LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Trương Quốc Phong, trưởng phòng Proteomic, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội hướng dẫn tận tình, chu đáo dìu dắt suốt trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS Nguyễn Việt Phương , có đóng góp quý báu trình thực luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ động viên suốt trình nghiên cứu đề tài Do điều kiện, khả thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài tránh khỏi sai sót Tôi mong nhận đóng góp quý thầy cô bạn để đề tài hoàn thiện hơn! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 01 năm 2016 Học viên thực Nguyễn Thị Phương Hạnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận Văn tốt nghiệp: “Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp coenzyme Q 10 điều kiện thu nhận” kết nghiên cứu của cùng với nhóm nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB Bộ Công thương, thực hướng dẫn khoa học PGS.TS:Trương Quốc Phong, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Hà Nội, ngày 15 tháng 01 năm 2016 Học viên thực Nguyễn Thị Phương Hạnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU TÓM TẮT STT Kí hiệu Tên ATP Adenosine triphosphate CoQ10 Coenzyme Q10 DPS Decaprenyl diphosphate synthase DXS 1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase DMAPP Dimethylallyl diphosphate EDTA Ethyldiamin tetraaxetic acid FPP Farnesyl phosphate IPP Isopentenyl diphosphate MEP 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate 10 MVA Mevalonate 11 Phba p-hudroxybenzoic acid 12 CSL Corn steep Liquor 13 Da Dalton 14 Cfu Colony forming unit 15 CoQ Coenzyme Q 16 CoQ10 Coenzyme Q10 17 CoQ10H2 Coenzyme Q10quinol 18 HPLC High-performance liquid chromatography 19 DO Dissolved oxygen MỤC LỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BẢNG BIỂU TÓM TẮT ĐỀ TÀI Coenzym Q10 có vai trò quan trọng trình sinh tổng hợp ATP chất chống oxy hóa mạnh Chúng sử dụng nhiều làm thực phẩm chức năng; ứng dụng y tế bổ sung vào mỹ phẩm chất chống oxy hóa, chống lão hóa Hiện nay, việc sản xuất CoQ10 chế phẩm từ CoQ10 ngày quan tâm gia tăng Mục tiêu đề tài nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp coenzyme Q10 điều kiện tách chiết hiệu để tạo phức Coenzym Q10 với Beta-Cyclodextrin có khả tan nước, phục vụ tạo chế phẩm CoQ10 Trong nghiên cứu này, sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp để lên men sinh tổng hợp CoQ10 phương pháp lên men khác CoQ10 tách chiết từ Agrobacterium tumefaciens phương pháp xử lý ethanol hexan CoQ10 thu được sẽ được nghiên cứu tạo phức với Beta Cyclodextrin và nghiên cứu các đặc tính của phức MỞ ĐẦU Coenzyme Q10 (CoQ10) hợp chất tự nhiên tìm thấy hầu hết tế bào thể người, động vật coenzyme quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử màng tế bào sinh vật nhân sơ màng ty thể tế bào sinh vật nhân thực,có vai trò quan trọng việc sản xuất ATP nguồn lượng thể Nhờ hoạt tính chống oxy hóa chức tăng cường miễn dịch CoQ 10 nên CoQ10 ứng dụng nhiều lĩnh vực như: y-tế nhằm ngăn ngừa, điều trị nhiều bệnh tim mạch, tiểu đường, parkinson, ung thư , bổ sung vào mỹ phẩm chất chống oxy hóa, chống lão hóa phổ biến sản xuất CoQ 10 làm thực phẩm chức Với nhiều ứng dụng có lợi nên nhu cầu CoQ 10 ngày tăng Để đáp ứng nhu cầu đó, nhiều giải pháp đưa tổng hợp hóa học (bán tổng hợp) tách chiết từ động vật tổng hợp sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên CoQ10 tập trung nghiên cứu sản xuất đường sinh học nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, P denitrificans Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens( A tumefaciens) vi khuẩn sử dụng để nghiên cứu sản xuất CoQ 10, chúng có nhiều ưu điểm có hàm lượng CoQ 10 tương đối cao so với vi sinh vật khác, tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất quy mô công nghiệp Xuất phát từ lý nêu tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp coenzyme Q10 điều kiện thu nhận’’ Trong nghiên cứu này, tiến hành lên men chủng A tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ 10 phương pháp lên men khác để lựa chọn phương pháp lên men phù hợp Nghiên cứu thu nhận CoQ10 từ sinh khối A tumefaciens đồng thời xác định số đặc tính CoQ10 Nội dung nghiên cứu gồm: - Khảo sát số kỹ thuật điều kiện lên men A tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ10 - Khảo sát phương pháp tách chiết thu CoQ10 từ chủng Agrobacterium tumefaciens -tái tổ hợp - Khảo sát số đặc tính CoQ10 PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Coenzyme Q10 1.1.1 Khái niệm Vào năm 1957, TS FGrane (Winconsin - Mỹ) phân lập từ tim bò chất màu vàng nghiên cứu ông hóa sinh học chuỗi vận chuyển điện tử ty thể(-còn gọi chuỗi hô hấp), hay hợp chất gọi CoQ10 Coenzym Q (CoQ) cấu trúc hóa học gồm vòng quinone mạch bên isopren CoQ thành phần quan trọng chuỗi vận chuyển điện tử tìm thấy nhiều loài sinh vật Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), loại coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử bám màng prokaryote eukaryote Có nhiều loại CoQ khác tùy theo mạch bên (R) cấu trúc hóa học chứa nhiều hay isopren Ví dụ coenzyme Q6 có mạch R gồm isopren (có số vi sinh vật), coenzyme Q10 có R gồm 10 isopren (ở ty thể động vật), thực vật có chất tương tự plastoquinon Là hợp chất giống vitamin ưa béo nằm hệ thống vận chuyển điện tử bám màng prokaryote eukaryote Mỗi loại CoQ chiếm ưu phụ thuộc loài Ví dụ, Saccharomyces cerevisae chủ yếu sản xuất CoQ6, Escherichia coli chủ yếu sản xuất CoQ8, A tumefaciens chủ yếu sản xuất CoQ10 Ở người có CoQ10, CoQ6 ÷ CoQ9 theo thức ăn vào thể biến đổi thành CoQ10.[ 7] 1.1.2 Cấu tạo Coenzyme Q10 (2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-1,4-benzoquinone) có công thức phân tử C59H90O4, khối lượng mol phân tử: 863,34 g/ mol [10] Công thức cấu tạo gồm vòng quinone 10 đuôi isoprene (tạo chuỗi poly isoprene kị nước) Hình 1.1 Các trạng thái khác CoQ10 [17] Coenzyme Q tồn trạng thái: dạng khử ubiquinol (CoQH2), dạng trung gian (CoQH •), dạng oxy hóa ubiquinone (CoQ).[17] Các chức oxy hóa khử ubiquinol sản xuất lượng cho thể chất chống oxy hóa dựa khả trao đổi hai electron chu kỳ oxy hóa khử ubiquinol (dạng khử) ubiquinone (dạng oxy hóa) CoQ10 chất chống oxy hóa tan chất béo giúp bảo vệ cấu trúc sống khỏi phá hủy gốc tự từ hai nguồn nội sinh ngoại sinh Nhờ khả khuếch tán dễ lớp màng lipid, CoQ 10 góp phần bảo vệ màng lipid tế bào 10 Trong nghiên cứu tiến hành nghiên cứu so sánh phương pháp khuấy từ phương pháp lắc máy lắc ngang tốc độ 140 vòng/phút thời gian Kết cho thấy với phương pháp lắc hiệu suất thu hồi tăng 1.05 lần so với phương pháp khuấy (hình 3.9) Từ kết thu cho thấy sử dụng khấy lắc hệ thống lắc ngang để chiết CoQ10 từ pha ethanol sang pha hexane quy mô lớn Hình 3.9 So