BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Thanh Hoài TỔNG HỢP VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH TƯƠNG THÍCH SINH HỌC KHẢ NĂNG TẠO MÔ XƯƠNG CỦA VẬT LIỆU COMPOSIT POLY (D, L) LACTIC AXIT/HYDROXYAPATIT Chuyên ngành: Hóa lí thuyết Hóa lí Mã số : 62440119 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2017 Công trình hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Kim Ngà PGS.TS Hồ Phú Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi….giờ, ngày…tháng…năm… Có thể tìm hiều luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Trần Thanh Hoài, Nguyễn Kim Ngà (2015) Nghiên cứu ảnh hưởng kích thước hạt nano hydroxyapatit đến khả tạo apatit màng hydroxyapatit/poly (D,L) lactic axit Tạp chí Khoa học Công nghệ- Các trường Đại học Kỹ thuật, 104, pp 99-102 Trần Thanh Hoài, Nguyễn Kim Ngà (2015) Effect of casting solvent on microstructure and biocompatibility of poly (D, L)lactic acid/hydroxyapatite nanorod for bone regeneration Vietnam Journal of Chemistry 53(6e3), pp 100-108 Lưu Trường Giang, Trần Thanh Hoài, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Nguyễn Kim Ngà (2015) Synthesis and characterizations of hydroxyapatite nanorods: effect of surfactant concentration and hydrothermal time on their morphology Tạp chí Khoa học Công nghệ- Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam, 53 (4D), pp 295-303 Nguyen Kim Nga, Tran Thanh Hoai, Pham Hung Viet (2015) Biomimetic scaffolds based on hydroxyapatite nanorod/poly(D,L) lactic acid with their corresponding apatite-forming capability and biocompatibility for bone tissue engineering Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 128, pp 506-514 Trần Thanh Hoài, Nguyễn Kim Ngà, Hồ Phú Hà Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hydroxyapatit đến hình thái cấu trúc vi mô khả tương thích sinh học khuôn định dạng compozit hydroxyapatit/ poly(D,L) lactic axit Tạp chí Hóa học Ứng dụng Đã nhận đăng (số 2, năm 2017) Tran Thanh Hoai, Nguyen Kim Nga, Luu Truong Giang, Tran Quang Huy, Phan Nguyen Minh Tuan, Bui Thi Thanh Binh Hydrothermal synthesis of hydroxyapatite nanorods for rapid formation of bone-like mineralization Journal of Electronic Materials (Under revision 1/2017) MỞ ĐẦU Các tổn thương xương gia tăng già hóa dân số, tai nạn giao thông xuất nhiều môn thể thao mạo hiểm dễ gây chấn thương Trong bệnh xương tỷ lệ bệnh cần ghép xương gia tăng đáng kể Thay xương giải pháp tối ưu điều trị sửa chữa vùng bị phá hủy hay mô nhiễm bệnh hoại tử, dị tật, thoái hóa, ung thư hay mục đích thẩm mỹ Các phương pháp ghép xương sử dụng phương pháp ghép xương tự thân, ghép xương đồng loại, ghép xương dị loại kỹ thuật mô xương Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng, kỹ thuật mô xương phương pháp nhiều nhà khoa học nghiên cứu Trong kỹ thuật mô xương, vật liệu có hoạt tính sinh học chế tạo dạng khuôn định dạng 3D Khuôn định dạng (scaffold) khuôn tạm thời để tế bào bám dính, sinh trưởng, phát triển hình thành khung ngoại bào trình hình thành cấu trúc mô Khuôn định dạng chế tạo từ vật liệu polyme phân hủy sinh học, vật liệu vô có hoạt tính sinh học composit Vật liệu composit với liên kết vật liệu gốm sinh học polyme, xem phương pháp hiệu để tăng cường hoạt tính sinh học tính chất học khuôn định dạng Vật liệu vô có thành phần tương tự thành phần khoáng xương hydroxyapatit (HAp) HAp có tính tương thích sinh học, hoạt tính sinh học cao Chính vậy, vật liệu composit HAp/polyme thu hút nhà khoa học nghiên cứu phát triển để tạo khuôn định dạng có tính chất gần giống với xương người Hiện nay, giới, vật liệu composit HAp/polyme ứng dụng kỹ thuật mô xương nghiên cứu nhiều thử nghiệm động vật Ở nước, đến chưa có công trình nghiên cứu vật liệu composit ứng dụng kỹ thuật mô xương Vì vậy, lựa chọn đề tài:’’Tổng hợp nghiên cứu tính tương thích sinh học khả tạo mô xương vật liệu composit Poly (D, L) lactic axit/hydroxyapatit’’ Mục tiêu luận án: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu composit sinh học gồm hydroxyapatit polyme sinh học (PDLLA) nhằm mục đích tạo vật liệu có khả tương hợp sinh học, kích thích phát triển xương để ứng dụng lĩnh vực cấy ghép tái tạo xương Nội dung nghiên cứu luận án: Nghiên cứu tổng hợp bột HAp kích thước nano phương pháp thủy nhiệt có bổ sung hai chất hoạt động bề mặt khác CTAB P123 Trong đó, luận án nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến kích thước, hình dạng tinh thể HAp như: - Ảnh hưởng nồng độ chất hoạt động bề mặt - Ảnh hưởng thời gian thủy nhiệt Từ mẫu bột HAp tổng hợp điều kiện khác nhau, luận án thực đánh giá hoạt tính sinh học bột HAp thí nghiệm in-vitro ngâm dung dịch SBF Nghiên cứu chế tạo khuôn định dạng composit HAp/PDLLA phương pháp đổ dung môi rửa hạt Trong đó, luận án nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc vi mô khuôn định dạng như: - Ảnh hưởng tỷ lệ HAp/PDLLA - Ảnh hưởng dung môi sử dụng chloroform 1,4-dioxan Từ mẫu khuôn định dạng chế tạo được, luận án thực đánh giá hoạt tính sinh học khuôn định dạng thí nghiệm in-vitro ngâm dung dịch SBF tính tương thích sinh học khuôn định dạng thí nghiệm in-vitro với tế bào MG63 Ý nghĩa khoa học đóng góp luận án: Luận án tập trung nghiên cứu tổng hợp bột HAp có kích thước nano chế tạo vật liệu composit HAp/PDLLA cấu trúc 3D có lỗ xốp ứng dụng kỹ thuật mô xương Các kết đạt có đóng góp sau: - Luận án tổng hợp thành công bột nano HAp phương pháp thủy nhiệt có sử dụng hai chất hoạt động bề mặt khác P123 CTAB Bột HAp tổng hợp (đường kính trung bình 28 nm chiều dài trung bình 120 nm, tỷ lệ Ca/P 1,66) có kích thước tương tự kích thước khoáng xương tự nhiên thể hoạt tính sinh học cao ngâm dung dịch SBF Lớp apatit hình thành thời gian ngắn sau ngày ngâm dung dịch SBF, hình thái lớp apatit tạo thành đặc trưng cho lớp apatit giống xương - Luận án chế tạo thành công khuôn định dạng composit HAp/PDLLA có cấu trúc 3D xốp, phương pháp đổ dung môi rửa hạt với chất tạo lỗ NaCl sử dụng hai dung môi khác 1,4-dioxan chloroform Khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp có độ dày mm, độ xốp cao > 70% với kích thước lỗ xốp dao động khoảng 117-254 µm Các mẫu khuôn định dạng có khả tương thích sinh học với tế bào MG63 Bố cục luận án Luận án có 118 trang với 23 bảng,55 hình Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận (1 trang), danh mục công trình công bố (1 trang) tài liệu tham khảo (11 trang), luận án chia thành chương sau: Chương Tổng quan (34 trang) Chương Thực nghiệm (12 trang) Chương Kết thảo luận (50 trang) CHƢƠNG TỔNG QUAN Xƣơng phƣơng pháp cấy ghép xƣơng Xương mô cứng có khả tự tái tạo sửa chữa số trường hợp bị gãy hay tổn thương mà không để lại sẹo[5, 6] Tuy nhiên, trường hợp tổn thương bệnh lý hay tổn thương lớn, xương tự liền tự sửa chữa nên cần cấy ghép để giúp phần tổn thương tái tạo phục hồi Phương pháp cấy ghép xương chia làm loại sau: phương pháp ghép xương đồng loại (allograft), phương pháp ghép xương tự thân (autograft), phương pháp ghép dị loại (xenograft Phương pháp ghép xương không gây phản ứng miễn dịch bệnh nhân phải phẫu thuật nhiều lần số lượng mô ghép có hạn Phương pháp ghép dị loại phương pháp ghép xương lấy từ quan người hiến tặng Phương pháp có nhược điểm độ bền vật liệu giảm 50% sau xử lý giá thành cao Phương pháp ghép xương có nguồn gốc từ động vật, thực vật có ưu chi phí số lượng thường xuất phản ứng đào thải mô ghép Để khắc phục nhược điểm trên, kỹ thuật mô xương phát triển Trong kỹ thuật mô, thiết kế khuôn định dạng mô ghép làm giảm nhược điểm phương pháp ghép truyền thống cải thiện liên kết, tạo xương, kích thích tạo xương tính dẫn xương mô ghép 1.2 Các vật liệu chế tạo khuôn định dạng Vật liệu sinh học nghiên cứu để chế tạo khuôn định dạng ứng dụng kỹ thuật tạo mô gồm dạng chính: vật liệu polyme phân hủy sinh học; vật liệu vô có hoạt tính sinh học; vật 1.1 liệu composit tổng hợp từ dạng vật liệu (polyme/vật liệu vô hoạt tính sinh học) Trong hợp chất vô có hoạt tính sinh học HAp bật với hoạt tính sinh học cao, nghiên cứu ứng dụng nhiều y sinh đặc biệt HAp có thành phần giống với thành phần vô xương người Vì vậy, dùng HAp để tạo khuôn định dạng, giúp khuôn định dạng tương thích với tế bào tạo xương kích thích trình tái tạo xương sớm Polyme PDLLA có ưu điểm thích hợp để tổng hợp composit chế tạo khuôn định dạng tính học ổn định, thời gian phân hủy thích hợp, kết hợp với hợp chất vô có hoạt tính sinh học điều khiển thời gian phân hủy tủy thuộc vào ứng dụng, sản phẩm phân hủy không gây độc với thể Đặc biệt PDLLA tổng hợp từ axit lactic, axit tạo trình lên men sinh học, PDLLA coi sản phẩm thân thiện với môi trường Trong luận án này, lựa chọn hai vật liệu HAp PDLLA để chế tạo khuôn định dạng composit ứng dụng lĩnh vực mô xương 1.3 Phƣơng pháp tổng hợp bột HAp Hoạt tính sinh học, học HAp phụ thuộc vào độ tinh khiết, kích thước, hình dạng HAp tổng hợp Các đặc tính định phạm vi ứng dụng vật liệu Do có nhiều phương pháp nghiên cứu điều khiển hình thái, kích thước HAp Một số phương pháp nghiên cứu tổng hợp HAp như: phương pháp đồng kết tủa, phương pháp thủy nhiệt, phương pháp sol-gel,… Phương pháp thủy nhiệt có ưu điểm thời gian phản ứng nhanh (< 24h), cần giai đoạn để hình thành tinh thể nên dễ điều khiển thông số phản ứng, tinh thể thu có độ đồng cao hình dạng kích thước, kích thước hạt thu từ 50 nm Với ưu điểm nêu trên, sử dụng phương pháp thủy nhiệt tổng hợp HAp 1.4 Phƣơng pháp chế tạo khuôn định dạng composit Có nhiều phương pháp chế tạo khuôn định dạng composit polyme/gốm phương pháp đổ dung môi rửa hạt, phương pháp nhiệt phân tách pha (TIPS), phương pháp bọt khí rửa hạt công nghệ in 3D… Mỗi kỹ thuật tạo khuôn định dạng với cấu trúc lỗ khác với ưu nhược điểm riêng Phương pháp đổ dung môi rửa hạt có ưu điểm đơn giản hiệu cao, dễ dàng tạo hình cho khuôn định dạng dễ kiểm soát độ xốp, kích thước lỗ khuôn định dạng kích thước số lượng hạt tạo lỗ Với ưu điểm nêu trên, nhận thấy phương pháp đổ dung môi rửa hạt phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm thích hợp để tạo khuôn định dạng composit HAp/PDLLA 1.5 Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học vật liệu Một số phương pháp thường dùng để dự đoán hoạt tính sinh học vật liệu trước thử nghiệm thể động vật thí nghiệm in-vitro với dung dịch mô dịch thể người (SBF) thí nghiệm với tế bào Thí nghiệm ngâm vật liệu dung dịch SBF dùng để đánh giá hoạt tính sinh học vật liệu thông qua khả hình thành lớp apatit giống xương Thí nghiệm nuôi cấy tế bào lên vật liệu để đánh giá khả tương thích vật liệu với tế bào Đánh giá dựa phát triển tế bào khả bám dính, di trú tế bào vật liệu Phương pháp AlamarBlue phương pháp đánh giá khả tương thích phát triển tế bào với vật liệu Thuốc thử AlamarBlue chất oxi hóa có màu xanh không phát huỳnh quang Khi thuốc thử alamarBlue ủ với tế bào sống, thuốc thử bị khử chuyển thành màu đỏ, phát huỳnh quang Tín hiệu đo bước sóng kích thích 560 nm bước sóng phát xạ 590 nm [175] Kính hiển vi laze đồng tiêu cự với khả ghi lại lớp ảnh sâu mẫu để tạo nên hình ảnh 3D cho phép quan sát bám dính di trú tế bào vật liệu CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất nguyên liệu đầu Các hóa chất tổng hợp bột HAp, tổng hợp khuôn định dạng composit HAp/PDLLA thử hoạt tính sinh học vật liệu có độ tinh khiết cao 2.2 Tổng hợp bột HAp Bột HAp tổng hợp phương pháp thủy nhiệt với chất ban đầu CaCl2 Na2HPO4 có bổ sung hai chất hoạt động bề mặt khác P123 CTAB Quy trình thí nghiệm thực phòng thí nghiệm môn Vô Đại cương, trường ĐH Bách Khoa Hà Nội - Với chất hoạt động bề mặt P123, luận án khảo sát hàm lượng tối ưu để tổng hợp bột HAp có kích thước bé độ đồng cao - Với chất hoạt động bề mặt CTAB, luận án khảo sát hàm lượng tối ưu thời gian thủy nhệt để tổng hợp bột HAp có kích thước bé độ đồng cao 2.3 Tổng hợp composit HAp/PDLLA Khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp phòng thí nghiệm BM Vô Đại cương, ĐH Bách Khoa Hà Nội Composit HAp/PDLLA chế tạo theo phương pháp đổ dung môi rửa hạt với NaCl hạt dùng để tạo lỗ - Với hai dung môi khác nhau: chloroform 1,4 dioxane - Với tỉ lệ HAp/PDLLA khác 0%, 10%, 20%, 30% 2.4 Các phƣơng pháp xác định đặc trƣng Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) đo máy Siemens D5005 sử dụng xạ CuKα (λ= 0,15406 nm), góc quay từ 10-70o Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) ghi máy Nicolet 6700 spectrometer sử dụng kỹ thuật ép viên KBr khoảng 4000-400 cm-1 với độ phân giải cm-1 Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) đo thiết bị S4800 Hitachi Nhật Bản Supra 40, Zeiss, Đức Phương pháp phân tích phổ tán sắc lượng tia X (EDS) xác định thông qua thiết bị đo EDS Nova NanoSEM 450, FEI JEOL JED-2300 với chương trình phân tích định lượng ZAF Phương pháp đo độ xốp khuôn định dạng đo theo phương pháp bão hòa chất lỏng 2.5 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính vật liệu Thí nghiệm in-vitro ngâm dung dịch SBF thực phòng thí nghiệm BM Vô Đại cương BM Vi sinh-hóa sinhsinh học phân tử, ĐH Bách Khoa Hà Nội Thí nghiệm nuôi với tế bào MG63: - Đánh giá khả phát triển tế bào phương pháp AlamarBlue - Đánh giá khả bám dính di trú tế bào qua kính hiển vi laze đồng tiêu cự Phân tích thống kê Các kết đo nhiều lần lấy giá trị trung bình Phần mềm Anova sử dụng để phân tích thông kê ,với giá trị P < 0,05 giá trị có khác biệt mẫu CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Các kết nghiên cứu đặc trƣng, thành phần bột HAp tổng hợp 3.1.1 Các kết đặc trƣng bột HAp tổng hợp phƣơng pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 3.1.1.1 Kết khảo sát hình thái mẫu bột HAp phương pháp SEM Hình thái mẫu HAp tổng hợp với nồng độ khác P123 xác định thông qua hình ảnh SEM Hình ảnh cho thấy hạt HAp mẫu có dạng hình que với bề mặt trơn, nhẵn Điều cho thấy nồng độ chất hoạt động bề mặt P123 không ảnh hưởng đến hình dạng hạt HAp tổng hợp (hình 3.1) Ảnh SEM mẫu 2P123 cho thấy (hình 3.1 c), hạt HAp mẫu có kích thước bé đồng 3P123 2P123 d 100 nm Hình 3.1 Các ảnh SEM mẫu bột HAp tổng hợp phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0g P123, (b) 1g P123, (c) 2g P123, (d) 3g P123 Kích thước hạt HAp mẫu đo phần mềm ImageJ trình bày Bảng 3.1 Kết cho thấy nồng độ P123 tăng lên kích thước hạt tổng hợp giảm Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ P123 sản phẩm thu có kích thước to hình dạng hạt không đồng Hình ảnh mẫu 3P123 cho thấy điều (hình 3.1 d), bán kính trung bình hạt HAp 82 nm, chiều dài 365 nm Sự có mặt P123 với khối lượng 2g tối ưu cho trình tổng hợp bột nano HAp có hình dạng que, độ đồng cao kích thước hạt tương tự với HAp tự nhiên Bảng 3.1 Một số đặc điểm mẫu bột HAp tổng hợp phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 Hình 0.5 Đường đẳng nhiệt hấp phụ nhả hấp phụ nitơ mẫu bột nano HAp tổng hợp phương pháp thủy nhiệt với hàm lượng chất hoạt động bề mặt P123 khác nhau: (a) 0P123, (b) 1P123, (c) 2P123 3.1.1.6 Cơ chế hình thành hạt HAp tổng hợp phương pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt P123 Cơ chế hình thành HAp giả định dựa kết đạt Khi có mặt P123, pH cao, phản ứng dung dịch CaCl2 Na2HPO4 tạo HAp Trong dung dịch, P123 tạo thành mixen hình trụ có kích thước nano hoạt động “nanoreactor” Ở nồng độ P123 thấp, có nhiều nhân HAp không liên kết với mixen, không định hướng phát triển nên tạo tinh thể HAp lớn không đồng Ở nồng độ P123 cao, kích thước hạt mixen tăng tạo hạt HAp có kích thước lớn 3.1.1.7 Các kết khảo sát hoạt tính sinh học bột HAp Các hạt HAp dạng bột không thích hợp thí nghiệm ngâm mẫu dung dịch SBF, vậy, hoạt tính sinh học mẫu HAp đánh giá thông thí nghiệm in-vitro ngâm mẫu dạng màng composit HAp/PDLLA dung dịch SBF (a3) 0P123 Ngày 0,2µm (c3) 2P123 Ngày 0,2µm Hình 3.6 Ảnh SEM màng HAp/PDLLA sau ngâm SBF Kết từ ảnh SEM sau 1, 3, ngày ngâm dung dịch SBF cho thấy, lớp khoáng hình thành bề mặt màng F-2P nhanh sau ngày ngâm SBF Kết chứng tỏ F-2P có hoạt tính sinh học cao mẫu lại Dựa phân tích EDS tỉ lệ Ca/P (Bảng 3.5), khoáng OCP TCP tạo thành bề mặt F-2P sau ngày ngâm SBF Bảng 3.2 Tỉ lệ Ca/P mẫu sau ngâm SBF Mẫu ngày F-0P 1,55 F-2P 1,36 1,47 1,57 10 Các mẫu công bố [187] xuất lớp apatit sau 45 ngày Hơn nữa, sau ngày ngâm, hình thái lớp apatit giống xương hình thành đặc biệt giống san hô quan sát thấy Dựa so sánh kết đạt được, thấy kích thước hình dạng hạt nano HAp đóng vai trò then chốt định hoạt tính sinh học khả tương thích sinh học gia đoạn phát triển tạo apatit giống xương 3.1.2 Các kết đặc trƣng bột HAp tổng hợp phƣơng pháp thủy nhiệt sử dụng chất hoạt động bề mặt CTAB 3.1.2.1 Các kết khảo sát hình thái mẫu HAp phương pháp SEM Quan sát ảnh SEM, ta thấy tất mẫu HAp tổng hợp có dạng hình que với kích thước nano Kích thước hạt HAp mẫu đo phần mềm ImageJ trình bày Bảng 3.7 2CT 4CT Hình 3.7 Ảnh SEM mẫu bột HAp tổng hợp với nồng độ khác chất hoạt động bề mặt CTAB Bảng 3.3 Một số đặc trưng hình thái hạt nano HAp tổng hợp với hàm lượng khác chất hoạt động bề mặt CTAB Đường kính Chiều dài trung Tỷ lệ Hình thái trung bình (nm) bình (nm) bề mặt CT 41 ± 133 ± 32 3.24 Hình que 1CT 42 ± 145 ± 32 3.45 Hình que 2CT 44 ± 150 ± 40 3.41 Hình que 4CT 43 ± 158 ± 43 3.67 Hình que Các kết phân tích khẳng định rằng, thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt CTAB hình thái hạt nano HAp không thay đổi, có ảnh hưởng đến chiều dài hạt Với lượng CTAB bổ sung vào 0,64 g, hạt nano HAp tổng hợp có kích thước bé đồng Chúng sử dụng lượng CTAB thêm vào 0,64g để tổng hợp mẫu HAp với thời gian thủy nhiệt khác Mẫu 11 nhau, để nghiên cứu ảnh hưởng thời gian thủy nhiệt đến hình thái hạt Hap Hình 3.14 ảnh SEM mẫu bột HAp tổng hợp với khoảng thời gian thủy nhiệt 6, 12 18 Từ ảnh SEM, sử dụng phần mềm ImageJ, kết đo cho thấy chiều dài hạt tăng từ 76 đến 133 nm thời gian thủy nhiệt tăng từ đến 18 Quan sát ảnh SEM ta thấy mẫu bột tổng hợp với thời gian thủy nhiệt 12 có kích thước hạt HAp bé đồng CT(12) CT(6) Hình 3.8 Ảnh SEM mẫu bột HAp tổng hợp với hàm lượng CTAB 0,64 gam khoảng thời gian thủy nhiệt khác (a), 12 (b), 18 (c) Cường độ 3.1.2.2 Kết phân tích EDS mẫu HAp Kết phân tích phổ EDS (hình 3.16) cho thấy tỷ lệ thành phần nguyên tố có mẫu HAp O (41,89 %), Ca (34,45% ) P (17,13%) Tỷ lệ Ca/P mẫu HAp nằm khoảng 1,55- 1,59 gần với giá trị lý thuyết 1,67 tính theo công thức hóa học Điều khẳng định, mẫu HAp tổng hợp thành công keV Hình 3.9 Phổ EDS mẫu nano HAp tổng hợp với 0,64 g CTAB thủy nhiệt 12 12 Độ truyền qua, % 3.1.2.3 Kết phân tích FTIR mẫu HAp Tần số dao động, cm -1 Hình 3.10 Phổ FTIR mẫu HAp tổng hợp với nồng độ CTAB khác nhau: 4,64 g (a), 1,64g (b), 0,64g (c) Cường độ Phổ FTIR mẫu CT, 1CT 4CT thể hình 3.17 Kết hình cho thấy, phổ mẫu khác biệt nhiều có phổ đặc trưng cho nhóm cấu trúc HAp 3.1.2.4 Kết phân tích XRD mẫu HAp 2θ Hình 3.11 Phổ XRD mẫu HAp tổng hợp với nồng độ CTAB khác nhau: 0,64g (a), 1,64g (b), 4,64 g (a) Kết phân tích XRD mẫu CT, 1CT 4CT (hình 3.18) cho thấy pic đặc trưng HAp vị trí 2θ = 25,90o, 28,15o, 28,70o, 31,55o, 32,15o, 32,65o 34,0o Trong phổ nhiễu xạ không xuất pic đặc trưng cho β-tricanxi photphat, tetracanxi photphat Vì vậy, kết XRD kết hợp với kết FTIR phân tích khẳng định mẫu HAp tổng hợp đơn pha 3.1.2.5 Cơ chế hình thành hạt HAp theo phương pháp thủy nhiệt có bổ sung chất hoạt động bề mặt CTAB Kích thước hạt mixen tăng lên nồng độ CTAB tăng, dẫn đến kích thước hạt HAp tăng Vì vậy, với lượng CTAB 0,64 g 13 tương đương với nồng độ 10,61mM nồng độ chất hoạt động bề mặt thích hợp để tạo hạt HAp có kích thước hình dạng giống với khoáng xương Với thời gian thủy nhiệt kéo dài, hạt mixen hình cầu kết hợp với để tạo thành mixen hình que Chính vậy, thời gian thủy nhiệt quan trọng định độ dài đồng hạt nano HAp tổng hợp được.Với lượng CTAB 0,64g thời gian thủy nhiệt 12 h điều kiện thích hợp để tạo hạt nano HAp có kích thước bé độ đồng 3.1.2.6 Các kết khảo sát hoạt tính sinh học bột HAp Với độ đồng cao, kích thước bé (đường kính 41 nm, chiều dài 125 nm) mẫu CT(12) chọn để thử hoạt tính sinh học Lớp apatit hình thành màng chứa hạt nano HAp mẫu CT(12) có hình thái giống với lớp màng có chứa hạt nano HAp mẫu 2P123 (hình 3.11) Hình thái lớp khoáng hình thái đặc trưng cho lớp apatit giống với xương [179] Sau ngày lớp apatit hình thành hoàn toàn màng chứa hạt nano HAp mẫu CT(12) Điều khẳng định mẫu CT(12) có hoạt tính sinh học cao giống với mẫu 2P123 Tuy nhiên, mẫu 2P123 có kích thước bé gần giống với HAp có xương tự nhiên mẫu CT(12) nên sử dụng mẫu 2P123 để nghiên cứu tổng hợp khuôn định dạng composit HAp/PDLLA ngày g ngày h 100 nm 500 nm Hình 3.12 Ảnh SEM màng HAp/PDLLA (được phủ bột HAp có thời gian thủy nhiệt 12h) trước sau ngâm SBF ngày 3.2 Các kết nghiên cứu đặc trƣng, hoạt tính tính tƣơng thích sinh học khuôn định dạng composit HAp/PDLLA 3.2.1 Các kết nghiên cứu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi 1, 4-dioxan 14 (a) (b) mm Hình 3.13 Ảnh khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp phương pháp đổ dung môi rửa hạt sử dụng dung môi 1,4-dioxan: (a) mẫu S3 có tỷ lệ HAp 20%, (b) mẫu S4 có tỷ lệ HAp 30% Bốn mẫu khuôn định dạng tổng hợp với tỷ lệ HAp/PDLLA 0, 10, 20, 30% sử dụng dung môi 1,4 dioxan để hòa tan polyme PDLLA ký hiệu tương ứng S1, S2, S3, S4 Các mẫu có hình dạng cố định với độ dày mm (hình 3.21) cấu trúc lỗ xốp 3.2.1.1 Các kết khảo sát hình thái bề mặt mẫu khuôn định dạng composit phương pháp SEM Kết ảnh SEM (hình 3.23) cho thấy hình thái bề mặt khuôn định dạng trở nên thô ráp hơn, độ dày thành lỗ xốp tăng thành phần HAp tăng (a1) S1 (d) S4 (b1) S2 Hình 3.14 Ảnh SEM khuôn định dạng tổng hợp với tỷ lệ HAp khác Phần mềm ImageJ sử dụng để đo kích thước lỗ mẫu khuôn định dạng Kết đo kích thước lỗ thể Bảng 3.11 Bảng 3.4 Thành phần kích thước lỗ xốp mẫu khuôn định dạng Mẫu S1 S2 S3 S4 Khối lượng HAp (g) 0.0455 0.091 0.136 Khối lượng PDLLA (g) 0.455 0.455 0.455 0.455 15 Tỷ lệ Kích thước lỗ HAp/PDLLA (µm) 274 ± 76 10 183 ± 60 20 122 ± 58 30 117 ± 60 Độ truyền qua, % Kết cho thấy, tỷ lệ HAp cao kích thước lỗ khuôn định dạng