Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

74 995 5
Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Viêm dạ dày là một bệnh lý tƣơng đối rõ ràng, là hậu quả của sự kích thích niêm mạc bởi các yếu tố ngoại sinh hoặc nội sinh. Viêm dạ dày chủ yếu gây ra bởi tác nhân nhiễm khuẩn và các rối loạn miễn dịch, bệnh tự miễn và rất nhiều nguyên nhân khác. Helicobacter pylori đƣợc biết đến nhƣ là một nguyên nhân chính hay thủ phạm của bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và là yếu tố đƣợc công nhận nhiều nhất gây ung thƣ dạ dày, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển. Helicobacter pylori đƣợc phát hiện bởi Warren và Marhall (Úc) năm 1982. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng Helicobacter pylori là một yếu tố quan trọng gây bệnh tiền ung thƣ dạ dày và ung thƣ dạ dày. Ngƣời nhiễm Helicobacter pylori tăng nguy cơ ung thƣ dạ dày gấp 6 lần so với ngƣời bình thƣờng. Helicobacter pylori làm giảm khả năng tiết ra dịch của dạ dày, làm cho dạ dày dễ bị tác động bởi axit và gây loét dạ dày, đồng thời tạo điều kiện cho các vi khuẩn non- Helicobacter pylori ƣa kiềm có khả năng chuyển hóa nitrite thành các chất tiền ung thƣ. Nhiễm Helicobacter pylori - căn nguyên các bệnh dạ dày của hơn 70% ngƣời Việt Nam gây ảnh hƣởng đến khả năng lao động cũng nhƣ chất lƣợng sống của ngƣời lao động. Ngƣời lao động bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori vì những lý do nhƣ môi trƣờng sống thiếu vệ sinh, tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm không bảo đảm. Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng nhƣ ở nhiều nơi trên thế giới, các bệnh dạ dày liên quan đến Helicobacter pylori đã và đang đƣợc điều trị nhờ sử dụng phác đồ chống tiết và kháng sinh. Tuy vậy, trên thực tế các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã xuất hiện, làm giảm hiệu lực diệt tr của thuốc và do đó nhiều bệnh nhân đƣợc điều trị nhƣng không khỏi hoặc điều trị không triệt để. Theo Nguyễn Văn Thịnh (năm 2007), Amoxicillin và Clarithromycin là những2 kháng sinh đƣợc sử dụng thƣờng xuyên trong điều trị diệt Helicobacter pylori, nhƣng t khoảng năm 2010, tỷ lệ các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã lên tới 23,7%, cao hơn nhiều lần so với các nƣớc Châu Âu, Mỹ, Tây Á, Hồng Công, Nhật Bản và cao hơn một chút so với Hàn Quốc. Các nghiên cứu nói trên đƣợc tiến hành chủ yếu ở các thành phố công nghiệp lớn nhƣ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh. Tại Hải Dƣơng, Helicobacter pylori đƣợc chẩn đoán là có trong dạ dày ngƣời bệnh dựa trên hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy Helicobacter pylori t dịch tiêu hóa, làm test Urease để phát hiện Helicobacter pylori. Nuôi cấy Helicobacter pylori t mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tƣơng đối dài và khi các vi khuẩn bội nhiễm non - Helicobacter pylori đi kèm làm cho việc phân tích trở nên khó khăn hơn. Mặt khác, cho tới nay vẫn chƣa có một nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm Helicobacter pylori và khả năng kháng thuốc của Helicobacter pylori trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. Do đó, ứng dụng các kỹ thuật y sinh học hiện đại nhƣ PCR để phát hiện nhanh và chính xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định tính kháng kháng sinh của chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị bệnh viêm dạ dày ở các bệnh viện tuyến tỉnh nói chung và ở một số bệnh viện tuyến huyện tại Hải Dƣơng là rất cần thiết trong việc nâng cao hiệu quả điều trị bệnh, qua đó góp phần giảm tải cho các bệnh viện tuyến trung ƣơng. Xuất phát t ý nghĩa lý luận và thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng bằng kỹ thuật sinh học phân tử”. 2. Mục đích nghiên cứu. 2.1. Mục tiêu chung. Góp phần trong chẩn đoán và điều trị viêm dạ dày ở bệnh nhân nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori đồng thời có giải pháp định hƣớng kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh này tại tỉnh Hải Dƣơng.3 2.2. Mục tiêu cụ thể. - Đánh giá đƣợc thực trạng nhiễm Helicobacter pylori và Helicobacter pylori kháng thuốc ở các bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. - Bƣớc đầu đƣa một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. 3. Nội dung của đề tài - Phân tích dịch tễ học đánh giá thực trạng bệnh nhân viêm dạ dày do đang điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Hải Dƣơng. - Phân tích đoạn gen 16S rRNA của Helicobacter pylori trong chuẩn đoán bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh viện đa khoa Hải Dƣơng. - Nghiên cứu thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori kháng kháng sinh ở bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori đang điều trị tại bệnh viện đa khoa Hải Dƣơng. - Bƣớc đầu đề xuất một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. 4. Ý nghĩa của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả thực trạng nhiễm vi khuẩn H. pylori và tình trạng kháng kháng sinh là cơ sở khoa học cho việc kiểm soát, đánh giá và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc ứng dụng quy trình phát hiện nhanh, chính xác H. pylori và H. pylori kháng thuốc trong điều trị viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dƣơng.4 PHẦN II - NỘI DUNG CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI 1.1.1. Lịch sử phát hiện. T hơn 100 năm trƣớc đây, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận sự hiện diện của một loại vi khuẩn sống ở dạ dày chó. Tiếp theo, nhiều nhà khoa học cũng tìm thấy một loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày nhƣng lại thất bại trong việc nuôi cấy vi khuẩn. Năm 1970, nhà giải phẫu bệnh Robin Warren nhận xét có mối liên hệ giữa viêm dạ dày mãn tính và một loại xoắn khuẩn trong niêm mạc dạ dày. Mãi đến năm 1982, Robin Warren và ngƣời học trò của mình là Barry Marshall mới thành công nuôi cấy vi khuẩn t 11 bệnh nhân bị viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh đƣợc những ảnh hƣởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày. Họ đã đặt tên cho vi khuẩn này là Campylobacter pylori dựa theo hình dạng và đặc tính tăng trƣởng. Năm 1983, phát hiện vi khuẩn Campylobacter pylori và mối liên quan của nó với bệnh loét dạ dày tá tràng đƣợc công bố trên tạp chí Lancet. Năm 2005, với phát hiện này, hai ông đã đƣợc trao tặng giải thƣởng Nobel về y học [7]. Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trƣởng của vi khuẩn mà ngƣời ta đặt tên vi khuẩn là Campylobacter pylori. Tuy nhiên dƣới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn không giống Campylobacter vì có cấu trúc tiêm mao khác hẳn. Ngoài ra còn có những khác biệt lớn trong tính Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH HẢI DƢƠNG BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Phƣợng PGS TS Nguyễn Xuân Viết HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trƣớc hết xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Xuân Viết TS Lê Thị Phƣợng, ngƣời hƣớng dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cán bộ, giảng viên Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, đặc biệt xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán bộ, giảng viên Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Khoa Thăm dò chức bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dƣơng chia sẻ khó khăn, giúp triển khai nội dung đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp gia đình động viên nhiệt tình ủng hộ để tơi hồn thành khóa học Hà Nội, tháng 10 năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Nhàn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nội dung Amoxicillin Amoxicillinicillin bp base pair Cag A Cytotoxin - associated gene Clarithromycin Clarithromycinrithromycin DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotitde EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide H pylori Helicobacter pylori kb Kilo basepais kDa kilo Dalton LB Lysis bufer PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid TAE Tris- Acetic –Acid EDTA TBE Tris - Boric - Acid EDTA VacA Vacuolating cytotoxin Antigen µg Microgram µl Microliter 16S r RNA 16S ribsomal RNA 23S rRNA 23S ribsomal RNA MỤC LỤC PHẦN I - MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung đề tài Ý nghĩa đề tài PHẦN II - NỘI DUNG CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H PYLORI 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Đặc điểm sinh học Helicobacter pylori 1.1.3 Đặc điểm di truyền H pylori 1.1.4 Dịch tễ học H pylori 1.1.5 Cơ chế gây bệnh H pylori 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H PYLORI 10 1.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn H pylori 11 1.2.3 Ứng dụng PCR chẩn đoán nhiễm H pylori 12 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H.PYLORI TRÊN THẾ GIỚI 13 1.3.1 Xác định có mặt H.pylori phân tích trình tự gen đặc hiệu 16S rRNA 13 1.3.1.1 Vị trí, cấu trúc chức gen 16S rRNA 13 1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu gen 16S rRNA 15 1.3.2 Xác định tính kháng kháng sinh H.pylori qua phân tích trình tự gen 23S RNA 16 1.3.2.1 Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H pylori 16 1.3.2.2 Dịch tễ học kháng kháng sinh 16 1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu gen 23S rRNA liên quan đến kháng kháng sinh H pylori 17 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H PYLORI TẠI VIỆT NAM 19 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU H PYLORI TẠI HẢI DƢƠNG 22 CHƢƠNG II- ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 23 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Cỡ mẫu 27 2.3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu 27 2.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA t mẫu bệnh phẩm 27 2.3.4 Điện di 28 2.3.5 Định lƣợng, định tính DNA quang phổ kế 29 2.3.6 Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA xác định có mặt H pylori 30 2.3.7 Phản ứng PCR khuếch đại gen 23S rRNA xác định đột biến kháng thuốc 32 2.3.8 Phân tích xử lý số liệu: 33 2.3.8.1 Về yếu tố dịch tễ học 33 2.3.8.2 Về xác định có mặt H pylori dựa số liệu gen 16S rRNA đột biến kháng thuốc gen 23S rRNA 34 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 PHÂN TÍCH DỊCH TỄ HỌC ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA TỈNH HẢI DƢƠNG 35 3.1.1 Tuổi giới tính 35 3.1.2 Một số yếu tố dịch tễ khác tỷ lệ ngƣời mắc bệnh dày 37 3.2 PHÂN TÍCH GEN 16S RRNA CỦA H PYLORI TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H PYLORI ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƢƠNG 39 3.2.1 Kết tách chiết tinh DNA 39 3.2.2 Xác định có mặt H pylori gen 16S rRNA 43 3.2.2.1 Tối ưu hóa điều kiện PCR khuếch đại gen 16S rRNA 43 3.2.2.2 Xác định có mặt H pylori thị phân tử 16S rRNA 44 3.2.2.3 Kết đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA 45 3.2.3 Kết tỷ lệ nhiễm H pylori 46 3.2.4 Mối tƣơng quan yếu tố nguy với tỷ lệ nhiễm H pylori 48 3.3 NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG VI KHUẨN H PYLORI KHÁNG KHÁNG SINH Ở BỆNH NHÂN VIÊM DẠ DÀY DO H PYLORI ĐANG ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA HẢI DƢƠNG 51 3.3.1 Xác định tính kháng kháng sinh thị phân tử 23S rRNA 51 3.3.1.1 Tối ƣu hóa điều kiện PCR khuếch đại gen 23S