, có peak có thời gian lƣu 4,421 phút, ứng với thời gian lƣu chuẩn axit hydroxycitric 4,317 phút Peak lại chƣa đƣợc định danh 3.6 KIỂM TRA CẤU TRÚC MUỐI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Kết đo phổ HPLC cho thấy thời gian lƣu muối Magie hidroxycitrat tổng hợp 4,10 phút So sánh với kết đo HPLC muối Magie hidroxycitrat chuẩn có thời gian lƣu 4,005 phút (theo công bố Shrivastava cộng [17]) ta thấy kết sai lệch ít; kết luận tổng hợp thành công muối Magie hidroxycitrat Muối Magie điều chế dạng thô có độ tinh khiết trung bình (87,175%) đƣợc thể qua bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết diện tích peak phổ HPLC sản phẩm muối Magie TT RT Diện tích peak % diện tích peak 1,93 3630 1,807 2,37 9423 4,690 2,93 3227 1,606 3,41 7670 3,817 4,10 175150 87,175 8,55 1816 0,904 Tên HCMg Từ bảng 3.6, nhận thấy muối magie hydroxycitrat lẫn tạp chất Đó 05 peak có thời gian lần lƣợt là: 1,93; 2,37; 2,93; 3,41; 8,55 Do đó, ta cần tiếp tục phân lập muối magie hydroxycitrat để thu đƣợc sản phẩm tinh khiết Footer Page 17 of 145 Header Page 18 of 145 16 3.7 KẾT QUẢ PHÂN LẬP MUỐI MAGIE HYDROXYCITRAT 3.7.1 Kết kiểm tra sắc ký mỏng chọn hệ dung môi Hòa tan khoảng 5mg muối HCMg vào 20ml nƣớc cất Kiểm tra màu dung dịch muối HCMg thuốc thử Natri metavanadate 1%, thu đƣợc vệt màu cam Sau thử nghiệm sắc ký mỏng với hệ dung môi khác nhau, tìm thấy hệ dung môi phù hợp nBuOH/HCOOH/H2O Đối với hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O, sau thử nghiệm với tỉ lệ khác nhau, tìm thấy tỉ lệ 3:4:4 thu đƣợc vệt cam hình bầu dục, giá trị Rf = 0,41 Vì lựa chọn tỉ lệ dung môi để tiến hành tách sắc ký cột 3.7.2 Kết tách sắc ký cột Thực phƣơng pháp nhồi cột ƣớt: Cho từ từ 200 g silicagel vào cốc đựng 500 ml hỗn hợp n-BuOH/HCOOH/H2O (3:4:4) đồng thời khuấy để đuổi hết bọt khí, thu đƣợc hỗn hợp đồng có độ sệt thích hợp để nhồi vào cột sắc kí Mẫu đƣợc nạp vào cột theo phƣơng pháp ƣớt: 4,014 g muối HCMg hòa tan vào hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O (3:4:4), khuấy muối tan hết Theo dõi trình sắc ký phân tích TLC với thuốc thử màu Natri metavanadate 1% Những ống có kết TLC tƣơng tự gộp chung vào phân đoạn Ta thu đƣợc phân đoạn: H1 (1 – 3); H2 (4 – 6); H3 (7 – 9); H4 (10 – 14); H5 (15 – 20); H6 (21 – 95) Đun nhẹ phân đoạn thu đƣợc để bay phần dung Footer Page 18 of 145 Header Page 19 of 145 17 môi Dùng mao quản chấm dịch mẫu phân đoạn chạy sắc ký mỏng với hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O (3:4:4) Dùng thuốc thử màu Natri metavanadate 1%, nhận thấy có phân đoạn H4 vệt cam hình bầu dục, giá trị Rf = 0,40 Các phân đoạn lại không cho kết phù hợp So sánh giá trị Rf lý thuyết muối axit hydroxycitrat với kết thu đƣợc phân đoạn H4, kết luận chứa muối magie hydroxycitrat phân đoạn Cô cạn phân đoạn ta thu đƣợc kết sau: Các phân đoạn Sản phẩm sau cô cạn H1 Không có sản phẩm H2 Cao màu nâu H3 Không có sản phẩm H4 Chất rắn màu nâu nhạt (hình 3.18) H5 Không có sản phẩm H6 Không có sản phẩm Để xác định cấu trúc phân đoạn H4, tiến hành đo phổ IR;các phổ NMR: 1H-NMR; 13C-NMR; DEPT Hình 3.18 Phân đoạn H4 Footer Page 19 of 145 Header Page 20 of 145 18 3.8 XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC TRƢNG VẬT LÝ, ĐỊNH DANH CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT H4 PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.8.1 Các đặc trƣng vật lý - Là chất rắn màu nâu nhạt - Sắc ký mỏng màu với thuốc thử Natri metavanadate 1%: màu cam - Giải ly hệ dung môi n-BuOH/HCOOH/H2O (3:4:4) cho vết màu cam hình bầu dục, có giá trị Rf = 0,41 3.8.2 Nhận danh cấu trúc H4 a Kết đo phổ hồng ngoại IR Kiểm tra kết đo hồng ngoại IR phân đoạn H4 Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lƣờng Chất lƣợng với phổ IR muối HCA chuẩn, ta thấy peak đặc trƣng gần nhƣ trùng Hình 3.20 Phổ IR phân đoạn H4 Footer Page 20 of 145 Header Page 21 of 145 19 b Kết đo phổ NMR Phổ 1H-NMR hợp chất H4 đƣợc thể hình 3.21 kết phân tích liệu phổ đƣợc tóm tắt bảng 3.7 Hình 3.21 Phổ 1H-NMR hợp chất H4 Tín hiệu phổ 1H-NMR proton methylen (Ha-5 Hb-5) xuất 2,740 2,755 Peak singlet 4,058 thể proton nhóm methine (H-2) Peak lớn vùng quét máy 4,699 proton HDO dung môi D2O Bảng 3.7 Kết phổ 1H-NMR hợp chất H4 Số TT δ H (D2O) Kết thể 2,740 (singlet tù) Ha-5 2,755 (singlet tù) Hb-5 4,058 (singlet) H-2 4,699 Footer Page 21 of 145 H HDO dung môi D2O Header Page 22 of 145 Phổ 20 C-NMR muối HCA chuẩn hợp chất H4 đƣợc 13 thể hình 3.23 bảng 3.8 Hình 3.23 Phổ 13C-NMR hợp chất H4 Phổ 13C-NMR hợp chất H4 hình 3.23 có 03 peak 41,89; 75,49; 78,51 kết tƣơng ứng methylene cacbon (C-5), methine cacbon (C-2) cacbon bậc (C-3) muối HCA chuẩn Các peak 177,66; 178,34 179,53 cacbonyl cacbon (C-1; C-4 C-6) 03 nhóm cacboxylat muối HCA Footer Page 22 of 145 Header Page 23 of 145 21 Bảng 3.8 Kết phổ 13C-NMR hợp chất H4 Số TT δ C (D2O) Kết thể 41,89 75,49 78,51 177,66 Cacbon nhóm cacbonyl, C-1 178,34 Cacbon nhóm cacbonyl, C-4 179,53 Cacbon nhóm cacbonyl, C-6 Methylene cacbon (-CH2-), C-5 CH Methine cacbon ( Cacbon bậc ( C ), C-2 ), C-3 Từ kết kiểm tra phổ 13C-NMR 1H-NMR cho thấy sản phẩm phân lập đƣợc có công thức cấu tạo phù hợp với công thức muối magie nhƣ dự đoán ban đầu (hình 3.25) 3.8.3 Kiểm tra hợp chất H4 phổ HPLC Để kiểm tra sản phẩm muối tạo thành, ta thực kiểm tra hợp chất H4 phổ HPLC Kết kiểm tra phổ HPLC đƣợc thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết diện tích peak phổ HPLC hợp chất H4 Diện tích % diện tích peak peak 3,43 114 0,066 4,09 173107 99,550 8,51 669 0,385 TT RT Footer Page 23 of 145 Tên HCMg Header Page 24 of 145 22 Nhận xét: Sau phân lập, dựa vào sắc ký đồ thấy rõ sản phẩm muối magie hydroxycitrat giảm số tạp chất so với sản phẩm muối đƣợc tổng hợp ban đầu 03 peak có thời gian lƣu lần lƣợt 1,93; 2,37 2,93 biến mất; lại 02 peak tạp chất có diện tích nhỏ, tƣơng ứng với thời gian lƣu 3,43 8,51 Peak có diện tích lớn trùng với thời gian lƣu muối magie hydroxycitrat đạt độ tinh khiết 99,55% Hình 3.25 Công thức cấu tạo muối magie hydroxycitrat Footer Page 24 of 145 Header Page 25 of 145 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong trình triển khai nghiên cứu, đề tài đạt đƣợc kết nhƣ sau: Đã xác định thông số hóa lý nguyên liệu: độ ẩm nguyên liệu bột khô 11,34%; hàm lƣợng tro trung bình 1,16%; hàm lƣợng kim loại nặng Cu, Pb, Zn, Fe, Sn, As nằm khoảng cho phép theo quy định tiêu chuẩn CODEX STAN 164-1989 Quyết định số 867/1998/QĐ-BYT Bộ Y Tế ngày tháng năm 1998 việc ban hành Danh mục Tiêu chuẩn vệ sinh lƣơng thực, thực phẩm Khảo sát đƣợc tổng hàm lƣợng axit vỏ bứa khô 17,159g/100g phƣơng pháp chuẩn độ Trong đó, hàm lƣợng axit hydroxycitric chiếm 2,64g/100g đƣợc xác định phƣơng pháp HPLC Xác định đƣợc hệ dung môi thích hợp: n- BuOH/HCOOH/H2O (4:3,5:4) phƣơng pháp sắc ký mỏng để tiến hành phân lập axit hydroxycitric sắc ký cột Sản phẩm sau phân lập thu đƣợc kết phổ hồng ngoại tƣơng ứng với phổ hồng ngoại HCA chuẩn Kiểm tra độ tinh khiết muối HCMg sau tổng hợp phƣơng pháp HPLC thu đƣợc kết quả: 87,175% Xác định đƣợc hệ dung môi thích hợp: n- BuOH/HCOOH/H2O (3:4:4) phƣơng pháp sắc ký mỏng để tiến hành phân lập muối magie hydroxycitrat sắc ký cột Sản phẩm sau phân lập, thu đƣợc kết từ phổ hồng ngoại, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân tƣơng ứng với cấu trúc muối magie hydroxycitrat Footer Page 25 of 145 Header Page 26 of 145 24 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm sau phân lập phƣơng pháp HPLC thu đƣợc kết quả: 99,55% Điều chứng tỏ, trình phân lập loại bỏ thành công số tạp chất Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu muối magie hydroxycitrat với khối lƣợng lớn nghiên cứu tạo sản phẩm thƣơng mại với mục đích giảm cân Footer Page 26 of 145 ... suất tạo muối hydroxycitrat làm tăng hoạt tính sinh học muối hydroxycitrat Xuất phát từ vấn đề trên, chọn đề tài nghiên cứu Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc axit hydroxycitric muối hydroxycitrat... thành phương pháp HPLC 2.2.2 Phân lập xác định cấu trúc a Sắc ký mỏng b Sắc ký cột c Xác định cấu trúc cấu tử tách Footer Page of 145 Header Page of 145 Xác định cấu trúc cấu tử tách đƣợc phƣơng... lƣợng axit Hàm lƣợng HCA Nƣớc Lựa chọn hệ dung môi Axit formic n-butanol Phân lập HCA (TLC, CC) Xác định cấu trúc (IR) Footer Page of 145 Header Page of 145  Phân lập, xác định cấu trúc muối