ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh bước đầu điều tra dịch tễ bệnh mycoplasma gallisepticum gà Nhữ Văn Thụ, Võ Văn Sự Bộ môn Động vật quí Đa dạng sinh học - Viện Chăn Nuôi Tiểu đề tài thuộc Đề tài KHCN-0203 - Trình bày Hội nghị nghiệm thu cấp nhà nước Đề tài 13/6/2001 Viện Thú y Đặt Vấn Đề Bệnh mycoplasma bệnh nguy hiểm gia cầm đa gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm Những chủng mycoplasma gây bệnh nhiều MG, MS, MI, MM Chủng MG MS gây cho gà gà tây hai chủng MI MM gây bệnh cho gà tây Để chẩn đoán bệnh người ta thường dùng phản ứng huyết học, nhiên, chủng thường phản ứng chéo không đặc hiệu Các kháng nguyên đặc hiệu cho chủng sãn thị trường Gần kỹ thuật sinh học phân tử ví dụ kỹ thuật khuyếch đại ADN phòng thí nghiệm (PCR), ADN dò kỹ thuật đa hình độ dài đoạn phân cắt (RFLP) áp dụng để xác định chủng mycoplasma (Fan cộng 1995) dùng để chẩn đoán bệnh này(Nacimento cộng 1991, 1993) Các tác giả cho phương pháp nhân gen chẩn đoán nhậy phát ADN mầm bệnh nhỏ khoảng 10 pg Zhao Yamamoto (1993) dùng pg ADN để chẩn đoán Mycoplasma iowae Lauerman cộng sự., (1993) tiến hành nghiên cứu 122 nhóm số liệu nhận xét PCR phương pháp nhậy đặc trưng so sánh với phương pháp nuôi cấy tế bào, huyết thanh( phản ứng huyết thanh, ức chế PHA, ELISA), dịch tễ lịch sử bệnh Kempf cộng sự., (1994) tiến hành nghiên cứu chẩn đoán bệnh nhận xét PCR phương pháp nhậy, đặc trưng, nhanh không dùng đồng vị phóng xạ để chẩn đoán M.gallisepticum Một số tác giả giới nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR để phát triển thành kit chẩn đoán để chẩn đoán mầm bệnh Trình tự chuỗi 16s rRNA chủng mycoplasma xác định để phân tích phát triển giống loài chúng để thiết kế cặp mồi chung cho chủng cặp môì đặc hiệu chủng loài Trong nghiên cứu tiến hành thí nghiệm lại để xác định độ nhạy hoàn thiện khâu kỹ thuật phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh mycoplasma gia cầm Các phương pháp khác nuôi cấy, phản ứng huyết học áp dụng để khẳng định thêm kết đạt qua phương pháp PCR 2.1 Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Xác định chủng gây bệnh độ nhạy phương pháp PCR Mẫu nghiên cứu mẫu Mycoplasma phân lập môi trường nuôi cấy từ bệnh phẩm mẫu mẫu lấy trực tiếp từ đường hô hấp gà mang mần bệnh 20 mẫu Mẫu phân lập từ gà ốm trung tâm chẩn đoán Thú Y môi trường PPLO có bổ sung huyết lợn tươi, toàn thủ tục nuôi cấy mô tả "Thông tin khoa học kỹ thuật chăn nuôi, Viện chăn nuôi, trang 10, số năm 1999" 2.1.1 Phương pháp tách ADN Bước 1: Cho vào 150 ml dd phá tế bào, lắc máy lắc Bước 2: Cho vào 100 ml dd kết tủa Protein, lắc mạnh đến hỗn hợp ống trở lên đặc quánh, nhày Bước 3: Ly tâm 16.000 vòng phút Chuyển phần vào ống có chứa 300 ml dd 2-Propanol, lắc nhẹ, đảo dung dịch không nhìn thấy ADN kết tủa Ly tâm 16.000 vòng phút Bước 4: Loại bỏ phần rửa hai lần dung dịch cồn 70% Bước 5: Làm khô kết tủa hoà tan 50 ml dd TE, bảo quản -20oC 2.1.2 Phương pháp phân tích xác định chủng mycoplasma kỹ thuật giải trình tự.(Thí nghiệm tiến hành phòng thí nghiệm Sinh học phân tử CIRAD-EMVT Cộng hoà Pháp) Các bước tiến hành: Tách ADN từ khuẩn lạc phân lập ADN từ bệnh phẩm trực tiếp Nhân đoạn gene 16S rARN Mycoplasma (745 cặp ba zơ) Chèn đoạn gen vào plasmid PGEMT mở sãn gồm: 30-90 ng ADN -PCR Đệm ml Ligase enzyme ml H2O 20 ml PGEMT ml ủ 16oC 30 phút ml Biến nạp vào vi khuẩn Epicurial coli.( theo thủ tục Stragene) - Plasmid tái tổ hợp( thu từ bước 3) để đá - 20 ml Epicurial coli ủ 42oC 45 giây - Sau ủ, để đá phút, cho vào 280 ml dd SOC, ủ 370C giờ, sau chuyển sang nuôi cấy môi trường chọn lọc Chọn lọc khuẩn lạc có chứa Plasmid tái tổ hợp, chọn lọc khuẩn lạc điển hình, nuôi tăng số lượng Tách plasmid, sử sụng quy trình tinh miniprep PCR - sequencing Xác định trình tự máy giải trình tự tự động Perkin Elmer 377 Phân tích kết phần mềm ADNsis - HITACHI so sánh với ngân hàng liệu (GENE-BANK) 2.1.3 Xác định độ nhạy phương pháp PCR Xác định điều kiện phản ứng thích hợp với nồng độ chất tham gia phản ứng, loại mồi thiết kế nhiệt độ bắt cặp mồi khác Dùng ADN mycoplasma tinh sạch, đo nồng độ máy quang phổ tử ngoại UVvis sau pha loãng với độ pha loãng 10 lần, xác định nồng độ thấp mà phản ứng cho kết dương tính Sau đo máy UVvis, nồng độ ADN tính công thức M = ABS x n x 50 Trong M nồng độ ADN (ng/ml), ABS giá trị mật độ quang đo bước sóng 260nm, n độ pha loãng ADN lúc đo - cặp mồi thiết kế vùng gen 16s rARN Mycoplasma gallisepticum sau thử để tìm cặp mồi thích hợp 2.1.4 Kiểm tra gà nuôi đối tượng bệnh phẩm khác Sau có kết xác định chủng gây bệnh, độ nhạy PCR, điều kiện thích hợp, tiến hành mẫu gà trực tiếp Đối với loại bệnh phẩm khác khâu tiền sử lý mẫu khác cuối dùng kit tách ADN Promega Mẫu phân tích bao gồm: 200 mẫu dịch mũi gà 35 mẫu chuồng 30 mẫu phôi gà 10 mẫu nước uống o Với mẫu dịch dỉ mũi gà sử lý theo Silveria 1996 có cải tiến kết hợp với thủ tục hãng Promega: Mẫu lấy trực tiếp lấy tăm bông, ngoáy vào họng gà, cho vào ống eupendof có chứa 500 ml PBS Để 4oC qua đêm, nhấc que ra, điều chỉnh lại 500 ml PBS Ly tâm 16.000 v/ phút/5 phút Loại bỏ phần dung dịch phía sau sử lý theo bước mô tả phần 2.2 o Với mẫu chất độn chuồng: Hoà tan vào ống 10 ml dd PBS, ngoáy đều, chuyên phần sang ống mới, ly tâm 13.000 vòng 10 phút Bỏ phần dịch Phần lắng cặn sử lý phần 2.2 o Với mẫu phôi lấy nước ối lòng đỏ: Nghiền lòng đỏ với dịch nước ối với dung dịch PBS sau lấy phần dung dịch ly tâm xử lý phần 2.2 Tiến hành nhân gen, phân tích gen theo điều kiện bước 3.1 Kết nghiên cứu thảo luận Kết giải trình tự Sau có kết phân tích trình từ gen, tiến hành phân tích so sánh ngân hàng liệu gen (gene bank) kết trình bày bảng Bảng 1: Kết xác định chủng Mycoplasma kỹ thuật giả trình tự Chủng M.gallinarum M.gallisepticum Nhiễm hai Mẫu từ môi trường 10 nuôi cấy (n=10) 0 Mẫu từ bệnh phẩm (n=20) 14 12 Kết cho thấy, hai loại mẫu phân tích, mẫu nuôi cấy phân lập khuẩn lạc thấy M.gallinarum mẫu từ bệnh phẩm lấy trực tiếp có thêm M.gallisepticum Nguyên nhân tượng môi trường nuôi cấy không thích hợp cho M.gallisepticum M.gallinarum dễ mọc mọc át M.gallisepticum Chủng gây bệnh gia cầm chủ yếu chủng M.gallisepticum gây chủng M.gallinarum không gây bệnh Do ta cần ý tới tỷ lệ nhiễm M.gallisepticum Kết phân tích chương trình (phần mềm) ADNsis cho thấy mồi RP5 FP2 nhân lên đoạn gen 745 cặp ba zơ M.gallisepticum 737 cặp ba zơ M.gallinarum khó phân biệt điện di agarose Gữa hai chủng hai vùng thiết kế mồi khác cặp ba zơ trình tự nucleotide vùng nhân lên hai chủng khác sử dụng enzyme giới hạn để phân biệt chủng Trong số enzyme RsaI (nhận biết trình tự GTAC) thích hợp cắt đoạn gene M.gallisepticum vị trí M.gallinarum vị trí tạo vạch điện di đồ khác biệt dễ phân biệt Nếu M.gallisepticum tạo vạch 401 cặp ba zơ 143 cặp ba zơ 123 cặp ba zơ 78 cặp ba zơ Nếu M.gallinarum tạo vạch 538 cặp ba zơ 199 cặp ba zơ Giếng 8,9 11 điện di đồ Và mẫu có lẫn chủng tạo kết hợp vạch Do phân biệt hai chủng mycoplasma PCR RFLP 3.2 Xác định độ nhạy phương pháp PCR Dựa cặp mồi thiết kế tổng hợp, thấy cặp mồi RP5, FP2 cho kết rõ nhất, chiều dài đoạn gen sau nhân 745 cặp ba zơ điều kiện phản ứng sau: Mg +2 2,5 mM Primers 200 pg loại dNTP 250 mM loại Taq-Pol (Taq-gold) 2UI Đệm PCR 5ml Mẫu ADN 5ml H2O cho đủ tới 50ml Chu kỳ điều kiện phản ứng 94oC 12 phút 94 oC 30 giây 55oC phút 35 chu kỳ 72oC phút 72oC 10 phút Độ nhạy phản ứng xác định phần phương pháp nghiên cứu Phản ứng cho kết dương tính phát nồng độ 6.10-2 pg ADN, theo Blanchard cộng 1995 nồng độ tương ứng với 50 CFU (~50 organisms) phản ứng Độ nhạy tương đối cao ảnh ảnh Kết xác định độ nhạy PCR Nồng độ trước phản ứng theo thứ tự là:600;60;6;0,6;0,06;0,006 pg;M; DC+ 3.3 ảnh Kết kiểm tra Kết qủa kiểm tra mẫu Dựa vào kết xác định lựa chọn điều kiện thích hợp cho phản ứng PCR tiến hành lấy 200 mẫu dịch họng gà, 35 mẫu chất độn chuồng, 30 phôi gà 14 ngày tuổi, 10 mẫu nước uống Kết nghiên cứu trình bày bảng ảnh Bảng 2: Kết xác định chủng mycoplasma loại mẫu Mẫu nghiên cứu Số lượng Phương pháp PCR mẫu Phương pháp SPA* M.gallisepticum M.gallinarum + % + % + % Mẫu dịch họng 130 Gà lương phượng 79 66,0 50 38.46 38 31.7 Mẫu dịch họng 70 Gà Tam Hoàng 45 64,3 30 42.8 30 42.8 Nước uống 10 - 0 - - Nền chuồng 35 18 51,43 14.3 - - Phôi gà 30 10.0 0 - - *SPA: phương pháp ngưng kết phiến kính Mẫu dịch họng: Kết cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh mycoplasma xác định phương pháp PCR cao rõ rệt (ở mức sác xuất p