Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) (LV thạc sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NÔNG LỆ THÙY NGHIÊN CỨU THU THẬP VÀ LƢU TRỮ NGUỒN GEN CÂY THẤT DIỆP NHẤT CHI HOA (PARIS POLYPHYLLA SM.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS VŨ THỊ THU THỦY THÁI NGUYÊN - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ cho học vị Tác giả NÔNG LỆ THÙY i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ để hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học thầy cô giáo, cán Khoa, giúp đỡ tận tình TS Nguyễn Thị Thu Ngà, KTV Trần Thị Hồng giúp hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn hỗ trợ kinh phí đề tài NCKH cấp Bộ có mã số - - - Sinh họ ủ trì - Tôi xin cảm ơn động viên gia đình, bạn bè suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Tác giả NÔNG LỆ THÙY ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục .iii Danh mục bảng v MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung Thất diệp chi hoa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học 1.1.3 Thành phần hóa học công dụng 1.1.4 Một số thuốc sử dụng Thất diệp chi hoa 1.2 Một số phương pháp định danh thực vật 1.3 Một số phương phương pháp lưu trữ bảo tồn giống trồng 10 1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ) 11 1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ) 12 1.3.3 Bảo tồn giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro 13 1.3.3.1 Cơ sở lý luận phương pháp bảo quản nhân giống in vitro 13 1.3.3.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 15 1.3.3.3 Các đường hướng nhân giống in vitro 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.1 Vật liệu 22 iii 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 23 Thu thập mẫu Thất diệp chi hoa tự nhiên, mô tả chụp ảnh 23 2.2.2 Phương pháp bảo tồn Thất diệp chi hoa Thái Nguyên 23 2.2.3 Phương pháp phân lập gen rpoC1 23 2.2.4 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24 2.2.5 Phương pháp xử lí số liệu 26 2.3 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 26 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết thu thập mẫu Thất diệp chi hoa số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam 27 3.1.1 Đặc điểm mẫu Thất diệp chi hoa thu thập huyện Bình GiaLạng Sơn 27 3.1.2 Đặc điểm mẫu Thất diệp chi hoa thu thập huyện Quản BạHà Giang 29 3.1.3 Đặc điểm mẫu Thất diệp chi hoa thu thập huyện Sa Pa- Lào Cai 30 3.2 Kết phân tích gen rpoC1 Thất diệp chi hoa 32 3.3 Kết nghiên cứu bảo tồn Thất diệp chi hoa trồng tỉnh Thái Nguyên34 3.4 Kết bảo tồn Thất diệp chi hoa in vitro 37 3.4.1 Kết khử trùng mẫu 37 3.4.2 Kết thăm dò môi trường nảy mầm phát sinh hình thái mẫu nghiên cứu 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4 Dichlorphenoxyacetic acid Cs Cộng CT Công thức ĐHST Điều hòa sinh trưởng IBA Indole-3-buttyric acid BAP 6-Benzylaminopurine IAA Indole - - acetic - acid MS Murashige and Skoog NAA 1-Naphthalene acetic acid GA3 Gibberellic acid DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Mẫu thu huyện Bình Gia - Lạng Sơn 27 Bảng 3.2 Số lượng mẫu Thất diệp chi hoa thu Hà Giang 29 Bảng 3.3 Số lượng mẫu Thất diệp chi hoa thu Sa Pa 31 Bảng 3.4 Tên loài mã số trình tự gen rpoC1 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng giá thể tới tỉ lệ sống Thất diệp chi hoa 35 Bảng 3.6 Đặc điểm sinh trưởng Thất diệp chi hoa phòng sinh trưởng Thái Nguyên 36 Bảng 3.7 Kết khử trùng hạt Thất diệp chi hoa 38 Bảng 3.8 Kết khử trùng Thất diệp chi hoa 40 Bảng 3.9 Kết khử trùng củ Thất diệp chi hoa 41 Bảng 3.10 Ảnh hưởng chất ĐHST đến hệ số nảy mầm củ 44 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Bảy hoa Hình 3.1 Cây Thất diệp chi hoa Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn 28 Hình 3.2 Mẫu Thất diệp chi hoa xã Hội Hoan, huyện Bình Gia 28 Hình 3.3 Mẫu củ thu Quản Bạ - Hà Giang 29 Hình 3.4 Quả hạt Thất diệp chi hoa thu Hà Giang 30 Hình 3.5 Cây Thất diệp chi hoa Sa Pa 31 Hình 3.6 Cây Thất diệp chi hoa phòng sinh trưởng in vitro Thái Nguyên 37 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 32 ất diệp chi hoa 34 rpo ệt Nam 34 Hình 3.9 Mẫu hạt Thất diệp chi hoa cấy môi trường MS 39 Hình 3.10 Mẫu khử trùng củ Thất diệp chi hoa 42 Hình 3.11 Ảnh hưởng chất ĐHST đến phát sinh hình thái mô 43 Hình 3.12 Mẫu từ củ Thất diệp chi hoa môi trường MS có bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng 44 Hình 3.13 Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính 45 Hình 3.14 Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l 45 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Thất diệp chi hoa có tên khoa học Paris polyphylla Sm., hay gọi Bảy hoa, độc cước liên, thiết đăng đài, chi hoa đầu, tảo hưu, thảo hà xà…[9] Chi Paris gồm 27 loài phân bố rộng khắp Châu Âu Châu Á tập trung nhiều Trung Quốc Chi Paris gồm loài từ 03lá đến 11 Loài Paris Polyphylla có 13 giống [52] Tại Việt Nam, Thất diệp chi hoa phát vùng núi Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp chi hoa Pectelot phát vào năm 1934 Sapa với nhiều loài khác [9] Theo y học cổ truyền, Thất diệp chi hoa có tác dụng nhiệt, giải độc, trị rắn cắn, trị viêm tuyến vú, trị sốt rét, trị ho lâu ngày [9] Trong năm gần đây, Thất diệp chi hoa phát có tác dụng diệt khuẩn, kháng viêm mạnh, ức chế virus, tăng cường chức tuyến thượng thận, an thần, trấn tĩnh, chống ho Đặc biệt, có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi ung thư dày, kéo dài tuổi thọ cho người bệnh [11], [42], [43], [46] Với nhiều tác dụng chống lại bệnh nên Thất diệp chi hoa đối tượng thu mua khai thác với số lượng lớn Bên cạnh đó, nạn phá rừng làm nương rẫy dẫn đến giảm khả tái sinh phân bố Thất diệp chi hoa tự nhiên bị thu hẹp Theo phân hạng độ góc bảo tồn, Thất diệp chi hoa xếp hạng EN A1 c,d, cấp đánh giá mức (R) Cây khuyến cáo khai thác, sử dụng hợp lí cần thiết phải lưu giữ bảo vệ nguồn gen [6] Việc lưu giữ bảo tồn giống trồng thực nhiều cách khác như: bảo tồn chỗ, bảo tồn chuyển chỗ bảo tồn in vitro Công tác tái sinh nhân giống vô tính Thất diệp chi hoa thực số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam như: Hà Giang, Sơn La, Lai Châu Tuy nhiên, kết tái sinh chưa mong muốn Trên sở tiến hành đề tài “Nghiên cứu thu thập lƣu trữ nguồn gen Thất diệp chi hoa (Paris polyphylla Sm.) nhằm bảo tồn nguồn gen phục vụ cho công tác phục tráng giống sau Mục tiêu nghiên cứu Thu thập số Thất diệp chi hoa số miên núi phía Bắc Việt Nam Bước đầu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu định loại mẫu Thất diệp chi hoa Lưu trữ số mẫu cấy Thất diệp chi hoa phòng sinh trưởng nuôi cấy in vitro Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm thu thập mẫu Thất diệp chi hoa số địa phương miền núi phía Bắc Việt Nam Phân lập xác định trình tự nucleotit gen rpoC1 Nghiên cứu số tiêu sinh lý, sinh trưởng Thất diệp chi hoa phòng sinh trưởng in vitro phòng công nghệ tế bào trường Đại học sư phạm Thái Nguyên Nghiên cứu bảo tồn Thất diệp chi hoa kỹ thuật nuôi cấy in vitro nghiệm cần phải đạt yêu cầu như: có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, có tỷ lệ mẫu sống cao thế, mẫu phải tồn tại, phân hóa, sinh trưởng tốt Để đạt mục đích này, cần phải tìm phương pháp khử trùng có hiệu Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết khử trùng thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng, phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu… Tuy nhiên kỹ thuật in vitro, hai yếu tố ảnh hưởng sâu sắc đến kết khử trùng hóa chất khử trùng thời gian khử trùng Loại hóa chất thường sử dụng để làm mẫu cấy thường chất hóa học như: canxihypocloxit (CaOCl2), natrihypoclorit (H2O2), clorua thủy ngân (HgCl2), axit clohydrich (HCl)… Việc lựa chọn hóa chất, nồng độ, thời gian khử trùng phụ thuộc lớn vào đặc điểm tình trạng mẫu cấy [20] Từ nguồn mẫu thu thập tiến hành lựa chọn phần hạt, phần củ non Thất diệp chi hoa làm vật liệu nuôi cấy Để đạt hiệu khử trùng cao lựa chọn hóa chất gồm javen, HgCl2, cồn HCl với nồng độ khác nhau, nhằm thu lượng mẫu cao 3.4.1.1 Kết khử trùng mẫu hạt Thất diệp chi hoa Ảnh hưởng hóa chất, thời gian nồng độ khử trùng đánh giá qua số tiêu: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết, tỷ lệ sống Sau tuần theo dõi thu kết trình bày bảng 3.7 đây: Bảng 3.7 Kết khử trùng hạt Thất diệp chi hoa Thời gian (phút) Số mẫu Hóa chất Nồng độ (%) Javen 65 15 (NaOCl) 75 HgCl2 0,1 Khí Clo Tỷ lệ mẫu (%) Mẫu nhiễm Mẫu 40 36 11,0 10 40 30 10 25,0 40 30 11 27,5 40 22 18 45,0 16 40 35 87,5 38 Nhìn vào bảng số liệu bảng 3.7 hạt Thất diệp chi hoa khử trùng với ba loại hóa chất javen, HgCl2, khí clo với nồng độ khác sau cấy lên môi trường MS thu lượng mẫu không giống Sử dụng javen nồng độ 65% thời gian 15 phút, thu 11% mẫu hạt Nâng nồng độ javen lên 75% giảm thời gian khử trùng xuống 10 phút thu 25% mẫu Tỷ lệ thấp khử trùng hạt HgCl2 nồng độ 0,1% phút đạt 27,5%, tăng thời gian khử trùng lên phút với nồng độ HgCl2 0,1% thu 45% mẫu Hiệu khử trùng cao sử dụng khí clo 16 mẫu thu tượng nhiễm tỷ lệ sống đạt 87,5% Đây công thức hiệu thí nghiệm trên, hạt trắng (hình 3.9) Tuy nhiên sau 04 tuần nuôi cấy chưa nhận thấy hạt có thay đổi Hình 3.9 