Khoa Dượ c BM Vi sinh - Ký sinh  CHUYÊN ĐỀ HÊT́ MÔN SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU DƯỢC BẰNG CNSH Tên chuyên đề: VACCIN NGỪA UỐN VÁN  Sinh viên TH: Số thăm: Giảng viên HD: TS Huỳnh Thị Ngọc Lan Ký tên GV chấ m GV chấ m TP.HCM - 2016 Điể m TB Mục lục 1.Tóm tắt 2.Giới thiệu 3.Nội dung 3.1.Quá trình nghiên cứu phát triển vaccin uốn ván hấp phụ 3.2 Phân tích quy trình sản xuất vaccin uốn ván hấp phụ 3.3 Các yêu cầu quy trình kiểm soát chất lượng 3.4 Ý nghĩa qui trình bảo quản 3.5 Hiệu - tác dụng phụ- loại vaccin uốn ván lưu hành thị trường 3.5.1 Hiệu vaccin uốn ván hấp phụ 3.5.2.Tác dụng phụ vaccin uốn ván 3.5.3.Các loại vaccin ngừa uốn ván Kết luận – kiến nghị Tài liệu tham khảo 10 1.Tóm tắt Năm 1924, Descombey đặt móng cho trình sản xuất vaccin phòng ngừa uốn ván [6,8] Và từ đến nay, giới sản xuất loại vaccin khác có chứa thành phần uốn ván để phòng ngừa bệnh uốn ván Trước kia, vaccin uốn ván chủ yếu sản xuất theo phương pháp lên men tĩnh (phương pháp lên men cổ điển) Hiện nay, với tiến phát triển công nghệ sinh học, vaccin uốn ván sản xuất phương pháp lên men động tối ưu hóa điều kiện sản xuất hiệu sản xuất cao nhất.Tại Việt Nam, viện Pasteur Nha Trang sản xuất thành công vaccin ngừa uốn ván để phục vụ nhu cầu tiêm chủng nước 2.Giới thiệu Bệnh uốn ván mô tả từ sớm lịch sử y học Ai Cập, Trung Hoa Hy Lạp với đặc trưng cứng hàm co cứng liên quan đến vết thương [7] Đến năm 1888, Sir William Gowers mô tả bệnh cảnh điển hình uốn ván: “ Uốn ván bệnh hệ thần kinh có đặc điểm co cứng tăng trương lực kéo dài với kịch phát ngắn Co cứng gần cổ hàm gây khít chặt hàm bị thân nhiều chi Khởi phát bệnh cấp tính, tỉ lệ lớn người bệnh phải tử vong” [7] Bệnh uốn ván Clotridium tetani gây nên Dạng hoạt động Clotridium tetani dạng trực khuẩn gram dương, tạo nha bào, di động kị khí tuyệt đối, phát triển tốt nhiệt độ 330C đến 370C Vi khuẩn nhạy cảm với nhiệt tổn có mặt oxy Trực khuẩn uốn ván có mặt khắp nơi, sống hoại sinh ruột người, bò số động vạt nhai lại khác [8].Vào năm 1887, Rosenbach mô tả trực khuẩn có đầu tận chứa bào tử tròn mủ lấy từ người, tiêm dịch tiết mủ cho động vật uốn ván xuất [11] Năm 1889, Shibasaburo Kitasato phân lập Clostridium tetani báo cáo việc trung hòa độc tố kháng thể đặc hiệu [8,11] Trong năm 1890, Tizzoni Cattani, Knud Faber phân tách độc tố uốn ván chứng minh độc tố tác nhân gây bệnh Và năm 1890, Von Behring Kitasato chứng tỏ tiêm chủng chất tinh khiết bất hoạt từ vi khuẩn phòng bệnh uốn ván động vật, lần mô tả miễn dịch chủ động với giải độc tố uốn ván [8,9,11] Trực khuẩn uốn ván sinh hai loại độc tố tetanolysin tetanospasmin, tetanospasmin (còn gọi độc tố uốn ván) độc tố thần kinh mạnh số độc tố vi sinh sau độc tố botulinum [8] Tetanospamin độc tố chịu nhiệt, có tính kháng nguyên mạnh nên đùng để sản xuất vaccin phòng bệnh uốn ván Với đời Chương trình Tiêm chủng mở rộng, việc phòng bệnh uốn ván có nhiều thành công Ở Việt Nam, từ năm 1981 Chương tình Tiêm chủng mở rộng đa triển khai thí điểm Hà Nội Từ năm 1995 đến xã phường nước thực theo chương trình Vaccin uốn ván giúp thể phòng bệnh uốn ván[10] Vaccin có dạng dụng dịch đóng lọ thủy tinh Ngoài đóng sẵn bơm kim tiêm tự khóa [1] Hiện Việt Nam, viện Pasteur Nha Trang sản xuất thành công vaccine uốn ván từ năm 1990 chế tạo thành loại vaccine bạch hầu – uốn ván – ho gà hấp phụ (DTP) vaccine uốn ván hấp phụ (TT) Để hiểu rõ vaccin uốn ván quy trình sản xuất vaccin uốn ván, chuyên đề nhằm mục tiêu:  Giới thiệu lịch sử sản xuất vaccin uốn ván  Quy trình sản xuất vaccine uốn ván  Ý nghĩa quy tình kiểm soát chất lượng bảo quản vaccine uốn ván  Các loại vaccin chứa thành phần uốn ván 3.Nội dung 3.1.Quá trình nghiên cứu phát triển vaccin uốn ván hấp phụ Vaccin ngừa uốn ván chứa vô độc tố vi khuẩn uốn ván chế tạo cách xử lý độc tố uốn ván với formalin sau thường sử dụng phương pháp hấp phụ Năm 1923, Gaston Ramon thông báo việc thêm formol vào độc tố bạch hầu điều kiện định để chuyển thành “giải độc tố” độc tính khả sinh miễn dịch, hai năm sau ông làm với độc tố uốn ván [8] Năm 1924, Descombey chế giải độc tố uốn ván tính hiệu việc tạo miễn dịch chủ động chứng minh chiến tranh Thế giới thứ hai đặt móng cho việc sản xuất giải độc tố uốn ván làm vaccin phòng uốn ván [6,8] Từ 1944 đến năm 1960, việc sản xuất độc tố uốn ván chủ yếu sử dụng phương pháp lên men tĩnh hay gọi phương pháp cổ điển Người ta nuôi cấy vi khuẩn uốn ván bình thủy tinh miệng rộng với môi trường kỵ khí thích hợp Các chai nuôi cấy đặt tủ ấm phòng ấm 36oC - 37oC Sau thời gian định ( thường 4-5 ngày, có tác giả để 8-14 ngày đến lúc tế bào ly giải ) độc tố giải phóng vào nước môi trường nuôi cấy, thu nhận độc tố phương pháp lọc [2,8] Năm 1947, Raynaud đưa khái niệm "canh khuẩn non" ( 1-3 ngày nuôi cấy ) canh khuẩn chủ yếu chứa tế bào chưa bị ly giải, lượng độc tố nằm tế bào Năm 1951, Raynaud đề xuất phương pháp trích chiết độc tố tế bào uốn ván cách cưỡng ly giải canh khuẩn non Ông tập trung vi khuẩn cách ly tâm "canh khuẩn non" giữ chúng dung dịch muối ( NaCl 1M + Na2CO3 0,1M ) 4oC/4 ngày, sau để 35oC/2 ngày Ly tâm lấy nước xác định Lf/ml phản ứng lên Độc tố thu theo phương pháp Raynaud có tác dụng gây miễn dịch ngựa tạo kháng thể Phương pháp số phòng thí nghiệm ứng dụng sản xuất độc tố lúc Về sau phương pháp vừa dùng để xác định độc tố tế bào vừa so sánh lượng độc tố có nước ( tế bào ) dùng để tìm thời gian nuôi cấy tối ưu thu nhận độc tố cao Năm 1955, ông xác định lượng độc tố cực đại tế bào nước thời gian nuôi cấy khác tùy thuộc vào số lần cấy truyền chủng [2,8] Từ năm 1970 trở lại với phát triển công nghệ sinh học, người ta nghiên cứu ứng dụng rộng rãi phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván nồi lên men với điều kiện kiểm soát dùng thiết bị rung tạo cho vi khuẩn phân tán môi trường lỏng, dùng khí nén thổi qua bề mặt canh cấy để loại khí H2S sinh trình nuôi cấy (phương pháp nuôi cấy đồng hay gọi phương pháp nuôi cấy động homogeneous culture) [2,8] Sirks ( 1956 ) Van Hemert (1962) người phát triển phương pháp nuôi cấy đồng ( homogeneous ) nồi lên men lít thép không rỉ, thu nhận lượng độc tố đáng khích lệ Đầu tiên người ta dùng khí thổi qua bề mặt, khuấy nhẹ để tạo phân tán vi khuẩn với cân nhắc không để oxy khuếch tán vào môi trường gây ức chế vi khuẩn phát triển Về sau nhiều nghiên cứu tiếp tục phát triển nồi lên men lớn : nồi thủy tinh 50lít, nồi thép không rỉ nhiều kích cỡ tới 1000 lít Năm 1967, Van Wezel so sánh hiệu lên men hai phương pháp thấy với phương pháp nuôi cấy đồng (homogeneous ) cho hiệu giá Lf/ml gấp đôi phương pháp nuôi cấy tĩnh (static culture) [2,8] Tại Việt Nam từ năm 1986 trở trước áp dụng sản xuất vacxin uốn ván theo phương pháp nuôi cấy cổ điển Hiện nay, vaccin uốn ván sản xuất phương pháp lên men Năm 1990, viện Pasteur Nha Trang sản xuất thành công vaccin DPT năm 2002 sản xuất thành công vaccin TT 3.2 Phân tích quy trình sản xuất vaccin uốn ván hấp phụ Các bước sản xuất vaccin uốn ván: Nuôi cấy  Chủng sản xuất: Clostridium tetani có độc tính cao, biết rõ nguồn gốc, lịch sử chủng  Môi tường nuôi cấy: casein lỏng bổ sung chiết xuất nấm men, điều kiện kị khí  Xác định hàm lượng độc tố Lf/ml phản ứng lên Hấp phụ độc tố làm bất hoạt  Hấp phụ độc tố vi khuẩn nhôm hydroxyd  Bất hoạt formalin tạo vô độc tố, hấp phụ lại nhôm hydroxyd  Kiểm tra hiệu tạo đáp ứng miễn dịch Tinh chế  Giải độc tố uốn ván tinh chế để loại thành phần gây phản ứng phụ cho người  Bất hoạt formalin Giải độc tố uốn ván tinh chế sau sử dụng để sản xuất vaccin bán thành phẩm vaccin thành phẩm Vaccin uốn ván hấp phụ sản xuất dạng nước dạng đông khô.Vaccin dạng nước dạng đông khô sản xuất giống tất bước quy trình sản xuất Chỉ khác bước cuối cùng: vaccin dạng nước sau bảo quản nhiệt độ 20C – 80C, sẵn sàng cho sử dụng; vaccin dạng đông khô: vaccin sau hoàn thành dạng nước tiếp tục trải qua trình đông khô Hình 3.1: Sơ đồ quy trình sản xuất vaccine mẫu chuẩn Viện Pasteur Nha Trang Nguồn: Luận văn nghiên cứu sản xuất vaccin mẫu chuẩn quốc gia bạch hầu – uốn ván – ho gà [5] Hình 3.2 Sơ đồ đông khô vaccin Nguồn: Luận văn nghiên cứu sản xuất vaccin mẫu chuẩn quốc gia bạch hầu – uốn ván – ho gà [5] 3.3 Các yêu cầu quy trình kiểm soát chất lượng Kiểm soát chất lượng vaccin nhằm đảm bảo hiệu độ an toàn lô sản xuất [4] Quy trình kiểm soát chất lượng:  Kiểm soát trình  Kiểm soát sản phẩm cuối  Yêu cầu chất lượng phù hợp cho nguyên liệu sản xuất ban đầu, trung gian, sản phẩm cuối phương pháp xử lí Các yêu cầu kiểm soát chất lượng [4]  Độ vô trùng: nhằm phát tác nhân ngoại lai vi sinh vật sống nhiễm vào sản phẩm Thử nghiệm độ vô trùng thục nhiều giai đoạn trình sản xuất  Tính an toàn: xác định độc tính bất thường vaccin tiến hành chuột nhắt trắng  Xác định hàm lượng nhôm: hàm lượng nhôm vaccin không vượt 1,25 mg Al3+/ liều tiêm cho người  Xác định hàm lượng formaldehyde: lượng formaldehyde không vượt 0,02%  Độ ẩm tồn dư (vaccin đông khô) 3.4 Ý nghĩa qui trình bảo quản Qui trình bảo quản vaccin có ý nghĩa quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu độ ổn định vaccin Vắc xin bảo quản nhiệt độ từ 2-80C Khi bảo quản điều kiện quy định vắc xin giữ công hiệu năm kể từ ngày chuẩn độ công hiệu [] Nếu để lắng lọ vắc xin TT thời gian dài, lọ vắc-xin chia thành phần dung dịch phần lắng cặn đáy lọ Do phải lắc kỹ trước sử dụng Vắc-xin TT/DT/Td/DPT không để đông băng Nếu vắc-xin bị đông băng phải hủy bỏ [3] 3.5 Hiệu - tác dụng phụ- loại vaccin uốn ván lưu hành thị trường 3.5.1 Hiệu vaccin uốn ván hấp phụ Vaccin uốn ván dùng để phòng ngừa bệnh uốn ván sử dụng Chương tình tiêm chủng mở rộng Đối tượng Chương trình trẻ em phụ nữ có thai phụ nữ độ tuổi 15 – 35 số vùng trọng điểm.Ngoài vaccin uốn ván dùng phòng ngừa cho đối tượng nguy cao (cứ sau – 10 năm tiêm nhắc lại liều phòng bệnh uốn ván xuốt đời):  Người làm vườn  Người làm việc trang trại, nông trường chăn nuôi gia súc, gia cầm  Người dọn vệ sinh, cống rãnh, chuồng trại…  Công nhân xây dựng công trình  Bộ đội niên xung phung  ván cho trẻ lớn – 16 tuổi Vắc xin TT Td tiêm cho phụ nữ có thai không bảo vệ bệnh uốn ván cho mẹ mà phòng uốn ván sơ sinh cho Sau tiêm vắc xin TT Td, kháng thể hình thành truyền cho thai nhi để bảo vệ cho trẻ sinh sau vài tháng Đồng thời kháng thể phòng uốn ván cho bà mẹ Ba liều vắc xin TT Td có khả phòng uốn ván cho bà mẹ uốn ván sơ sinh năm Nếu tiêm liều phòng uốn ván suốt thời kỳ sinh đẻ 3.5.2.Tác dụng phụ vaccin uốn ván Những vắc-xin có chứa thành phần uốn ván thường phản ứng nhẹ, gây phản ứng nặng Có khoảng 1/10 trường hợp sau tiêm – ngày có biểu đau nhẹ, mẩn, nóng sưng tấy nhẹ chỗ tiêm Những phản ứng nhẹ trở nên phổ biến lần tiêm sau gặp 50% đến 80% người tiêm nhắc lại Khoảng 1/10 trường hợp tiêm có biểu sốt nhẹ sau tiêm 3.5.3.Các loại vaccin ngừa uốn ván [8] Vaccin TT ( giải độc tố uốn ván hấp phụ): có tác dụng phòng bệnh uốn ván bệnh uốn ván sơ sinh, sử dụng cho người lớn, phụ nữ có thai, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ, người lớn có nguy cao Vaccin DPT (bạch hầu – ho gà – uốn ván hấp phụ) phòng bệnh bạch hầu, ho gà, uốn ván cho trẻ tuổi (vaccin có thành phần Ho gà toàn tế bào) Vaccin DTaP (bạch hầu – ho gà – uốn ván tinh chế, hấp phụ): phòng bạch hầu, uốn ván, ho gà cho trẻ em tuổi (chứa thành phần Ho gà tinh chế) Vaccin DT (bạch hầu – uốn ván): phòng bệnh bạch hầu, uốn ván dùng tiêm cho trẻ tuổi Vaccin Td (bạch hầu – uốn ván giảm liều, hấp phụ): phòng bệnh bạch hầu, uốn ván Kết luận – kiến nghị Vaccin uốn ván sản xuất lâu đời giới Việt Nam có Viện Pasteur Nha Trang sản xuất thành công loại vaccin chứa thành phần uốn ván DPT TT để cung cấp phục vụ cho Chương trình tiêm chủng mở rộng quốc gia nhu cầu phòng ngừa bệnh uốn ván nước Kiến nghị Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vaccin nghiêm ngặt để tránh tối đa phản ứng có hại xảy tiêm phòng vaccin Cần thêm nhiều nghiên cứu tính an toàn độ ổn định vaccin có chứa thành phần uốn ván thời gian bảo quản Những nghiên cứu để sản xuất vaccin có chứa thành phần uốn ván (ngoài hai vaccin DPT TT viện Pasteur Nha Trang) để phục vụ đủ nhu cầu tiêm phòng nước Tài liệu tham khảo [1] http://www.nidqc.org.vn/duocthu/vaccin-uon-van.html [2] http://www.ykhoa.net/duoc/vacxin/vaccin_05122223.htm [3] Bộ Y Tế, Hướng dẫn bảo quản vaccin, Quyết định số 1730/QĐ-BYT ngày 16/5/2014 [4] PGS.TS Trần Cát Đông Sản xuất nguyên liệu dược công nghệ sinh học 2015, trang 93 [5] GS.PTS Nguyễn Thị Kê, Luận văn nghiên cứu sản xuất vaccin mẫu chuẩn quốc gia bạch hầu – uốn ván – ho gà, Đề tài cấp bộ, Bộ Y Tế 1999, trang 17 [6] Bhatia R., Prabhakar S., Grover V.K (2002) Tetanus Neurol India, 2002 p398-407 [7] Bleck T.P., Brauner J.S (1997) Infections of the Central Nervous System Scheld W.M., Whitley R.J., Durack D.T eds 2nd Ed Raven Press, New York, p629-653 [8] Centers for Disease Control and Prevention (2006) In Atkinson, W; Hamborsky, J; McIntyre, L; et al Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases (The Pink Book) (10th ed.) p341- 352 [9] Nathan B.R., Bleck T.P (1999) Tropical Infectious Diseases: Principles, Pathogens & Practice Guerrant R.L., Walker D.H., Weller P.F (eds) Churchill Livingstone, p517-526 [10] "Tetanus vaccine: WHO position paper" Weekly epidemiological record 20 (81): 197–208 May 19, 2006 [11] Weinstein L.L., Harrison R.E., Cherry J.D (1999) Textbook of Pediatric Infectious Diseases 4th Ed., Vol W.B Saunders, p 1577-1587 10 ... trình sản xuất vaccin phòng ngừa uốn ván [6,8] Và từ đến nay, giới sản xuất loại vaccin khác có chứa thành phần uốn ván để phòng ngừa bệnh uốn ván Trước kia, vaccin uốn ván chủ yếu sản xuất theo... công vaccine uốn ván từ năm 1990 chế tạo thành loại vaccine bạch hầu – uốn ván – ho gà hấp phụ (DTP) vaccine uốn ván hấp phụ (TT) Để hiểu rõ vaccin uốn ván quy trình sản xuất vaccin uốn ván, chuyên... thiệu lịch sử sản xuất vaccin uốn ván  Quy trình sản xuất vaccine uốn ván  Ý nghĩa quy tình kiểm soát chất lượng bảo quản vaccine uốn ván  Các loại vaccin chứa thành phần uốn ván 3.Nội dung