HAp/PDLLA nhỏ độ dày thành lỗ tăng 3.2.1.2 Các kết phân tích FTIR Kết phân tích phổ FTIR(hình 3.25) composit HAp/PDLLAcho thấy dịch chuyển pic nhóm (C=O) PDLLA từ vùng 1749 cm-1trong phổ S1sang vùng 1754 1752 cm-1 phổ tương ứng S3 S4 Pic liên kết C-H xuất vùng 2999 2951 cm-1 phổ S1 bị dịch chuyển sang vùng 2996 2946 cm-1, 2998 2948 cm-1 tương ứng phổ mẫu S3 S4 Kết cho thấy, liên kết hydro hình thành nhóm OH HAp nhóm C=O PDLLA, hạt nano HAp cố định polyme PDLLA Tần số dao động, cm -1 Hình 3.15 Phổ FTIR mẫu: (a) mẫu bột HAp, (b) mẫu S3, (c) mẫu S4, (d) mẫu S1 3.2.1.3 Các kết phân tích EDS Kết phân tích phổ EDS cho thấy ba nguyên tố O, P, Ca thành phần chủ yếu khuôn định dạng tổng hợp với tỉ lệ tương ứng sau: 45,03±1,63 %, 5,64±0,47 % 9,58±0,52 % Tỷ lệ Ca/P 1,69 gần với tỷ lệ lý thuyết 1,67 Kết chứng tỏ hạt nano HAp liên kết thành công lên chất polyme khuôn định dạng composit 16 Cƣờng độ keV Hình 3.16 Phổ EDS mẫu S4 3.2.1.4 Kết đo độ xốp Độ xốp khuôn định dạng đo theo phương pháp bão hóa chất lỏng Kết cho thấy, mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp có độ xốp cao từ 80-89% Với độ xốp này, mẫu tổng hợp tạo thuận lợi cho tế bào bám dính, phát triển thí nghiệm in-vitro (a3) S3 ngày (b1) S4 ngày 1µm 1µm Hình 3.17 Ảnh SEM mẫu khuôn định dạng S3, S4 sau ngâm SBF ngày Kết ảnh SEM (Hình 3.28) cho thấy phát triển hoàn toàn lớp khoáng bề mặt S3 S4 sau ngày ngâm DayC SBF A day (a1) S1 ngày (b) S2 500 nm ngày 300 nm Hình 3.18 Ảnh SEM mẫu S1, S2 sau ngâm SBF ngày Ảnh SEM mẫu S1 S2 (Hình 3.29) cho thấy vài đám hoa san hô xuất mẫu S2 S1 sau ngày ngâm Các 17 Cƣờng độ huỳnh quang (A.U) kết cho thấy với tỷ lệ HAp từ 20-30% khuôn định dạng HAp/PDLLA có khả tạo apatit cao thí nghiệm in-vitro Kết phân tích phổ EDS cho thấy thành phần có mặt lớp khoáng nguyên tố Ca, P O Tỷ lệ Ca/P lớp khoáng 1,24 1,55 tương ứng sau ngày ngâm SBF Kết phân tích cho thấy hình thành lớp apatit giống xương quan sát thấy sau ngày ngâm SBF với vật liệu composit HAp/PDLLA (đã tổng hợp luận án) Trong đó, hình thành lớp apatit tương tự quan sát thấy sau thời gian dài từ 14 đến 21 ngày ngâm với màng nano HAp/PDLLA [192] Akermanite/PDLLA [193] Phần khoáng mẫu công bố trước có hình thái thành phần khác xa mẫu HAp luận án xương tự nhiên Dựa kết so sánh kết đạt được, thấy kích thước hình dạng hạt nano HAp đóng vai trò then chốt định hoạt tính sinh học khả tương thích sinh học gia đoạn phát triển tạo apatit giống xương 3.2.1.6 Các kết nghiên cứu khả tương thích sinh học khuôn định dạng HAp/PDLLA với tế bào MG63 Kết thí nghiệm AlamarBlue thể Hình 3.32 Sự khử màu alamarBlue cho biết tồn phát triển tế bào Mẫu đối chứng Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 3.19 Khả phát triển tế bào MG63 môi trường chứa mẫu khuôn định dạng tổng hợp với dung môi 1,4-dioxan (S1, S2, S3 S4) sau 3, ngày Kết thí nghệm cho thấy cường độ huỳnh quang mẫu thí nghiệm cao mẫu đối chứng tăng thời gian nuôi 18 cấy tăng từ đến ngày nuôi Các mẫu có bổ sung 10 % HAp, cường độ huỳnh quang cao mẫu lại Điều chứng tỏ tất mẫu có tương thích tốt với tế bào đặc biệt mẫu có bổ sung HAp Sự có mặt HAp thúc đẩy phát triển tế bào khuôn định dạng Tuy nhiên, tỷ lệ HAp cao mẫu khuôn định dạng ức chế phát triển tế bào Kết nghiên cứu bám dính phát triển tế bào lên khuôn định dạng qua kính hiển vi laser đồng tiêu cự thể Hình 3.33 Quan sát hình ảnh mẫu sau ngày ngày nuôi cấy ta thấy số lượng tế bào mẫu tăng lên đáng kể, mẫu xuất tế bào bám dính, phát triển phân bố Đặc biệt, mẫu S4 quan sát thấy lượng lớn tế bào với mạng lưới cytoskeleton phát triển dày đặc sau ngày Khi thời gian nuôi cấy tăng lên, S4 thể tính tương thích sinh học cao mẫu mà có tỷ lệ HAp thấp (thể bám dính tốt tế bào phân bố tốt mạng lưới cytoskeleton) ngày ngày Hình 3.20 Sự bám dính phát triển tế bào MG63 khuôn định dạng (S1, S2, S3 S4) sau ngày 3.2.2 Các kết nghiên cứu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi chloroform 3.2.2.1 Các kết khảo sát hình thái bề mặt mẫu khuôn định dạng composit phương pháp SEM Hình 3.34 cho thấy hình thái cấu trúc lỗ mẫu khuôn định dạng F1, F2, F3 giống với mẫu khuôn định 19 dạng S1, S2, S3 S4 tổng hợp sử dụng dung môi 1, dioxan Khi tăng tỷ lệ HAp lên 10 30%, hình thái bề mặt mẫu F2, F3 thô rắp thành lỗ xốp dày lên Kích thước lỗ mẫu đo ảnh SEM phần mềm ImageJ tổng hợp Bảng 3.15 (a1) F1 (b1) F2 (c1) F3 Hình 3.21 Ảnh SEM mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA tổng hợp với dung môi chloroform (F1, F2 F3) Bảng 3.5 Thành phần kích thước lỗ xốp mẫu khuôn định dạng tổng hợp với dung môi chloroform Mẫu Tỷ lệ HAp/PDLLA Kích thước lỗ (µm) F1 0% 244.97 ± 91 F2 10% 176.611 ± 67 F3 30% 129.309 ± 41 Các kết phân tích tỷ lệ HAp ảnh hưởng đến kích thước lỗ mẫu khuôn định dạng F1, F2 F3 sử dụng dung môi chloroform So sánh kích thước lỗ mẫu F1, F2 F3 với mẫu tương ứng tỷ lệ HAp S1, S2 S4, kết phân tích thống kê cho thấy mẫu F1, F2, F3 khác biệt đáng kể so với mẫu S1, S2, S4 (P>0,05) Như vậy, thay dung môi 1,4 dioxan dung môi chloroform tổng hợp khuôn định dạng HAp/PDLLA không làm thay đổi hình thái kích thước lỗ khuôn định dạng 3.2.2.2 Các kết phân tích XRD Kết phân tích phổ XRD cho thấy phổ mẫu khuôn định dạng composit HAp/PDLLA có xuất vạch nhiễu xạ đặc trưng cho HAp vùng 2θ = 32o, mẫu polymer PDLLA Điều chứng tỏ, hạt nano HAp gắn lên pha polymer 20 140 Lin(Cps) Cường độ 120 100 80 60 PDLLA 40 HAp/PDLLA 20 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 2-Theta scale 2θ Hình 3.22 Giản đồ mẫu khuôn định dạng PDLLA HAp/PDLLA sử dụng dung môi chloroform 3.2.2.3 Kết đo độ xốp Độ xốp mẫu khuôn định dạng F1, F2 F3 đo theo phương pháp bão hóa chất lỏng trình bày mục 2.4.5 Kết đo độ xốp mẫu thể bảng 3.16 hình 3.36 Bảng 3.6 Độ xốp khuôn định dạng tổng hợp sử dụng hai dung môi khác chloroform 1, 4-dioxan Tỷ lệ HAp/PDLLA 1,4-dioxan Chloroform 0% 89.39±2.86 % 83 ± 3% 10% 84.46±2.17 % 76 ± 2% 30% 80.18±0.78 % 73 ± 2% Kết đo cho thấy, độ xốp khuôn định dạng sử dụng dung môi chloroform giảm tỷ lệ HAp tăng Lần lượt so sánh mẫu F1, F2 F3 với mẫu tương ứng tỷ lệ HAp S1, S2 S4 Kết phân tích cho thấy độ xốp mẫu F1 (độ xốp trung bình 83%) S1 (độ xốp trung bình 89,39%) khác biệt (P>0,05), độ xốp mẫu F2 F3 có khác biệt rõ rệt so với độ xốp mẫu S2 (độ xốp trung bình 84,46 %) S4 (độ xốp trung bình 80,18%) (P 70% với kích thước lỗ xốp dao động khoảng 117-254 µm - Các mẫu khuôn định dạng với tỷ lệ HAp từ 20-30% thể hoạt tính sinh học cao ngâm dung dịch SBF, thời gian hình thành lớp apatit giống xương sau ngày ngâm dung dịch SBF - Các mẫu khuôn định dạng có khả tương thích sinh học với tế bào MG63 Độ xốp kích thước lỗ trung bình khoảng 83-84% 183-245 µm tốt cho phát triển tế bào MG63 - 24 ... tài:’ Tổng hợp nghiên cứu tính tương thích sinh học khả tạo mô xương vật liệu composit Poly (D, L) lactic axit/hydroxyapatit’’ Mục tiêu luận án: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu composit sinh học gồm... tính sinh học; vật 1.1 liệu composit tổng hợp từ dạng vật liệu (polyme /vật liệu vô hoạt tính sinh học) Trong hợp chất vô có hoạt tính sinh học HAp bật với hoạt tính sinh học cao, nghiên cứu ứng... vật liệu chế tạo khuôn định dạng Vật liệu sinh học nghiên cứu để chế tạo khuôn định dạng ứng dụng kỹ thuật tạo mô gồm dạng chính: vật liệu polyme phân hủy sinh học; vật liệu vô có hoạt tính sinh