Mẫu hạt Thất diệp chi hoa cấy môi trƣờng MS 3.4.1.2 Kết khử trùng mẫu Thất diệp chi hoa Chúng sử dụng HgCl2 javen để khử trùng Thất diệp chi hoa Việc khử trùng thực theo 03 cách mô tả mục 2.2.3, công thức thí nghiệm 20 bình mẫu (mỗi bình mẫu bố trí mảnh lá) 39 Mẫu khử trùng cấy lên môi trường MS bản, đánh giá kết khử trùng sau 02 tuần nuôi cấy thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết khử trùng Thất diệp chi hoa (Sau tuần nuôi cấy) Tỷ lệ mẫu Nồng độ Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) CT1 35 65 CT2 75 25 CT3 95 (%) Nhìn vào bảng 3.8, Thất diệp chi hoa khử trùng theo công thức khác sau khử trùng, cắt thành mảnh nhỏ có kích thước rộng khoảng 1cm dài 1,5cm sau cấy môi trường MS Sau 02 tuần theo dõi kết thu được: công thức sử dụng javen với nồng độ 7% để khử trùng 10 phút, sau tuần nuôi cấy kết thu 65% mẫu sạch, tăng thời gian khử trùng javen nồng độ 7% lên 15 phút công thức nhận thấy tỷ lệ mẫu giảm 25%, tỷ lệ mẫu nhiễm tăng lên từ 35 đến 75% Công thức khử trùng Thất diệp chi hoa cồn 70% phút, javen 20% 10 phút HgCl2 0,1% phút, kết tỉ lệ mẫu nhiễm chiếm cao tới 95%, mẫu đạt 5% Như vậy, công thức khử trùng Thất diệp chi hoa công thức khử trùng đạt hiệu cao công thức chiếm 65% mẫu sạch, thấp công thức đạt 5% mẫu 40 3.4.1.3 Kết khử trùng củ Thất diệp chi hoa Củ Thất diệp chi hoa sau rửa xà phòng nước máy đưa vào khử trùng cồn, javen thủy ngân HgCl2 theo bước mô tả mục 2.2.4 nồng độ khác cấy môi trường MS sau 02 tuần khử trùng thu kết thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết khử trùng củ Thất diệp chi hoa (Sau tuần) Công thức khử Số lƣợng củ mẫu nhiễm mẫu CT1 25 24 CT2 25 23 CT3 25 10 15 CT4 25 16 trùng (CT) Nhìn vào bảng 3.9 củ Thất diệp chi hoa khử trùng với công thức khác công thức có kết hợp hóa chất cồn 70%, javen 7% HgCl2 0,1% Trong đó, cồn sử dụng để khử trùng công thức giữ nguyên thời gian khử trùng phút, javen 7% tăng dần thời gian khử trùng từ CT1 đến CT4 phút đến phút công thức cách phút HgCl2 0,1% tăng dần thời gian khử trùng từ đến phút Qua CT nhận thấy CT1 CT2 đạt tỷ lệ mẫu thấp CT1 thấp thu mẫu sạch, CT2 thu mẫu sạch, tiếp đến CT4 đạt mẫu CT3 thu 15 mẫu công thức đạt hiệu khử trùng mẫu củ cao CT khử trùng 41 Hình 3.10 Mẫu khử trùng củ Thất diệp chi hoa 3.4.2 Kết thăm dò môi trường nảy mầm phát sinh hình thái mẫu nghiên cứu Từ năm 50 kỷ XX, người ta nhận thấy vai trò nhóm cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt đặc trưng lên phân hóa quan thực vật đặc biệt phân hóa chồi Vì vậy, để tăng hệ số nhân, người ta sử sụng thêm số chất có nhóm cytokinin môi trường nuôi cấy 3.4.2.1 Kết thăm dò môi trường nảy mầm hạt a Ảnh hưởng GA3 đến hệ số nảy mầm hạt GA3 loại gibberellin có công thức hóa học C19H22O6 Gibberellin kích thích nảy mầm hạt, nảy chồi mầm, có tác dụng việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ [63] Theo kinh nghiệm thực tiễn người dân, hạt Thất diệp chi hoa có thời gian ngủ dài, sau thu hoạch hạt đem gieo trồng sau - tháng hạt nảy mầm Chính vậy, sử dụng hạt Thất diệp chi hoa cấy môi trường MS có bổ sung GA3 nồng độ từ 0,3mg/l đến 1,9 mg/l để thăm dò môi trường nảy mầm hạt Tuy nhiên, sau 05 tuần theo dõi nhận thấy hạt thay đổi hạt b Ảnh hưởng BAP đến biến đổi hạt BAP chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin sử dụng thông dụng, nên nghiên cứu chọn cấy hạt môi trường MS có bổ sung BAP để khảo sát khả nảy mầm Thất diệp 42 chi hoa theo thí nghiệm Sau 04 tuần nuôi cấy không nhận thấy thay đổi hạt 3.4.2.2 Kết thăm dò môi trường phát sinh hình thái mô Quá trình tái sinh in vitro thông qua đường trực tiếp gián tiếp qua giai đoạn mô sẹo Với mục tiêu tạo khối mô sẹo từ lá, bổ sung vào môi trường nuôi cấy chất kích thích sinh trưởng loại 2,4D, IBA BAP nồng độ từ 1mg/l đến 4mg/l, bước nhảy 0,5mg/l Sau 03 tuần theo dõi mẫu có bổ sung 2,4-D nhận thấy mẫu bị màu diệp lục chuyển sang màu vàng, mẫu có bổ sung BAP IBA chuyển dần sang vàng chết đen Như vậy, ba loại auxin nồng độ tác dụng kích thích hình thành mô sẹo tạo chồi Thất diệp chi hoa hình 3.11 Hình 3.11 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến phát sinh hình thái mô 3.4.2.3 Kết thăm dò môi trường biến đổi tế bào lớp mỏng từ củ Xuất phát từ thành công công trình nghiên cứu nuôi cấy tế bào lớp mỏng khoai môn sọ [19] Sâm ngọc linh [28] Chúng tiến hành tạo tế bào lớp mỏng cắt ngang từ củ Thất diệp chi hoa Các lát cắt mỏng có kích thước rộng 0,5cm, dài 1cm dày 0,2cm, Cấy môi trường MS có bổ sung kích thích sinh trưởng IBA, 2,4-D, nồng độ từ 0,2mg/l đến 1,4mg/l bước nhảy nồng độ 0,2mg/l Sau 08 tuần nuôi cấy, mô nuôi cấy tượng tạo mô sẹo hay tạo đa chồi xuất Sau 08 tuần mảnh mẫu có tượng úa dần chết hình 3.12 43 ĐC IBA BAP 2,4D Hình 3.12 Mẫu từ củ Thất diệp chi hoa môi trƣờng MS có bổ sung thêm chất kích thích sinh trƣởng 3.4.2.4 Kết thăm dò môi trường biến đổi chồi củ nguyên vẹn Sau thực với phương pháp nuôi tế bào lớp mỏng không thu kết mong muốn Chúng chuyển sang phương pháp nuôi cấy giữ nguyên phần thân củ, sau thu mẫu củ tiến hành chuyển tổng số 21 mẫu sang môi trường có bổ sung BAP nồng độ từ 0,5mg/l đến 2,0 mg/l Kết theo dõi sau 30 ngày, thu kết bảng 3.9 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng chất ĐHST đến hệ số nảy mầm củ Công thức Nồng độ Số mẫu Tỷ lệ bật chồi 0,5 1,0 2,0 BAP + than hoạt 0,5 tính 1,0 BAP 44 Bảng số liệu 3.10 cho ta thấy, thu 02 mẫu nuôi cấy môi trường có bổ sung BAP nồng độ 0,5mg/l bật chồi, nhiên qua quan sát nhận thấy mẫu có bổ sung thêm than hoạt tính củ chồi phát triển nhanh mẫu bổ sung than hoạt tính, tính từ thời điểm bật chồi 30 ngày mẫu có bổ sung than hoạt tính có chiều cao 7cm, mẫu than hoạt tính đạt chiều cao chồi 1,5cm, lại 05 mẫu MS làm đối chứng không nhận thấy có thay đổi So với thí phương pháp nghiệm sử dụng chất kích thích sinh trưởng mảnh lá, hạt, hay củ lát mỏng nhận thấy có biệu sống, phương pháp thí nghiệm nuôi cấy thân củ môi trường MS có bổ sung BAP nồng độ 0,5mg/l bổ sung than hoạt hoạt tính hiệu Hình 3.13 Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính Hình 3.14 Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Cây Thất diệp chi hoa có mặt tỉnh Lạng Sơn, Hà Giang Lào Cai Việt Nam có dạng dị thảo từ hai đến tám Cây Thất diệp chi hoa nhân giống vô tính Thái Nguyên giá thể hỗn hợp đất cát theo tỷ lệ 1:1, điều kiện nhiệt độ 25oC ± 2, độ ẩm 50% - 70% Hạt trưởng thành Thất diệp chi hoa khử trùng hỗn hợp HCl javen với tỉ lệ : 20ml 16 giờ, thu 90% mẫu sạch; Lá khử trùng javen 7% 15 phút thu 65% mẫu sạch; Củ khử trùng hỗn hợp javen 70% phút + HgCl 0.1% phút thu 60% mẫu Môi trường nuôi cấy thân củ gồm MS + BAP 0,5mg/l + than hoạt tính thu 02 mẫu bật chồi ống nghiệm Sử dụng cặp mồi đặc hiệu rpoC1-1f/rpoC1-3r khuếch đại thành công gen rpoC1 từ DNA Thất diệp chi hoa Gen rpoC1 có kích thước 558 nucleotide Trình tự nucleotit gen rpoC1của Thất diệp cho hoa có mối quan hệ gần gũi với loài Paris verticillata voucher (độ tương đồng 99% ) ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nhân giống vô tính Thất diệp chi hoa nhằm lưu giữ phát triển nguồn gen thuốc quý Tiếp tục nghiên cứu giám định mẫu Thất diệp chi hoa thu thập loài khác Thất diệp chi hoa 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Lý Anh, Đinh Thị Phòng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô, NXB Nông nghiệp Hà Nội Lê Trần Chấn, Trần Ngọc Ninh, Trần Thị Thúy Vân (2013), “Đa dạng sinh học giải pháp bảo, phát triền bền vững vùng núi đá vôi tỉnh Hà Giang”, Hội thảo khoa học diễn đàn đầu tư Vì Hà Giang phát triển, 115-120 Lê Thị Kim Đào, Lê Thị Hạnh, Huỳnh Xuân Trường, Đỗ Thị Thu Hiền, Đoàn Minh Hải (2002), “Nghiên cứu thử nghiệm nhân số trồng rừng phương pháp nuôi cấy mô (bạch đàn E urophylla, hồng, giổi xanh, trầm hương)”, Trung tâm ứng dụng tiến khoa học kỹ thuật Bình Định, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật dự án SXTN KC.04DA9, 9-11 Lê Hồng Giang Nguyễn Bảo Toàn (2011), “Sự hình thành mô sẹo, phôi Mỏ quạ in vitro (Dischidia Raflesiana Wall)”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 20a 61-67 Mai Thị Phương Hoa, Đỗ Tiến Vinh (2012), “Thực hành nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tạp trí Khoa học Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, 2-13 Lê Thị Thanh Hương, Trần Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Ngọc Yến, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Nghĩa Thìn (2012), “Thực trạng loài thuốc quý tỉnh Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 28:173-194 Hoàng Thị Kim Hồng (2011), nghiên cứu khả tái sinh chồi cụm chồi nuôi cấy in vitro Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorunb.), Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 64(1), 23-32 Dương Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh 47 Đỗ Tất Lợi (2014), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức 10 Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết (1994), “Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống cẩm chướng”, Tạp chí khoa học, Đại học tổng hợp Đà Lạt, 7-11 11 Phan Lê, Lê Quý Ngưu, Tú Văn Lương (2002), Cây thuốc phòng trị ung thư, NXB Thuận Hóa, