Quy trình nuôi cây và ứng dụng gốc

2 857 1

An An Gửi tin nhắn Báo tài liệu vi phạm

Tải lên: 10,098 tài liệu

  • Loading ...
1/2 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 10/10/2012, 11:45

MSC là tế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá thành rất nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau như xương, sụn, thần kinh, gan, mỡ…khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích h QUY TRÌNH NUÔI CẤY ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI1. Giới thiệu tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell – MSC) MSC là tế bào gốc đa năng, chúng có khả năng biệt hoá thành rất nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau như xương, sụn, thần kinh, gan, mỡ…khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp. Máu cuống rốn người chứa một nguồn MSC dồi dào. Do đó ta có thể thu nhận nuôi cấy MSC để biệt hóa thành những tế bào chức năng khác phục vụ cho y học, thẩm mỹ…2. Quy trình 2.1 Thu nhận máu cuống rốn Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV… ngay sau khi thai nhi được sinh ra bằng các túi thu máu có chứa sẵn chất chống đông. Sau đó bảo quản lạnh trong đá gel đưa về phòng thí nghiệm. Thời gian từ khi thu nhận máu đến khi thao tác trong vòng 2 giờ. 2.2 Nuôi cấy sơ cấp tế bào của máu cuống rốn: Chọn lọc MSC Về nguyên tắc, máu cuống rốn có chứa ba loại tế bào: tế bào gốc tạo máu, tế bào máu trưởng thành MSC. Tế bào gốc tạo máu MSC thuộc quần thể tế bào đơn nhân do đó ta thu nhận bằng phương pháp ly tâm trên gradient nồng độ Ficoll-paque (sigma) ở tốc độ 2500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau khi ly tâm, thu nhận phân đoạn tế bào đơn nhân nằm giữa lớp Ficoll-paque lớp huyết tương bên trên. Trong quá trình ly tâm, các tế bào đã biệt hóa với kích thước lớn hơn sẽ di chuyển xuyên qua lớp Ficoll lắng xuống đáy ống ly tâm. Các tế bào hồng cầu không nhân, do nhẹ sẽ nằm ở lớp huyết tương bên trên. Các tế bào đơn nhân với kích thước trung bình sẽ luôn nằm ở giữa. Do MSC khi nuôi cấy sẽ bám dính vào bề mặt giá thể, trong khi tế bào gốc tạo máu không có khả năng này nên ta sẽ dùng phương pháp nuôi cấy để tách MSC ra khỏi tế bào gốc tạo máu trong quần thể tế bào đơn nhân. Sau khi thu được lớp tế bào đơn nhân, ta huyền phù lớp tế bào này trong môi trường nuôi cấy IMDM, 10% FBS nuôi trong bình nuôi cấy (Nunc, 25 cm2) sao cho đạt mật độ 3.105 tế bào/cm2 ở điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48 giờ, các MSC bắt đầu bám dính trên bề mặt môi trường nuôi, thay môi trường để loại bỏ các tế bào không bám bao gồm các tế bào chết các tế bào gốc tạo máu. Tiếp tục nuôi cho đến khi tế bào mọc đạt tỷ lệ 70-80% bề mặt đáy bình nuôi. Thường xuyên theo dõi thay môi trường với chế độ 7 ngày/lần. 2.3 Nuôi cấy thứ cấp: cấy chuyền tăng sinh MSC Khi mật độ tế bào trong bình đạt tỉ lệ 70-80% diện tích đáy bình nuôi, ta tiến hành cấy chuyền để cung cấp chất dinh dưỡng không gian sống cho tế bào. Quy trình cấy chuyền như sau: loại bỏ môi trường cũ rửa tế bào với 4-5 ml PBSAcó bổ sung gentamycin (10 μg/ml) hai lần. Tiếp tục loại bỏ dịch rửa bổ sung 4-5 mltrypsin/EDTA 0,05%. Sau 15 giây, tiến hành đổ bỏ dung dịch enzyme nhưng vẫn giữ lại khoảng 1 ml tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, từ 2-3 phút. Sau đó, lắc nhẹ bình nuôi cấy để tách tế bào ra khỏi bề mặt đáy. Khi tế bào co tròn tách ra khỏi bề mặt bình nuôi, phải trung hòa trypsin thừa bằng 10-11 ml môi trường IMDM 10% FBS. Huyền phù tế bào đó được chia đều cho 3 bình nuôi mới. Sau khi cấy chuyền từ 5-7 lần, kiểm tra độ tinh sạch, tạo nồng độ thích hợp để tiến hành biệt hóa in-vitro.3. Ứng dụng Thu nhận nuôi cấy MSC để biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác như: xương, sụn, thần kinh, gan, mỡ…khi được nuôi trong môi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp. . QUY TRÌNH NUÔI CẤY VÀ ỨNG DỤNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI1. Giới thiệu tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem. bình nuôi, ta tiến hành cấy chuyền để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian sống cho tế bào. Quy trình cấy chuyền như sau: loại bỏ môi trường cũ và rửa
- Xem thêm -

Xem thêm: Quy trình nuôi cây và ứng dụng gốc, Quy trình nuôi cây và ứng dụng gốc, Quy trình nuôi cây và ứng dụng gốc

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn