BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM TOÀN THẮNG “NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY LƯỢC VÀNG (Callisia fragrans Woods, Commelinaceae)” LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS TRẦN THU HƯƠNG Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành môn Hóa học Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Thu Hương, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn đến thầy, cô môn Hóa học Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực luận văn môn Em xin gửi lời cảm ơn đến cô chú, anh chị Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2014 Học viên Phạm Toàn Thắng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn hoàn thành kết nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Trần Thu Hương, Viện Kỹ thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Các số liệu, kết luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình Người cam đoan PHẠM TOÀN THẮNG MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU Chương I: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật họ Thài lài 1.2 Đặc điểm chi Callissia, họ thài lài .2 1.3 Thực vật học công dụng Lược vàng 1.4 Điều kiện sinh thái cách trồng 1.5 Một số thuốc từ Lược vàng 1.5.1 Các thuốc từ lược vàng 1.5.2 Các thuốc từ thân lược vàng 1.5.3 Một số chế phẩm từ Lược vàng 10 1.6 Một số nghiên cứu thành phần hóa học lược vàng 11 1.7 Hoạt tính sinh học lược vàng .13 1.8 Giới thiệu số nhóm chất thiên nhiên 19 Chương II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Giới thiệu chung phương pháp chiết 29 2.2.2 Các phương pháp phân lập xác định cấu trúc các hợp chất 29 2.2.3 Quá trình chiết thực vật 29 2.3 Phương pháp sắc ký 31 2.3.1 Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 31 2.3.2 Cơ sở phương pháp sắc ký 31 2.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký 31 2.3.4 Các phương pháp hóa lý để xác định cấu trúc 34 Chương III: THỰC NGHIỆM 37 3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học Lược vàng 37 3.1.1 Thu hái xử lý mẫu 37 3.1.2 Tạo cặn chiết tổng cặn chiết phân đoạn từ Lược vàng 37 3.1.3 Phân lập hợp chất từ cặn chiết nước 37 3.1.4 Hằng số vật lý liệu phổ chất 40 3.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học 41 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Kết nghiên cứu thành phần hóa học Lược vàng 43 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 44 4.2.1 Hợp chất CF1 .44 4.2.2 Hợp chất CF2 48 4.3.3 Kết nghiên cứu hoạt tính sinh học Lược vàng 54 Kết luận 61 Kiến nghị đề xuất 62 Tài liệu tham khảo .63 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) DEPT Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) HPLC-MS Phổ sắc ký lỏng khối phổ MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) TLTK Tài liệu tham khảo δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học (ppm) DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ Nội dung các hình, bảng Trang Hình Hình họ thài lài Hình Hình họ thài lài Hình Hình họ thài lài Hình Hình họ thài lài Hình Hình lược vàng Hình Các phận Lược vàng Hình Hoa Lược vàng Hình Các chế phẩm từ lược vàng 11 Hình Phổ khối lượng phu mù điện tử ESI - MS CF1 44 Hình 10 Phổ 1H - NMR CF1 45 Hình 11 Phổ 1H - NMR CF1 45 Hình 12 Phổ 1H - NMR CF1 46 Hình 13 Phổ 13C - NMR CF1 46 Hình 14 Phổ DEPT CF1 47 Hình 15 Phổ 13C - NMR CF1 48 Hình 16 Phổ HPLC - MS CF1 Hình 17 Cấu trúc hóa học CF1 48 Hình 18 Phổ khối lượng phu mù điện tử ESI - MS CF2 49 Hình 19 Phổ 1H - NMR CF2 50 Hình 20 Phổ 1H - NMR CF2 51 Hình 21 Phổ 1H - NMR CF2 51 Hình 22 Phổ 13C - NMR CF2 51 Hình 23 Phổ 13C - NMR CF2 52 Hình 24 Phổ DEPT CF2 53 Hình 25 Phổ HPLC - MS CF2 Hình 26 Cấu trúc hóa học CF2 55 Hình 27 Tế bào LLC nuôi cấy invitro 56 Hình 28 Tế bào LLC nuôi cấy invitro 56 Hình 29 Sự phát triển khối u sơ cấp vị trí tiêm tế bào 58 Hình 30 Hình ảnh quan nội tạng chuột 59 Bảng Khả quét gốc tự dịch chiết Lược vàng 15 Bảng Tác dụng giảm MDA nước ép búp non Lược vàng tren chuột Bảng Số liệu phổ 13C - NMR CF1 CF2 Bảng Khối lượng hiệu suốt thu hồi phần chiết tách từ thân Lược vàng Bảng Số chuột bị chết (con)trong thời gian thí nghiệm tổng số chuột bị gây u 16 41 56 57 Bảng Thể tích khối u sơ cấp (mm3) thời điểm (ngày) Bảng Ảnh hưởng cao chiết nước từ Lược vàng Thanh Hoá 57 58 lên mô bệnh học chuột thí nghiệm Bảng Ảnh hưởng cao chiết Lược vàng đến tiêu huyết học enzyme chức gan, thận 60 I V ẦU N d y, y ,d R y , V N - - y y d , y H H y H Q y , d y y , d , L , L , Callisia fragrans (Lindl) T Woods, ,x x ) L T d N y Mỹ L ặ ởN d y ữ d ỳ y ặ lavonoit N q ,L , , , Mặ d yL d ữ y …t y y ởN y , , N ễ , ổ, d , Vì V y, L d d y q ả ữ d , x : “Nghiên cứu số thành phần hóa học hoạt tính sinh học ƣợc vàng (Callisia fragrans wood, commelinaceae)” M - P -K ả : x yL yL CHƢƠNG T NG QU N 1.1 ặc điểm thực vật họ Thài lài: H T ,d , y Commelinales, ẹở ì ì , ì ả x , , ặ dả , H ặ , , ả ằ d , , , ờ , d , , ũ , y ở , ,ở x xì, é y , , é , ì y ả [1] , Callisia Mỹ, , , , ỹ Võ V H ặ 1.2 ặc điểm chi Callisia, họ Thài lài: N , y T , ởd H T y , dẹ , , ổ , , ặ , d ằ d y ặ h y ặ ặ y Q ả , d é , x T - y ả Mỹ, Â , Australia ữ Chi Callisia y ì ẳ x ả ặ , ặ ặ , ì ặ ặ x Tổ , ễ, , x - , L x ặ ũ , ì y ặ H ì : ặ H , ặ , , T , ằ ẵ , ặ , ặ , , , ặ ì ữ Q ả , , ờ, d , ẹ ặ , Hình 21: Phổ giãn 1H-NMR củaCF2 P ổ 13C-NMR x y Hình 22: Phổ 13C-NMR CF2 51 T ổ H3 y H2 S y H, ổ 13 ổ T x EPT ì ổ EPT T OH , EPT ổ EPT ì y , ; EPT y ởC 68,5; 68,7; 71,2; 77,9; C 206,4 Hình 23: Phổ giãn 13C-NMR CF2 52 Hình 24: Phổ DEPT CF2 T y , ữ ổ CF2 x OH y ì y C 51,7 (C- , H yd x 13 y yd xy T OH 53 t ả NMR C 80,3 -5 Hình 25: Phổ HP C - MS CF2 K ổ CF2 y CF1 ổ y d y ,d x - yd xy [28], CF1 Leuzea carthamoides [8] H y CF2 Hình 26: Cấu trúc hoá học CF2 54 Callisiafragrans H h M ặ tr t d y ằ 20- yd xy dy n y d y 20- yd xy dy d é F ì, ặ é ì F C F g insulin, h nhữ y d F huy , é [21] Ngo 20 - hydroxyecdysone l , ả - yd xy dy ả x y [15] 4.3 Kết nghiên cứu hoạt tính sinh học lƣợc vàng N y y, ả ặ y , , , ặ y N , ì y d ữ , ặ q , ữ , q ổ , ả d T ả ũ Tổ q Y WHO , % y ặ ả y , T y , , y y d ữ d , d d yL Â d “ , T y H d ờ q ả , d N y ả ổ,d V V ặ N T d ,d , , x ổ yL d , ũ y, y ỞN , ” , H ởN y yL N L ữ y 55 , xy , ả , ễ d d [4] T y ả L d d , y d ễ yL , in vitro[25] d ữ N ả yL ữ T V , ặ , y v n ổ ì y , y in vitro in vivo yL * Kết thử khả ức chế khối u chuột gây u thực nghiệm dòng tế bào C ả d y d LL LL L d ổ, y ả T yd d ì y q ả Hình 27 Hình 28 Hình 27 28:Tế bào T y ả Lewis lung carcinoma in vivo H ằ C nuôi cấy in vitro , LL d 95-100% T AL , ì dõ x x q ả , y LL a Kết nghiên cứu khả bảo vệ kéo dài tuổi thọ cho động vật bị u L ợc vàng 56 M ả ả ặ Vì ả é d y, ổ ặ x ả ả y ả L LV d é d T H WE- L y ổ , K q ả ì P yở yở ả Bảng 5:Số chuột bị chết (con)trong thời gian thí nghiệm tổng số chuột bị gây u ô 20 ngày 30 ngày 40 ngày 45 ngày 50 ngày 60 ngày - - WE-LV 0 Doxorubicin 0 T q ảở ả , yở % , L y y T H T y ì y N , % y, T , H y ả ả é d L ổ < , b Kết đ nh gi ph t triển khối u S q ì ì ả y K yở ả ì q ả Bảng Thể tích khối u sơ cấp (mm3) thời điểm (ngày) ô ối chứng Ngày y 69,52± 4,88 y WE-LV Doxorubicin 67,17± 2,97 68,23± 2.85 729,00 ± 88,12 y , ± , , ± , , ± , , ± 90,48 501,50 ± , 695,33 ± , y 28 , ± , , ± y 45 , ± , , ± , 996,00 ± , , ± , , ± , 1482,76± , y 57 , y 88 y , ± , , ± , 2012,08± 69,74 , ± , , ± , 2576,32± 78,98 y - , ± , 3220,00 ± 70,88 y - , ± , 4224,00 ± K q ảở ả d y L T ì H (WE-LV ả , L y T H x y, x , L ả 12000 10000 8000 Đối chứng 6000 Lược vàng Thanh Hóa 4000 Doxorubicin 2000 10 ng ày ng 15 ày ng 20 ày ng 25 ày ng 30 ày ng 35 ày ng 40 ày ng 50 ày ng 60 ày ng ày thể tích u sơ cấp (mm3) H % N y S , ả T < , , % P m , 8,83 ngày Hình 29: Sự phát triển khối u sơ cấp vị trí tiêm tế bào c Kết đ nh gi khả chống di T y ổ , q ả d ơq d ì yở ả K ì q ả ằ q 27 Bảng Ảnh hƣởng cao chiết nƣớc từ ƣợc vàng Thanh Hoá lên mô bệnh học chuột thí nghiệm ô ối chứng ô chuột WE-LV K Gan T K L P ổ Doxorubicin K S S K 58 ì ì (A) (B) (C) (D) Hình 30 Hình ảnh quan nội tạng chuột (A) Gan có u lô uống nước cất;(B) Thận có u lô uống WE-LV; (C) Phổi có u lô uống WE-LV; (D) Gan có u lô đối chứng ả d y L , d , T ổ H x N d d , y y x ơq L T d H d d Kết đ nh gi ảnh h ởng cao chiết L ợc vàng đến c c tiêu huyết học enzyme chức gan, thận N q q , , ả L , 59 , , ổ S y y ch K , y q ả , y ì yở ả Bảng Ảnh hƣởng cao chiết ƣợc vàng đến tiêu huyết học enzyme chức gan, thận ô ối chứng Chỉ tiêu H 12 x WE-LV Doxorubicin 7,33 ± , 8,53 ± , 9,02 ± , /L) 55,54 ± , 28,20 ± , 18,33 ± , /L) 556,0 ± , 562,0 ± Hemoglobin (g/L) 102,33 ± , 125,50 ± , SGOT 235,00 ± , 9 T /L) SGPT 30,33 ± , Creatine 24,33 ± , K q ảở ả 180,67 ± , 27,33 ± , 30,15 ± , ì T y , 23,67 ± , y , ả glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT) glutamic pyruvic transaminase (SGPT) N L , 224,00 ± , y, d d yả zy 60 , 144,00 ± , AL L , 985,00 ± 651,7 ± y d , , , KẾT UẬN yL T Callisia fragrans, ằ L T H (Commelinaceae) , y : 20-hydroxyecdysone (CF x ằ y d y k l ì y kh d P EPT , LL y ả c y y L cao chi é d õ T ổ , in vitro % ễ , d yL in vivo H ả q ả , ổ ả ằ ổ phổ (HPLC - MS) yL (CF2) ổ H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS), phổ s x N ữ ữ q ả y yL 61 d KIẾN NGHỊ VÀ Ề XUẤT L y q ả x ả yL hc y v q ả ễ T y ì ả , yL Vì y, V y , x ữ v d ả ũ ũ yL ễ , L , cao chi ĩ d , 62 ằ v , ỹ ả d TÀI IỆU TH KHẢO A TIẾNG VIỆT Võ V n Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, t p 2, NXB Khoa h Kỹ Thu , H N i N yễ T P ,N yễ T N ,N yễ T , G y ằ L ,T T T , T T ả , d S T L w , A, -624 (2008) , Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, Nxb Y ,H N N yễ V thuốc, x T ,N Y yễ V T , Phương pháp nghiên cứu hóa học ,H N T , T P ,N yễ K P ,N yễ M , K d y L d W d ,T ,T , P H N yễ M N yễ T T H y V K ở, T P ,q y T , P H N ,N , T T , , Nx T P ơ , N d L T ,P N yễ T T , y Hằ , H ả , T , x , + , -57 (2011b) V - Y thuốc từ dược thảo, N , Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý x ả K ĩ , -149 (2006) B TIẾNG NH Andrade-Cetto A, Wiedenfeld H J Ethnopharmacol., 78, 145-149 (2001) Becker H, Scher JM, Speakman JB, Zapp J Fitoterapia., 76, 580-584 (2005) 10 BergmeyerH.U., Bernt E., Methods of Enzymatic Analysis,NewYork Academic Press(1974) 11 , , S , H, , A ; “Hyd xd ”; Physiol Rev.;59, 527–605; (1979) 63 12 Cheel J , T d z ,R d z J., Schmeda-Hirschmann G Agric Food Chem., 53, 2511-2517 (2005) TV, U’ 13 NT, G AI, d R dz Chem Nat Comp., 43, 253-255 (2007) 14 Coelho R.G., Gonzalez F.G., Sannomiya M., Di Stasi L.C., Vilegas W Nat Prod Res.,23, 51-59 (2009) 15 Conforti F, Rigano D, Menichini F, Loizzo MR, Senatore F Fitoterapia 80, 62-67 (2009) 16 Cottiglia F, Loy G, Garau D, Floris C, Casu M, Pompei R, Bonsignore L Phytomedicine.,8, 302-305 (2001) 17 Delporte C., Backhouse N., Erazo S., Negrete R., Vidal P., Silva X., LopsezPé z J L , S F A, M z O, A -anti inflammatory properties of Proustia pyrifplia, Journal of Ethnopharmacology, 99 (1), pp 119-12 (2005) 18 Delporte C., Munoz O., Rojas J., Marisa T., Miguel P., Silvia E., Negrete R., Maldonado S., San Feliciano A., Backhouse N., Pharmaco-toxicological study of Kageneckia oblonga, Rosaceae, 57 (1-2), pp 100-108 (2002) 19 Gallo MB, Vieira PC, Fernandes JB, da Silva MF, Salimena-Pires FR J Ethnopharmacol., 115, 320-322 (2008) 20 H w , ; “A xd z M d y d ”; Biochem Pharmacol.;49, 1341–1348; (1995) 21 H w , ; “H w z xd ”; Free Radic Res Commun.;9, 1–32; (1990) 22 Harborn, J ; “T d d ”; Chapman & Hall; (1994) 23 Le MH, Do TT, Hoang TH, Chau VM, Nguyen TD,Toxicity and anticancer effects of an extract from Selaginellatamariscina on a mice model, Nat Prod Res., 26(12), pp.1130-1134 (2012) 24 Ligo M., Hoshi A, Kadosawa H, Fujigaki M., Antitumor Activity and Metabolism of a New Anthracycline-containing Fluorine (ME2303) in Lewis Lung Carcinoma-bearing Mice, Jpn J Cancer Res, 82(11), pp 1317-132 (1991) 64 25 Lin CN, Kuo SH, Chung MI, Ko FN, Teng CM J Nat Prod Vol 60, 851853 (1997) 26 Liu M, Katerere DR, Gray AI, Seidel V Fitoterapia 2009; '' Phytochemical and antifungal studies on Terminalia mollis and Terminalia brachystemma'' 27 Misin V.M., Sazhina N.N., Content and acititivy of low-molecular antioxidant in juices of medicinal plants, Russian Journal of Physical Chemistry, 4, pp 797-800 (2010) 28 M Bathori, I Mathe, J.-P Girault, H Kalasz, and R Lafont, Isolation and Structural Elucidation of Two Plant Ecdysteroids, Gerardiasterone and 22Epi-20-hydroxyecdysone, J Nat Prod., Vol 61, pp 415-417 (1998) 29 Odontuya G., Hoult J.R., Houghton P.J Phytother Res., 19, 782-786 (2005); '' Optimization and Pharmacological Validation of a Leukocyte Migration Assay in Zebrafish Larvae for the Rapid In Vivo Bioactivity Analysis of Anti-Inflammatory Secondary Metabolites 30 Olennikov D.N., Ibragimov T.A., Zilfikarov I.N., Chelombit'ko V.A Chem Nat Comp., 44, 776-777 (2008) 31 Orhan DD, Aslan M, Aktay G, Ergun E, Yesilada E, Ergun F Life Sci., 72, 2273-2283 (2003) 32 Park H.S., Lim J.H., Kim H.J., Choi H.J., Lee I.S Arch Pharm Res., 30, 161-166 (2007) 33 Rayyan S., Fossen T., Nateland H.S., Andersen O.M Phytochem Anal, 16, 334-341 (2005) 34 Shantanova L.N., Radnayeva D.B., Tsybikova E.N 6, 85-87 (2008) 35 Zhang Y., Tie X., Bao B., Wu X., Zhang Y Br J Nutr., 97, 484-94 (2007) 36 Z SM, G S, M A ,R FH, S EP, F öd Planta Med 2009; '' Bioassay-guided isolation of anti-inflammatory C- glucosylflavones from Passiflora edulis'' 65 ... vàng 1.5.3 Một số chế phẩm từ Lược vàng 10 1.6 Một số nghiên cứu thành phần hóa học lược vàng 11 1.7 Hoạt tính sinh học lược vàng .13 1.8 Giới thiệu số nhóm chất thiên... Thực vật học công dụng Lược vàng 1.4 Điều kiện sinh thái cách trồng 1.5 Một số thuốc từ Lược vàng 1.5.1 Các thuốc từ lược vàng 1.5.2 Các thuốc từ thân lược vàng ... ởN y , , N ễ , ổ, d , Vì V y, L d d y q ả ữ d , x : Nghiên cứu số thành phần hóa học hoạt tính sinh học ƣợc vàng (Callisia fragrans wood, commelinaceae) M - P -K ả : x yL yL CHƢƠNG T NG QU