rARN 51 3.3.1.2 Xác định đột biến kháng Clarithromycin Amoxicillin gen 23S rRNA 51 3.3.1.3 Kết đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA 52 3.3.2 Kết tỷ lệ kháng kháng sinh H Pylori 53 3.3.3 Mối tƣơng quan yếu tố nguy với đột biến kháng thuốc 55 3.4 Đề xuất giải pháp kiểm soát điều trị hiệu bệnh viêm dày địa bàn tỉnh Hải Dƣơng 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 PHỤ LỤC 66 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Vị trí phân loại học H pylori Bảng 1.2: Độ nhạy thử nghiệm nuôi cấy 12 Bảng 1.3 : Tỉ lệ đề kháng kháng sinh khu vực khác giới 18 Bảng 2.1: Danh mục dung dịch sử dụng 24 Bảng 2.2: Danh mục hoá chất hãng sản xuất 24 Bảng 2.3: Các thiết bị, dụng cụ phân tích thí nghiệm 25 Bảng 2.4: Trình tự cặp mồi để xác đinh H.Pylori H Pylori kháng thuốc 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR tối ƣu hóa điều kiện khuếch đại đoạn gen 16S rRNA 31 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 31 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR tối ƣu hóa điều kiện khuếch đại đoạn gen 23S rRNA 32 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn gen 23S rRNA 33 Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân viêm dày theo nhóm tuổi giới 35 Bảng 3.2 Phân bố bệnh nhân viêm dày theo yếu tố dịch tễ khác 37 Bảng 3.3 Nồng độ độ tinh DNA mẫu bệnh nhân 40 Bảng 3.5: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn gen 16S rRNA (nhiễm H pylori) 46 Bảng 3.6 Mỗi tƣơng quan yếu tố nguy với tỷ lệ H pylori dƣơng tính 48 Bảng 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn DNA 23S rRNA (kháng Clarithromycin) 53 Bảng 3.8 Mối tƣơng quan yếu tố nguy tỷ lệ H pylori kháng thuốc 55 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Vi khuẩn H pylori Hình 1.2 Bản đồ di truyền H pylori Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA gen 23SrRNA H pylori Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh H pylori Hình 1.5: Mẫu thử CLO test 10 Hình 1.6 Cấu trúc gen 16S rARN đặc thù cho loài vi khuẩn Prokaryote Archea (Woese et al 1987) 13 Hình 3.1: Kết đo OD kiểm tra nồng độ độ tinh DNA 42 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số đƣợc tách chiết t mẫu bệnh phẩm 42 Hình 3.3 Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 16S rRNA 45 Hình 3.4 : Kết đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA 46 Hình 3.5 Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 23S rRNA 52 Hình 3.6 Kết đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA 53 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố theo nhóm tuổi bệnh nhân viêm dày 36 Biểu đồ 3.2 Phân bố theo nhóm cơng việc bệnh nhân viêm dày 38 Biểu đồ 3.3 : Tỷ lệ H pylori âm tính dƣơng tính 47 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ đột biến vị trí A2143G A2142C 54 PHẦN I - MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Viêm dày bệnh lý tƣơng đối rõ ràng, hậu kích thích niêm mạc yếu tố ngoại sinh nội sinh Viêm dày chủ yếu gây tác nhân nhiễm khuẩn rối loạn miễn dịch, bệnh tự miễn nhiều nguyên nhân khác Helicobacter pylori đƣợc biết đến nhƣ nguyên nhân hay thủ phạm bệnh viêm dày mãn tính, loét dày tá tràng yếu tố đƣợc công nhận nhiều gây ung thƣ dày, đặc biệt nƣớc phát triển Helicobacter pylori đƣợc phát Warren Marhall (Úc) năm 1982 Nhiều nghiên cứu Helicobacter pylori yếu tố quan trọng gây bệnh tiền ung thƣ dày ung thƣ dày Ngƣời nhiễm Helicobacter pylori tăng nguy ung thƣ dày gấp lần so với ngƣời bình thƣờng Helicobacter pylori làm giảm khả tiết dịch dày, làm cho dày dễ bị tác động axit gây loét dày, đồng thời tạo điều kiện cho vi khuẩn non- Helicobacter pylori ƣa kiềm có khả chuyển hóa nitrite thành chất tiền ung thƣ Nhiễm Helicobacter pylori - nguyên bệnh dày 70% ngƣời Việt Nam gây ảnh hƣởng đến khả lao động nhƣ chất lƣợng sống ngƣời lao động Ngƣời lao động bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori lý nhƣ mơi trƣờng sống thiếu vệ sinh, tình trạng vệ sinh an tồn thực phẩm không bảo đảm Trong năm gần đây, Việt Nam nhƣ nhiều nơi giới, bệnh dày liên quan đến Helicobacter pylori đƣợc điều trị nhờ sử dụng phác đồ chống tiết kháng sinh Tuy vậy, thực tế chủng Helicobacter pylori kháng thuốc xuất hiện, làm giảm hiệu lực diệt tr thuốc nhiều bệnh nhân đƣợc điều trị nhƣng không khỏi điều trị không triệt để Theo Nguyễn Văn Thịnh (năm 2007), Amoxicillin Clarithromycin kháng sinh đƣợc sử dụng thƣờng xuyên điều trị diệt Helicobacter pylori, nhƣng t khoảng năm 2010, tỷ lệ chủng Helicobacter pylori kháng thuốc lên tới 23,7%, cao nhiều lần so với nƣớc Châu Âu, Mỹ, Tây Á, Hồng Công, Nhật Bản cao chút so với Hàn Quốc Các nghiên cứu nói đƣợc tiến hành chủ yếu thành phố công nghiệp lớn nhƣ Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Tại Hải Dƣơng, Helicobacter pylori đƣợc chẩn đốn có dày ngƣời bệnh dựa hình ảnh nội soi kết hợp ni cấy Helicobacter pylori t dịch tiêu hóa, làm test Urease để phát Helicobacter pylori Nuôi cấy Helicobacter pylori t mẫu bệnh phẩm đòi hỏi thời gian tƣơng đối dài vi khuẩn bội nhiễm non - Helicobacter pylori kèm làm cho việc phân tích trở nên khó khăn Mặt khác, chƣa có nghiên cứu tình trạng nhiễm Helicobacter pylori khả kháng thuốc Helicobacter pylori địa bàn tỉnh Hải Dƣơng Do đó, ứng dụng kỹ thuật y sinh học đại nhƣ PCR để phát nhanh xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định tính kháng kháng sinh chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị bệnh viêm dày bệnh viện tuyến tỉnh nói chung số bệnh viện tuyến huyện Hải Dƣơng cần thiết việc nâng cao hiệu điều trị bệnh, qua góp phần giảm tải cho bệnh viện tuyến trung ƣơng Xuất phát t ý nghĩa lý luận thực tiễn chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori bệnh nhân viêm dày địa bàn tỉnh Hải Dƣơng kỹ thuật sinh học phân tử” Mục đích nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Góp phần chẩn đốn điều trị viêm dày bệnh nhân nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori đồng thời có giải pháp định hƣớng kiểm sốt điều trị hiệu bệnh tỉnh Hải Dƣơng Phản ứng PCR kết thúc, lấy 10 µl sản phẩm PCR tiến hành điện di mẫu đối chứng dƣơng (+) - thị phân tử 23S rRNA, mẫu đối chứng âm (-) marker phân tử 100bp đƣợc dùng để xác định kích thƣớc đoạn gen 23S rRNA Kết đƣợc thể hình 3.5 M 10 Hình 3.5 Băng điện di sản phẩm PCR xác định gen 23S rRNA M: Thang chuẩn DNA 100bp ; 9: Mẫu đối chứng dƣơng; 10: Mẫu đối chứng âm ; Giếng 1,2,3,5,6,7,8: Các mẫu DNA bệnh phẩm Kết điện di đồ sản phẩm PCR thu đƣợc hình 3.5 cho thấy, giếng 3, 5, 6, xuất băng DNA trùng với vị trí băng DNA 23S rRNA mẫu chứng dƣơng So sánh với marker phân tử, băng DNA có kích thƣớc ƣớc đốn khoảng 0,5Kb Chứng tỏ mẫu 3, 5, 6, mang gen 23S rRNA Các giếng 1, 2, không xuất băng vạch DNA giống nhƣ mẫu chứng âm Chứng tỏ mẫu 1, 2, không mang gen 23S rRNA Tuy nhiên, để khẳng định xác gen 23S rRNA mang đột biến kháng Clarithromycin Amoxicillin H pylori có DNA bệnh phẩm, chúng tơi tiến hành đọc trình tự đối chiếu kết với liệu Genbank 3.3.1.3 Kết đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA Trong số 44 mẫu đƣợc xác định có H pylori dƣơng tính, đƣợc thơi gel đọc trình tự trực tiếp 20l sản phẩm PCR đƣợc làm Bộ sinh phẩm QIAquick PCR Purification hãng Qiagen (Đức) đƣợc đọc trình tự hãng Macrogen (Hàn Quốc) Kết đƣợc thể hình 3.6 52 CAAGACGGCAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 345 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 286 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 348 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 304 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 346 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 114 CAAGACGGAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 347 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATC 287 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 347 12 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 318 10 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 345 11 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 286 10 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 345 13 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 286 14 CAAGACGGAGAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 345 15 CAAGACGGAAAGACCCCG-TG-GACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAACGGGAATATC 282 16 GAAGAAGGAAATACCCCG-TG-AACCTTTACTACGCCTTACTGCTGCTAGGAATAATTTC 339 17 GAAGACGGAAAAACACCG-TG-GACCTTTTATACCATTTTCGACTGTGTTGGGGAAGATT 355 18 ACAAACGAATAAAACCTG-GGGAACCTTTTAACCTTCTTGGCAGT-TTTGAGGGAATATA 350 19 GTAGGAGGACAGACCCCGGTGTAACCTTTTTTACATCCTTTAACTGTGTTGGGAAATATT 352 * * * * * * * ******: :.* * * : ** :* Hình 3.6 Kết đọc trình tự đoạn DNA 23S rRNA Kết cho thấy 8/44 mẫu (18,2%) có đột biến kháng Clarithromycin, khơng có đột biến kháng Amoxicillin 7/8 đột biến A2143G (87,5%); 1/8 đột biến A2142C (12,5%) Khơng có bệnh nhân mang đồng thời đột biến 3.3.2 Kết tỷ lệ kháng kháng sinh H Pylori Bảng 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân mang đoạn DNA 23S rRNA (kháng Clarithromycin) Kết Số lƣợng bệnh nhân Tỷ lệ % Khơng có đột biến 36 78,0 Có đột biến 18,2 Tổng số 44 100 53 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ đột biến vị trí A2143G A2142C Nhƣ vậy, tỷ lệ kháng Clarithromycin H pylori Hải Dƣơng 18,2% thấp nghiên cứu nƣớc Lê Đình Minh Nhân cộng sự, nhƣng phù hợp với nghiên cứu châu Á Cụ thể, Trung Quốc t năm 2000 đến năm 2009, tỷ lệ kháng Clarithromycin tăng t 12,8% lên 23, Ở Nhật, tỉ lệ kháng Clarithromycin tăng t 7,0% lên 15,2%, Hàn Quốc 7,6% lên 18,6% [33] Hansomburana cs Thái Lan báo cáo tỷ lệ xuất đột biến gen A2142G phổ biến (36,4%) đồng thời có 18,2% chủng H pylori mang đồng thời đột biến Trong đó, theo Abadi A T cộng (2011) Iran có đến 93,7% đột biến gen kháng clarithromycin A2143G 3,1% có đột biến A2144G nhƣng lại khơng có chủng H pylori mang đồng thời đột biến Các nghiên cứu nƣớc cho thấy đột biến gen chủ yếu vị trí A2143G Theo Nguyễn ĐứcToàn (2012), tỷ lệ xuất gen đột biến A2143G 33,3%, khơng có đột biến A2142G [16] Trong nghiên cứu có đến 87,5% mang đột biến A2143G 12,5% mang đột biến A2142C Nhƣ đặc điểm đột biến gen H pylori khu vực tƣơng đối khác Một vấn đề đáng quan tâm vấn đề kháng đa thuốc Hiện tỷ lệ kháng đa thuốc có nguy tăng lên, ngun nhân gây thất bại điều trị Tuy nhiên Hải Dƣơng, theo nghiên cứu 54 chúng tôi, bệnh nhân xuất kháng Clarithromycin, mà chƣa xuất kháng Amoxicillin Điều có ý nghĩa quan trọng việc xây dựng phác đồ điều trị viêm dày cho bệnh nhân nhiễm H pylori Hải Dƣơng 3.3.3 Mối tƣơng quan yếu tố nguy với đột biến kháng thuốc Bảng 3.8 Mối tƣơng quan yếu tố nguy tỷ lệ H pylori kháng thuốc Yếu tố nguy (1) Giới tính Nhóm tuổi Nhóm cơng việc Nam H pylori kháng thuốc N % (2) (3) 62,5 Nữ 37,5 18-30 50 31-40 12,5 41-50 0 51-60 25 >60 12,5 Nông nghiệp 50 Xây dựng 25 Thƣơng nghiệp 12,5 Viên chức 0 Công nhân 0 Giao thông 0 Khơng làm 0 Cơng việc khác 12,5 55 p (4) p > 0,05 p > 0,05 p >0,05 OR (5) (1) (2) (3) Nông thôn 87,5 Thành phố 12,5 Ợ nóng 25 Ợ hơi, ợ chua 100 Biểu lâm Đầy bụng khó 50 sàng tiêu Chán ăn sụt cân 25 Đau thƣợng vị 100 đói 62,5 biểu No 25 lâm sàng Đang ăn 12,5 Tiền sử bệnh Có 75 gia đình Chƣa 25 Điều trị viêm Đã điều trị 75 dày H pylori Chƣa điều trị 25 Nơi Thời gian xuất (4) (5) P0,05 p>0,05 p>0,05 p

Ngày đăng: 02/04/2017, 13:15

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • PHẦN I - MỞ ĐẦU

  • 1. Lý do chọn đề tài

  • 2. Mục đích nghiên cứu.

  • 2.1. Mục tiêu chung.

  • 2.2. Mục tiêu cụ thể.

  • 3. Nội dung của đề tài

  • 4. Ý nghĩa của đề tài

  • 4.1. Ý nghĩa khoa học

  • PHẦN II - NỘI DUNG

  • CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

  • 1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H. PYLORI

  • 1.1.1. Lịch sử phát hiện.

  • 1.1.2. Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori.

    • Hình 1.1: Vi khuẩn H. pylori

    • Bảng 1.1: Vị trí phân loại học của H. pylori

    • 1.1.3. Đặc điểm di truyền của H. pylori

      • Hình 1.2. Bản đồ di truyền của H. pylori.

      • Hình 1.3: Cấu trúc phân tử gen 16S rRNA và gen 23SrRNA của H. pylori

      • 1.1.4. Dịch tễ học về H. pylori

      • 1.1.5. Cơ chế gây bệnh của H. pylori

        • Hình 1.4: Cơ chế gây bệnh của H. pylori

        • 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H. PYLORI

          • Hình 1.5: Mẫu thử CLO test

          • 1.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn H. pylori.

            • Bảng 1.2: Độ nhạy của thử nghiệm nuôi cấy

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan