MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Xuất phát từ nhu nâng cao giá trị kinh tế giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng phế liệu ngành ngành chế biến tôm mang lại, cần tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu tôm Một sản phẩm đƣợc tạo từ chitin phế liệu tôm N- acetylglucosamine (hay NAG), có tiềm chữa bệnh nhƣ viêm khớp, viêm dày, Ngoài NAG có đặc tính chống ung thƣ đƣợc dùng chữa trị bệnh tự miễn dịch So với phƣơng pháp sản xuất NAG từ chitin phƣơng pháp hóa học sản xuất NAG chitinase từ vi sinh vật có nhiều ƣu điểm nhƣ thân thiện môi trƣờng, tạo sản phẩm tự nhiên không chứa dƣ lƣợng chất hóa học Các nghiên cứu thu nhận NAG từ chitin chitinase từ vi sinh vật khiêm tốn chƣa đầy đủ, đặc biệt trình tinh NAG Do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận Nacetylglucosamine (NAG) chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng” Mục tiêu nghiên cứu: - Thu nhận xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật từ Penicillium oxalicum 20B - Thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm Việt Nam chế phẩm chitinase kỹ thuật Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B - Thu nhận xác định đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật - Nghiên cứu thủy phân chitin để thu NAG chế phẩm chitinase kỹ thuật nhận đƣợc - Nghiên cứu thu nhận chế phẩm NAG tinh hƣớng tới ứng dụng vào thực phẩm chức Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án * Ý nghĩa khoa học: Là công trình nghiên cứu có hệ thống điều kiện lên men sinh tổng hợp, thu nhận chế phẩm enzym chitinase có hoạt tính endochitinase NAHase từ chủng Penicillium oxalicum 20B để ứng dụng thủy phân chitin từ phế liệu tôm thu nhận NAG tinh có tiềm ứng dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức * Ý nghĩa thực tiễn: Quy trình thu nhận NAG từ chitin phế liệu tôm phƣơng pháp enzym sử dụng chitinase có tính khả thi góp phần tạo giá trị gia tăng từ phế liệu tôm giải pháp công nghệ thân thiện với môi trƣờng Những đóng góp luận án - Là công trình công bố cách hệ thống đặc tính enzym điều kiện lên men sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B - Đã tạo chế phẩm chitinase kỹ thuật từ P oxalicum 20B xác định đặc tính chế phẩm, ứng dụng để thủy phân chitin thu Nacetylglucosamine Đặc biệt ảnh hƣởng cấu tử endochitinase N-acetylhexosaminidase hỗn hợp chế phẩm chitinase kỹ thuật đến hiệu suất tạo N-acetylglucosamine đƣợc xem xét - Đã đƣa qui trình tinh N-acetylglucosamine từ dịch thủy phân chitin xác định đặc tính chế phẩm Nacetylglucosamine phù hợp để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức Cấu trúc luận án: Luận án bao gồm 127 trang, đó: Phần mở đầu: trang, Chƣơng - Tổng quan tài liệu: 29 trang, Chƣơng - Nguyên vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu: 14 trang, Chƣơng - Kết thảo luận: 49 trang, phần Kết luận kiến nghị: trang, Các công trình tác giả công bố liên quan đến đề tài luận án: trang, phần Tài liệu tham khảo: 11 trang, phần Phụ lục: 21 trang CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 N- ACETYLGLUCOSAMINE 1.1.1 Các đặc tính N- acetylglucosamine 1.1.2 Vai trò N- acetylglucosamine sản xuất thực phẩm chức 1.1.3 Các phƣơng pháp sản xuất N- acetylglucosamine 1.1.3.1 Phƣơng pháp hóa học 1.1.3.2 Phƣơng pháp chuyển hóa sinh học 1.1.3.3 Phƣơng pháp enzym 1.2 CHITIN 1.2.1 Cấu tạo hóa học tính chất lý hóa chitin 1.2.2 Nguồn thu nhận chitin 1.3 CHITINASE 1.3.1 Hệ chitinase 1.3.2 Đặc tính sinh hóa 1.3.3 Cơ chế thủy phân chitin chitinase thành NAG 1.3.4 Một số giải pháp kỹ thuật thủy phân chitin thu nhận NAG 1.3.4.1 Các giải pháp tiền xử lý chitin 1.3.4.2 Điều kiện thủy phân chitin NAG chế phẩm chitinase 1.4 SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 1.4.1 Nguồn vi sinh vật sinh tổng hợp chitinase 1.4.2 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.3 Ảnh hƣởng nguồn nồng độ nitơ tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.4 Ảnh hƣởng nguyên tố khoáng tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.5 Ảnh hƣởng pH tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.6 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.7 Ảnh hƣởng thời gian tới sinh tổng hợp chitinase 1.4.8 Ảnh hƣởng tốc độ lắc cƣờng độ khuấy tới sinh tổng hợp chitinase 1.5 PHƢƠNG PHÁP THU NHẬN CHITINASE TỪ VI SINH VẬT 1.5.1 Phân tách tạp chất rắn thu dịch chiết enzym 1.5.2 Cô đặc dịch chiết enzym 1.6 CÁCPHƢƠNGPHÁP TINHSẠCHNAGTỪDỊCHTHỦY PHÂNCHITIN 1.6.1 Ly tâm, siêu lọc loại tạp chất 1.6.2 Cô đặc 1.6.3 Kết tinh 1.6.4 Tinh NAG dung môi 1.6.5 Qui trình tinh để thu nhận NAG CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên vật liệu 2.1.2 Chủng vi sinh vật 2.1.3 Hóa chất 2.1.4 Thiết bị 2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 2.2.1 Phƣơng pháp xác định sinh khối nấm mốc 2.2.2 Phƣơng pháp phân tích hóa lý 2.2.2.1 Phƣơng pháp xác định độ ẩm 2.2.2.2 Phƣơng pháp định lƣợng (NAG)i 2.2.2.3 Phƣơng pháp xác định Nitơ tổng số mẫu chitin 2.2.2.4 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein mẫu chitin 2.2.2.5 Cách tính hàm lƣợng chitin 2.2.3 Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzym 2.2.3.1 Hoạt độ chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Binod cải tiến 2.2.3.2 Hoạt độ endochitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp Yabuki cải tiến 2.2.3.3 Hoạt độ -N-acetyl-D-hexosaminidase 2.2.3.4 Hoạt độ chitobiosidase 2.2.4 Phƣơng pháp xác định cấu trúc bề mặt chitin, NAG 2.2.5 Phƣơng pháp xác định đặc tính vật lý chitin, NAG 2.2.6 Phƣơng pháp xác định cấu trúc chitin, NAG 2.2.7 Phƣơng pháp xác định sai số trung bình 2.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng sinh tổng hợp chitinase 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.3 Khảo sát đặc tính chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.4 Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật 2.3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu thủy phân chitin 2.3.5.1 Phƣơng pháp tiền xử lý chitin 2.3.5.2 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện phản ứng thủy phân 2.3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu thu nhận N-Acetylglucosamine tinh CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ P OXALICUM 20B 3.1.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng lên men 3.1.1.1 Ảnh hƣởng dạng chitin tới sinh tổng hợp chitinase Dạng chitin ảnh hƣởng không nhiều đến hoạt tính chitinase thể kết Hình 3.1 Trong trình lên men, hoạt độ chitinase nhận đƣợc với 03 dạng chitin dao động từ 0,062 U/ml tới 0,065 U/ml đạt cao thời điểm 120 h Do đó, chitin dạng thô đƣợc lựa chọn làm chất cảm ứng nhằm giảm công sức, hóa chất lƣợng 3.1.1.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng chitin tới sinh tổng hợp chitinase 0.062 0.065 Hoạt độ chitinase (U/ml) Hoạt độ chitinase (U/ml) 0.080 0.063 0.060 0.040 0.020 0.08 0.064 0.053 0.06 0.04 0.02 0.009 0.009 0.000 Không có chitin 0.050 0.043 Chitin thô Chitin nghiền Chitin dạng gel (600μm - 2mm) Hình 3.1 Ảnh hưởng dạng chitin tới hoạt tính chitinase thời điểm lên men Nồng độ chitin thô (g/l) 72 h 72 h 96 h 120 h 144 h 96 h 120 h 144 h Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase thời điểm lên men Khảo sát nồng độ chitin thô từ đến (g/l) cho thấy khả sinh tổng hợp chitinase đạt cực đại 0,064 U/ml nồng độ chitin thô (g/l) (Hình 3.2) 3.1.1.3 Ảnh hƣờng nguồn nitơ tới sinh tổng hợp chitinase Nguồn nitơ ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp chitinase đƣợc thực 05 nguồn khác (CNM, NaNO3 urea, CNM kết hợp với NaNO3 urea) với lƣợng 10 g/l Định kỳ thu dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết Hình 3.3 Nguồn nitơ CNM cho hoạt độ chitinase đạt cao (0,066 U/ml) Nên CNM 10 (g/l) nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase từ P oxalicum 20B 3.1.1.4 Ảnh hƣởng hàm lƣợng cao nấm men tới sinh tổng hợp chitinase Chọn CNM làm nguồn nitơ bổ sung, kết Hình 3.4 cho thấy nồng độ CNM từ g/l đến 15 g/l, hoạt tính chitinase đạt cao nồng độ 10 g/l 0,065 U/ml Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase thời điểm lên men Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men tới hoạt tính chitinase thời điểm lên men 3.1.2 Ảnh hƣởng điều kiện lên men 3.1.2.1 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng lên men tới sinh tổng hợp chitinase P.oxalicum 20B sinh tổng hợp chitinase cao pH 5, hoạt độ enzym nhận đƣợc 0,064 U/ml chitinase thời gian 120 h lên men 3.1.2.2 Ảnh hƣởng tốc độ lắc tới sinh tổng hợp chitinase Hình 3.5 Ảnh hưởng pH môi trường tới khả sinh tổng hợp chitinase trình lên men Hình 3.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc khả sinh tổng hợp hitinase trình lên men Nghiên cứu ảnh hƣởng tốc độ lắc đến khả sinh tổng hợp enzym từ P oxalicum 20B đƣợc thực với thông số nhƣ thí nghiệm trên, nhƣng tốc độ lắc đƣợc thay đổi từ 100 v/p - 180 v/p Định kỳ lấy dịch lên men để xác định hoạt độ chitinase cho kết Hình 3.6 Khảo sát tốc độ lắc từ 100 v/p tới 180 v/p cho thấy hoạt độ chitinase đạt cao 0,074 U/ml lắc 160 v/p Do sinh tổng hợp chitinase tốt đạt 0,074 U/ml môi trƣờng lên men thích hợp chứa g/l cảm ứng chitin thô, 10 g/l cao nấm men pH 5; lắc với tốc độ 160 v/p 3.1.3 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng phát triển sinh tổng hợp chitinase Nghiên cứu đƣợc tiến hành với điều kiện thích hợp lựa chọn Trong trình lên men, pH giảm dần từ pH 6,67 xuống pH 5,50 giữ ổn định tới kết thúc lên men Sinh khối tăng nhanh chóng đạt cực đại sau 48 h (0,75 g/l), giảm liên tục tới cuối trình lên men Hoạt tính chitinase tăng lên đáng kể pha sinh trƣởng cân đạt cao cuối pha cân Hoạt tính chitinase bắt đầu tăng sau lên men 24 h đạt cực đại 0,074 U/ml 120 h, sau giảm nhanh 0,051U/ml 144 h lên men (Hình 3.7) Bảng 3.1 Động thái sinh tổng hợp chitinase, endochitinase, NAHase trình lên men P oxalicum 20B Hình 3.7 Động thái sinh tổng hợp chitinase Hình 3.8 Khả thủy phân dịch gel chitin 50% thành đường khử dịch lên men chứa chitinase lấy thời điểm lên men khác (dịch lên men pha loãng 02 lần Hình 3.9 Sắc ký TLC sản phẩm thủy phân từ gel chitin 50% dịch lên men pha loãng lần (1) NAG chuẩn; (2) Đối chứng;( 3), (4), (5), (6), (7), (8) tương ứng thời gian lấy mẫu dịch lên men 72 h; 96 h; 108 h; 120 h; 132 h; 144 h Kết Bảng 3.1 thời gian lên men từ 24 h đến 144 h, hoạt tính chitinase, endochitinase, NAHase tăng đạt cực đại 0,074 U/ml, 5,058 U/ml, 0,683 U/ml tƣơng ứng 120 h lên men Sự kiểm định hoạt tính thời điểm lấy mẫu dịch lên men đƣợc xác định thủy phân gel chitin 50% (ở điều kiện pH 5, nhiệt độ 35oC, tỷ lệ dịch lên men/ dịch gel chitin 1/1) thành đƣờng khử (Hình 3.8) nhƣ thành NAG tăng tƣơng ứng (Hình 3.9) Từ sở nghiên cứu điều kiện pH 5, lắc với tốc độ 160 v/p, g/l chitin thô, 10 g/l CNM thời gian lên men 120 h đƣợc lựa chọn để sinh tổng hợp enzym từ P oxalicum 20B cho nghiên cứu 3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CHẾ PHẨM CHITINASE KỸ THUẬT 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu hồi Dịch chứa chitinase nhận đƣợc sau lên men điều kiện tối ƣu đƣợc loại tạp chất cô đặc Do ảnh hƣởng lớn độ nhớt nên mức cô đặc cao cô đặc lần Hoạt tính chitinase, NAHase, endochitinase phân đoạn enzym nhận đƣợc thể Bảng 3.2 Tỷ lệ cô đặc tăng, hoạt tính chitinase, NAHase endochitinase phân đoạn màng tăng Ngoài ra, tỷ lệ cô đặc tăng từ đến lần tỷ lệ H/E phân đoạn màng cao hẳn từ 0,141 đến 0,170 cao so với tỷ lệ H/E dịch enzym 0,129 Và tỷ lệ cô đặc lần tỷ lệ H/E enzym phân đoạn màng lớn gấp 17 lần so với tỷ lệ H/E enzym phân đoạn dƣới màng Bảng 3.2 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hoạt tính tỷ lệ chitinase, NAHase endochitinase (endo) phân đoạn lọc màng Bảng 3.3 Ảnh hưởng mức độ cô đặc tới hiệu suất thu nhận chitinase, NAHase endochitinase chế phẩm lọc màng Hiệu suất thu hồi (HSTH) enzym cô đặc hệ thống lọc dòng ngang QuixStandTM màng lọc MWCO 10kDa thể Bảng 3.3 Mức độ cô đặc cao, HSTH enzym màng giảm Trong giảm mạnh endochitinase 61,66%, chitinase 76,39% giảm NAHase 81,27% sau cô đặc lần Sự giảm HSTH phần enzym qua màng lọc, thể mức độ tăng HSTH chitinase dịch qua màng Tuy nhiên, tính HSTH tổng enzym dƣới màng thấp 100% Chứng tỏ phần enzym bị vô hoạt trình siêu lọc Nên mức cô đặc lần đƣợc chọn để lấy phần màng thu chế phẩm enzym kỹ thuật 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ NAHase/Endochitinase tới khả tạo NAG Ở mức độ cô đặc enzym lần, phân đoạn màng đƣợc pha loãng tới nồng độ enzym với phân đoạn dƣới màng (nồng độ enzym 0,0024 U/ml chitinase) Phản ứng thủy phân gel chitin 10% thực với liều lƣợng enzym điều kiện pH nhiệt độ 35oC Tại thời điểm thủy phân ta có phổ sản phẩm tạo thành theo phƣơng pháp TLC thể Hình 3.10 Phân đoạn enzym màng cho sản phẩm thủy phân vệt từ đƣờng đến đƣờng chủ yếu NAG, nhƣng sản phẩm thủy phân phân đoạn dƣới màng hỗn hợp NAG NAGi (với i khác 1) thể đƣờng - Trên sở tỷ lệ H/E 02 phân đoạn enzym nghiên cứu khác (0,170 0,010), vai trò NAHase thủy phân chitin triệt thành NAG đƣợc khẳng định rõ rệt Ngoài ra, ảnh hƣởng tỷ lệ H/E tới khả thủy phân chitin thành NAG phân đoạn enzym màng (tƣơng ứng tỷ lệ cô đặc 2; 3; lần) đƣợc pha loãng đơn vị hoạt độ chitinase 0,037 U/ml, có cấu NAHase endochitinase Bảng 3.4 để thủy phân 50% gel chitin điều kiện 35 oC, pH 5, tỷ lệ E/S 1/1 (v/v) Sau 15 h thủy phân, NAGi (với i từ – 3) tạo thành đƣợc định lƣợng phƣơng pháp HPLC cho thấy tất dịch thủy phân không chứa 2NAG (tức NAG2), không chứa 3NAG (tức NAG3), chứa NAG với hàm lƣợng tăng tỷ lệ H/E tăng thể Bảng 3.4 Tỷ lệ cô đặc cao (từ đến lần) làm tỷ lệ H/E tăng (từ 0,129 lên 0,170) giúp lƣợng NAG tạo thành lớn dần (từ 5,16 lên 9,49 mg/ml) Nên trình cô đặc làm tăng hoạt độ chitinase, NAHase, endochitinase (U/ml) nhƣ tỷ lệ H/E nên giúp HSTP chitin NAG tăng Nhƣ vậy, enzym cô đặc lần màng đƣợc gọi chế phẩm enzym kỹ thuật đƣợc lựa chọn dùng nghiên cứu thủy phân chitin NAG Bảng 3.4 Cơ cấu NAHase endochitinase (endo) phân đoạn enzym (cùng chung hoạt độ chitinase 0,037 U/ml) từ phân đoạn enzym Hình 3.10 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân gel chitin 10% phân đoạn cô đặc lần màng màng (cùng hoạt độ 0,0024 U/ml chitinase) điều kiện pH nhiệt độ 35oC Mô tả Hình 3.10: 1, 2, 3, 4: sản phẩm thủy phân phân đoạn màng cô đặc lần thời gian 24 h; 12 h; h; h; 5: Chất chuẩn NAG; 6, 7, 8, 9: sản phẩm thủy phân phân đoạn qua màng cô đặc lần h; h; 12 h; 24 h 3.2.3 Lựa chọn điều kiện bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật Bảo quản nhiệt độ 4oC, thời gian từ 30 đến 120 ngày, hoạt tính chitinase ổn định (hoạt tính chitinase lại khoảng 85% đến 82,5%) bảo quản NaCl 3%, tiếp đến 0,1% Benzoat natri, ổn định giải pháp glycerol 20%, hỗn hợp glycerol 20% với NaCl 3% hay mannitol M với NaCl 3% Do chế độ NaCl 3% 4oC dùng để bảo quản chế phẩm chitinase kỹ thuật hợp lý 3.2.4 Xác định đặc tính sinh học chế phẩm chitinase kỹ thuật Chế phẩm chitinase kỹ thuật có hoạt độ 0,239 U/ml chitinase, 2,152 U/ml HAHase 12,695 U/ml endochitinase nhận đƣợc sau cô đặc lần màng đƣợc đem xác định đặc tính 3.2.