sánh hiệu chiết CoQ10 từ pha ethanol sang pha hexane sử dụng hai phương pháp trộn lắc khuấy * Khảo sát điều kiện cô mẫu Khi tiến hành tách chiết CoQ10 quy mô lớn, việc cô đặc CoQ10 từ dung môi hexane thực thiết bị speedVac quy mô nhỏ Trong trường hợp này, CoQ10 lựa chọn cô đặc thiết bị máy cô quay chân không Buchi Để xác định điều kiện cô mẫu thích hợp, tiến hành khảo sát hai thông số thiết bị cô quay áp suất nhiệt độ Kết khảo sát điều kiện áp suất thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng áp suất cô quay Nhiệt độ Áp suất (mbar) Thể tích (ml) Thời gian (phút) 45oC 360 200 180 45 oC 300 200 70 45 oC 260 200 45 45 oC 200 200 33 47 Kết cho thấy rằng, giảm áp suất cô quay xuống thời gian cô đặc giảm theo Với áp suất 360 mbar thời gian thực cô đặc hoàn toàn 200 ml dịch Khi giảm áp suất xuống 260 mbar thời gian cô đặc 45 phút Khi giảm áp suất xuống thấp (200 mbar) gian cô đặc 33 phút Với kết thu được, lựa chọn điều kiện áp suất cô đặc phù hợp 260 mbar Thông số thứ hai lựa chọn để khảo sát nhiệt độ Theo lý thuyết nhiệt độ cao tốc độ bay nhanh thời gian cô đặc ngắn Hexane có điểm sôi 50 – 70oC Trong nghiên cứu này, trình cô đặc thực điều kiện nhiệt độ khác 40, 45, 50 60 oC Kết cho thấy tăng nhiệt độ thời gian cô đặc giảm (bảng 3.4) Ở điều kiện 40 oC thời gian cô đặc 83 phút, tăng nhiệt độ lên đến 60 oC thời gian cô đặc 30 phút Theo nghiên cứu trước cho thấy CoQ10 tương đối bền dải nhiệt độ khảo sát < 60 oC Do đó, nhiệt độ cô đặc lựa chọn 60 oC cho nghiên cứu Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cô quay Nhiệt độ Áp suất (mbar) Thể tích (ml) Thời gian (phút) 40 oC 260 200 83 45 oC 260 200 45 50 oC 260 200 43 60 oC 260 200 31 3.3 Nghiên cứu tạo phức CoQ10 với Beta cyclodextrin Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin Coenzyme Q10 có chứa đuôi isoprenyl kỵ nước nên không hòa tan nước Để sử dụng làm thuốc, thực phẩm chức mỹ phẩm, CoQ10 cần điều chế trạng thái tan nước Beta-cyclodextrin (β-CD) gồm phân tử glucopyranose liên kết với tạo thành cấu trúc vòng β-cyclodextrin chất có bề mặt ưa nước phía phần kỵ nước nằm bên nên phân tử β-cyclodextrin có khả bao quanh CoQ10 kỵ nước để hình thành phức 48 CoQ10-β-CD làm tăng độ hòa tan nước, độ bền, hoạt tính sinh học chúng Dạng hòa tan nước CoQ10 tăng khả hấp thu vào tế bào thành ruột đồng thời tăng cường trình hô hấp ty thể Cyclodextrin tạo phức hòa tan nước với nhiều hợp chất khác cyclodextrin ứng dụng thực phẩm dược phẩm [37] Theo lý thuyết tỷ lệ phân tử lượng β-CD CoQ10 1,32 lần có nhiều phân tử β-cyclodextrin tạo phức với CoQ10 Trong nghiên cứu này, CoQ10 tạo phức với β-cyclodextrin với tỷ lệ mol khác (1:1, 1:3, 1:5, 1:10) theo quy trình mô tả phần phương pháp nghiên cứu Hỗn dịch CoQ10 β-cyclodextrin sau trộn sấy phun để tạo chế phẩm dạng bột Để lựa chọn tỷ lệ mol CoQ10: β-CD thích hợp, tiến hành đánh giá tỷ lệ thu hồi CoQ10 từ công thức thông qua hàm lượng CoQ10 trước sau sấy phun Kết hình 3.11 cho thấy tỷ lệ CoQ10: β-CD 1:5 1:3 cho khả thu hồi CoQ10 cao đáng kể so với tỷ lệ khác Trong đó, tỷ lệ 1:5 khả thu hồi CoQ10 cao đạt 99% Với tỷ lệ 1:1, khả thu hồi thấp (61,7%) tỷ lệ β-CD để liên kết tạo phức với CoQ10, CoQ10 tự bị thất thoát trình sấy phun Hình 3.11 Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn CoQ10 với βcyclodextrin 49 Khảo sát số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin * Khả hòa tan phức CoQ10- β- Cyclodextrin Coenzyme Q10 chất có tính kỵ nước cao, β-CD có bề mặt bên ưa nước nên phức CoQ10-β-CD giúp CoQ10 dễ dàng phân tán vào nước Tiến hành nghiên cứu khả hòa tan nước phức Q10-βCD kết thiển bảng 3.5 hình 3.12 Bảng 3.5 Khả hòa tan phức CoQ10-β-CD nước CoQ10 tạo phức với β-cyclodextrin theo tỷ lệ khác Tỷ lệ CoQ10: β-CD Mức độ hòa tan 1/1 1/3 1/5 1/10 + ++ +++ +++ (+) xuất nhiều kết tủa; (++) xuất kết tủa; (+++) xuất kết tủa không xuất kết tủa Hình 3.12 Khả hòa tan phức β-CDQ10 nước CoQ10 tạo phức với Cyclodextrin theo tỷ lệ khác Kết thu cho thấy khả hòa tan tăng lên tỷ lệ tạo phức CoQ10 β-CD tăng Với tỷ lệ 1:1 1:3, dung dịch CoQ10-CD xuất tủa lắng sau 60 phút, tỷ lệ 1:5 – 1:10 không thấy xuất lắng cặn Kết nghiên cứu khả hòa tan phức CoQ10-β-CD điều kiện pH khác cho thấy mức độ hòa tan phụ thuộc vào pH tỷ lệ CoQ10: β-CD (bảng 3.6, hình 3.13) Ở pH thấp (pH ≤ 5), mức độ hòa tan so với pH Mức độ hòa tan tỷ lệ 1:1 1:3 tất pH 50 khảo sát (pH 2-7) Tỷ lệ 1:5 có khả hòa tan tốt pH 6-7, giảm pH 2-5 Từ kết nghiên cứu trên, tỷ lệ 1:5 CoQ10: β-cyclodextrin lựa chọn cho nghiên cứu Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH đến độ hòa tan phức β-CDQ10 Thời gian (phút) Tỷ lệ CoQ10/β-clyclodextrin pH 20 60 pH 2,0 1/1 1/3 1/5 1/10 ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ + + pH 1/3 ++ ++ + + ++ ++ 60 pH 3,0 ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ ++ + + + + + ++ pH 5,0 1/1 20 + 51 ++ ++ + + ++ ++ 60 pH 4,0 ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ + + + + + + ++ pH 6,0 + 20 + + ++ pH 7,0 ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ Tỷ lệ CoQ10/β-clyclodextrin 1/5 1/10 + + ++ ++ + + ++ ++ + + + + ++ ++ + ++ + ++ + + ++ ++ ++ ++ + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + + (+) xuất nhiều kết tủa; (++) xuất kết tủa; (+++) xuất kết tủa không xuất kết tủa Hình 3.13 Ảnh hưởng pH đến khả hòa tan phức CoQ10- βCyclodextrin 52 * Ảnh hưởng nhiệt độ tới phức CoQ10-β-Cyclodextrin Để đánh giá ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền phức CoQ10-βCyclodextrin, phức chất ủ nhiệt độ khác (4 oC, 25oC, 37oC, 60oC) 144 hàm lượng CoQ10 xác định lại sau 24 Kết thể hình 3.14 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền CoQ10 phức CoQ10-CD Kết cho thấy hàm lượng CoQ10 không thay đổi sau 144 điều kiện nhiệt độ từ – 60oC Kết tương tự kết nghiên cứu với CoQ10 tự phù hợp với nghiên cứu Fir đồng tác giả (2009) Từ kết thu thấy phức CoQ10-CD không ảnh hưởng đến độ bền nhiệt CoQ10 phổ nhiệt độ nghiên cứu có tính bền nhiệt cao, điều có ý nghĩa cho trình tạo chế phẩm CoQ10, bảo quản ứng dụng CoQ10 sau * Ảnh hưởng ánh sáng tới phức CoQ10- β- Cyclodextrin Để xác định độ bền CoQ10 phức CoQ10-CD tác động ánh sáng, phức CoQ10-CD chiếu sáng đèn huỳnh quang chiếu sáng ánh sáng mặt trời (ngày đêm) thời gian 144 53 Hình 3.15 Ảnh hưởng ánh sáng đến độ bền CoQ10 phức β- CDQ10 Bảng 3.7 Độ bền CoQ10 tự CoQ10 phức (CoQ10-CD) tác dụng ánh sáng (tỷ lệ % CoQ10 giảm sau xử lý) Kết cho thấy bị chiếu sáng huỳnh quang hàm lượng CoQ10 giảm 16,4% sau 24 giờ, 32,4% sau 72 45,4 % sau 144 chiếu sáng (hình 3.15) Tuy nhiên mức độ giảm thấp khoảng lần so với CoQ10 tự (bảng 3.7) Khi bị chiếu sáng ánh sáng mặt trời theo ngày đêm, hàm lượng CoQ10 giảm nhanh so với chiếu sáng huỳnh quang Hàm lượng CoQ10 giảm đến 21% sau 24 giờ, 38,6% sau 72 h khoảng 47% sau 144 Tuy nhiên, tổn thất CoQ10 phức CoQ10-CD thấp 2,2 lần so với CoQ10 trạng thái tự Theo nghiên cứu Fir cộng CoQ10 bị phá hủy 27% ánh sáng tia cực tím sau 120 phút nhiệt độ phòng Nghiên cứu trước cho thấy CoQ10 bị phân hủy đến 80% sau 15 ngày chiếu sáng ánh sáng tự nhiên [7] Như vậy, việc tạo phức với β-CD làm tăng đáng kể độ bền CoQ10 tác dụng ánh sáng Trong điều kiện tương tự, hàm lượng CoQ10 hoàn toàn không thay đổi CoQ10 che tối hoàn toàn Sự giảm nhanh hàm lượng CoQ10 bị chiếu sáng ánh sáng mặt trời tác động tia cực tím 54 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu thu kết sau: Xác định điều kiện lên men quy mô lít/mẻ cho chủng A tumefaciens tái tổ hợp: 5% sucrose; 1% cao ngô; 2% (NH4)2SO4; 0,025% KH2PO4; 0,05% K2HPO4; 0,025 MgSO4.7H2O; 0,2% CaCO3; nhiệt độ 28oC; oxi hòa tan < 10%, pH 7,0; đạt hiệu suất 257 mg CoQ10/lít Điều kiện lên men kiểu fedbath 1% sucrose cho quy mô 100 lít/mẻ đạt hiệu suất 246 mg CoQ10/lít Xây dựng quy trình tách chiết CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp quy mô lớn: tỷ lệ ethanol/sinh khối (10:1, v/w), đồng hóa áp suất 1600 bar, ủ lắc nhiệt độ 37oC 24 giờ, chiết tinh hexane theo tỷ lệ 1:1, cô đặc chân không 60oC áp suất 260 mbar Đã tạo phức chất CoQ10-cyclodextrin có khả hòa tan tốt nước, khảo sát số đặc tính ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền CoQ10 phức CoQ10- β- Cyclodextrin : hàm lượng CoQ10 không thay đổi sau 144h điều kiện nhiệt độ từ – 60oC Ảnh hưởng ánh sáng phức CoQ10- β- Cyclodextrin.Từ phục vụ ứng dụng sản xuất thực phẩm chức KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình lên men thu nhận CoQ10 lượng - lớn Tiếp tục nghiên cứu độ bền CoQ10 phức theo thời gian Nghiên cứu ứng dụng CoQ10 để sản xuất thực phẩm chức 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đào Thị Lương, Trần Thị Lệ Quyên (2009), “Tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm phân loại chủng nấm men sinh CoQ10, phân lập Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, Chuyên san Công nghệ Sinh học, số 5, trang 8-14 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm, 2012, Công nghệ Enzym, NXB Khoa học kỹ thuật Tiếng Anh Arroyo, A.; Navarro, F.; Navas, P.; Villalba, J M (1998) "Ubiquinol regeneration by plasma membrane ubiquinone reductase" Protoplasma 205: 107-13 Battino, Maurizio; Ferri, Elida; Gorini, Antonella; Villa, Roberto Federico; Huertas, Jesus Francisco Rodriguez; Fiorella, Pierluigi; Genova, Maria Luisa; Lenaz, Giorgio; Marchetti, Mario (1990) "Natural Distribution and Occurrence of Coenzyme Q Homologues" Molecular Membrane Biology (3): 179–90 Elliot Redalieu, Inger M Nilsson, Thomas M Farley and Karl Folkers, 1968 Determination and Levels of Coenzyme Q10 in Human Blood Analytical Biochemistry 23, 132-140 Frederick L Crane, PhD (2001) “Biochemical Functions of Coenzyme Q10” Department of Biological Sciences, Purdue University, West Lafayette, Indiana Ha S.J., Kim S.Y., Seo J.H., Oh D.K., Lee J.K (2007), “Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plant scales for coenzyme Q10 production by Agrobacterium tumefaciens”, Appl Microbiol Biotechnol 74: pp 974-980 Hectors MPC, van Tits LJH, de Rijke YB, Demacker PNM (2003) “Stability studies of ubiquinol in plasma” Annals of Clinical Biochemistry ;40:100-1 57 Kaikkonen J, Nyyssönen K, Salonen JT (1999), “Measurement and stability of plasma reduced, oxidised and total coenzyme Q10 in humans”, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation ;59:457-66 10 Lang JK, Gohil K, Packer L (1986), “Simultaneous determination of tocopherols, ubiquinols, and ubiquinones in blood, plasma, tissue homogenates, and subcellular fractions”, Analytical Biochemistry ;157:10616 11 Marimuthu Jeya, Hee-Jung Moon, Jeong-Lim Lee, In-Won Kim, Jung-Kul Lee, 2010 Current state of coenzyme Q10 production and its applications Appl Microbiol Biotechnol 85, 1653 - 1663 12 Monica Ondarroa, Santosh K Sharma and Peter J Quinn, 1986 Solvation Properties of Ubiquinone-10 in Solvents of different polarity Bioscience Reports, Vol.6, No.9 13 Narendra Kumar S*, Puspha Agrawal, Sujata AS and Bhavana BK (2012), “ Fermentation, media optimization studies for Coenzyme Q10 production by Saccharomyces cerevisiae”, International research journal of pharmacy ISSN 2230 – 8407 14 Papas AM (1999), “Other antioxidants” Antioxidant status, diet, nutrition, and health New York: CRC Press LLC p 231–48 15 Ranadive P., Mehta Alka., George Saji (2011) Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii-ATCC International Journal of Chemical Engineering and Applications, Vol 16 Sarah L Molyneux (2006), “Development of assays for Coenzyme Q10 and their application in clinical trials” A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University of Canterbury 17 Soo-Ryun Cheong, Sang-Young Kim, Jung-Kul, Hyeon-Cheol, Suk-Jin Ha (2008) “Fermentation process for preparing Coenzyme Q1o by the recombinant Agrobacterium Tumefaciens” Patent Application Publication 58 18 Tang PH, Miles, M.V., DeGrauw, A., Hershey, A., Pesce, A (2001) “HPLC analysis of reduced and oxidised coenzyme Q10 in human plasma” Clinical Chemistry;47:256-65 19 Tian Y (2010), “Improvement of cultivation medium for enhanced production of coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum”, Biochemical Engineering Journal 51, 160–166 20 Tian Y et al 2010; Effects of Cell Lysis Treatments on the Yield of Coenzyme Q10 Following Agrobacterium tumefaciens Fermentation; Food Sci Tech Int 2010;16(2):0195–9 21 University of Canterbury, 2006 Development of assays for Coenzyme Q10 and Vitamin K, and their application in clinical trials 22 Weber C, Bysted A, Holmer G (1997), “The coenzyme Q10 content of the average Danish diet” Int J Vit Nutr Res 67:123–9 23 Yoshida H., Kotani Y., (1998), “Production of ubiquinone-10 using bacteria” J Gen Appl Microbiol., 44, 19–26 (1998) 24 Yuan Y., Tian Y., Yue T (2012), “Improvement of Coenzyme Q10 Production: Mutagenesis Induced by High Hydrostatic Pressure Treatment and Optimization of Fermentation Conditions” Journal of Biomedicine and Biotechnology 25 Zahiri H.S., Yoon S.H., Keasling J.D(2006) Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway Metabolic Engineering 8, 406 – 416 26 Sarah L Molyneux (2006), “Development of assays for Coenzyme Q10 and their application in clinical trials” A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University of Canterbury 27 Michael R.S., (2010), “Coenzyme Q10 Biosynthesis in Plants” A dissertation submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 59 28 Orihara N, Kuzuyama T, Takahashi S, Furihata K, Seto H (1998), “Studies on the biosynthesis of terpenoid compounds produced by actinomycetes Biosynthesis of the isoprenoid side chain of novobiocin via the nonmevalonate pathway in Streptomyces niveus” J Antibiot (Tokyo) 51:676–678 29 Rohmer M, Seemann M, Horbach S, Bringer-Meyer S, Sahms H (1996), “Glyceraldehyde 3-phosphate and pyruvate as precursors of isoprenic units in an alternative non-mevalonate pathway for terpenoid biosynthesis” J Am Chem Soc 118:2564–2566 30 Yalcin A, Kilinc E, Sagcan A, Kultursay H (2004), “Coenzyme Q10 concentrations in coronary artery disease” Clin Biochem 37:706–9 31 Munkholm H, Hansen HHT, Rasmussen K (1999), “Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure” Biofactors 9:285–9 32 Langsjoen PH, Langsjoen AM (1999), “ Overview of the use of CoQ10 in cardiovascular disease”, Biofactors 9(2–4):273–84 33 Conklin KA (2000), “Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects”, Nutr Cancer 37(1):1–18 34 Xinyi Liu, Haizhen Wu, Jiang Ye, Qinsheng Yuan, and Huizhan Zhang (2011), “Cloning and characterization of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter capsulatus B10”, Can J Microbiol Vol 52, 2006 35 Park Y.C., Kim S.J., Choi J.H., Lee W.H., Park K.M., Kawamukai M., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), “Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans”, Appl Microbiol Biotechnol 67: pp 192–196 36 Hodges S, Hertz N, Lockwood K, Lister R (1999), “CoQ10: could it have a role in cancer management?” Biofactors 9:365–70 37 Langsjoen PH, Langsjoen AM (1999), “ Overview of the use of CoQ10 in cardiovascular disease”, Biofactors 9(2–4):273–84 60 38 T R Kommuru, B Gurley, M A Khan, I K Reddy, Int J.Pharm.2001, 212, 233–246 39 Maja Milivojevic Fir, Luka Milivojevic, Mirko Prosek and Andrej Smidovnik* (2009), Property Studies of Coenzyme Q10–Cyclodextrins complexes 40 Xia Q., and Wang H – Study on stability of Coenzyme Q10-loaded nanostructured lipid carriers, Integrated Ferroelectrics: An international Journal 129(1) (2011) 208-214 41 Hamano Y, Dairi T, Yamamoto M, Kuzuyama T, Itoh N, Seto H., (2002), “Growth-phase dependent expression of the mevalonate pathway in a terpenoid antibiotic-producing Streptomyces strain”, Biosci Biotechnol Biochem 66:808–819 42 Yalcin A, Kilinc E, Sagcan A, Kultursay H (2004), “Coenzyme Q10 concentrations in coronary artery disease” Clin Biochem 37:706–9 43 Munkholm H, Hansen HHT, Rasmussen K (1999), “Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure” Biofactors 9:285–9 44 Conklin KA (2000), “Dietary antioxidant during cancer chemotherapy: impact on chemotherapeutic effectiveness and development of side effects”, Nutr Cancer 37(1):1–18 45 Park Y.C., Kim S.J., Choi J.H., Lee W.H., Park K.M., Kawamukai M., Ryu Y.W., Seo J.H (2005), “Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans”, Appl Microbiol Biotechnol 67: pp 192–196 61 ... nghiệp: Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp coenzyme Q 10 điều kiện thu nhận kết nghiên cứu của cùng với nhóm nghiên cứu đề tài Nghiên cứu. .. phù hợp sản xuất quy mô công nghiệp Xuất phát từ lý nêu tiến hành nghiên cứu đề tài Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp sinh tổng hợp coenzyme Q10 điều kiện. .. kiện thu nhận ’ Trong nghiên cứu này, tiến hành lên men chủng A tumefaciens DPXS12 tái tổ hợp sinh tổng hợp CoQ 10 phương pháp lên men khác để lựa chọn phương pháp lên men phù hợp Nghiên cứu thu