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính enzym Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính enzym chế phẩm đƣợc xem xét qua hoạt lực xúc tác độ bền hoạt lực enzym thể Hình 3.11 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) chế phẩm enzym kỹ thuật Sự giảm hoạt độ enzym 30 C (); 35 C (); 40 C (), 45 C () 50 C () Khoảng nhiệt độ thích hợp cho xúc tác chitinase 35 C - 40 C tối ƣu 40oC thể Hình 3.11 A Kết Hình 3.11 C Hình 3.11 E cho thấy endo NAHase có khoảng nhiệt độ thích hợp 35 C - 40 C Đánh giá độ bền hoạt lực enzym với nhiệt độ, chế phẩm enzym đƣợc giữ môi trƣờng pH nhiệt độ khác từ 30 - 50 C ngày Sau đó, xác định hoạt độ enzym kết biểu diễn Hình 3.11 B, Hình 3.11 D, Hình 3.11 F Chế phẩm chitinase không bền nhiệt Nhƣ nhiệt độ 45 C 50 C sau ngày, hoạt độ NAHase cao lần lƣợt 71% 57%, nhƣng hoạt độ endochitinase giảm không hoạt độ chitinase tổng không tìm thấy Ở 40oC hoạt tính chitinase tối ƣu, hoạt độ chitinase lại khoảng 20% sau ngày Do để ứng dụng chế phẩm cho thủy phân chitin không nên kéo dài ngày 3.2.4.2 Ảnh hƣởng pH tới hoạt tính enzym Ảnh hƣởng pH tới hoạt tính enzym chế phẩm enzym kỹ thuật đƣợc xem xét qua hoạt lực xúc tác độ bền hoạt lực enzym thể Hình 3.12 Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính chitinase (A), endochitinase (C), NAHase (E) tới độ bền chitinase (C), endochitinase (E), NAHase (F) chế phẩm enzym kỹ thuật Sự giảm hoạt độ enzym pH (), pH (), pH (), pH (), pH (), pH tối ƣu cho xúc tác chitinase, endochitinase, NAHase lần lƣợt pH 5, pH 4, khoảng pH - pH Chitinase có khoảng giá trị pH thích hợp vùng axit (pH - pH 6) (Hình 3.12 A) Endochitinase thể rõ enzym axit (pH - pH 5) (Hình 3.12 C) Khác với 02 loại enzym NAHase tƣơng đối bền với thay đổi pH (Hình 3.12 E) 3.3 ỨNGDỤNGCHẾ PHẨM CHITINASEKỸTHUẬT THỦYPHÂNCHITIN 3.3.1 Khảo sát lựa chọn chitin phế liệu thủy sản 10 Đường khử (mg/ml) Khảo sát chitin (từ tôm mũ ni, sú mai mực) chitin tôm mũ ni cho hiệu suất thủy phân cao Nên chitin mũ ni đƣợc chọn để nghiên cứu 3.3.2 Lựa chọn phƣơng pháp tiền xử lý chitin tôm mũ ni 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ nghiền đến khả thủy phân chitin Chitin tôm mũ ni đƣợc nghiền máy nghiền bi, đƣợc phân loại theo kích thƣớc phân tử hệ rây (kích thƣớc lỗ rây từ 63 µm đến 600 µm), sau xác định trọng lƣợng hàm lƣợng chitin phân đoạn Ảnh hƣởng mức độ nghiền tới khả thủy phân chitin cho thấy lƣợng đƣờng khử nhận đƣợc tăng tỷ lệ thuận với mức độ nghiền (Hình 3.13) Nhƣ mức độ nghiền bi cao, giúp giảm kích thƣớc làm giảm độ kết tinh chitin nguyên liệu tạo điều kiện cho enzym tiếp xúc mạnh với chất Do nghiền bi chitin cho kích thƣớc bé hiệu thủy phân chitin cao 3.3.2.2 Ảnh hƣởng xử lý phối hợp nghiền bi siêu âm tới khả thủy phân chitin Các phân đoạn bột chitin tôm mũ ni sau nghiền bi đƣợc đƣa vào siêu âm thời gian 60 phút, bổ sung chế phẩm enzym kỹ thuật Sau tiến hành thủy phân chitin nhiệt độ 40oC, lấy mẫu xác định lƣợng đƣờng khử tạo thành theo thời gian thủy phân 1.500 1.200 600µm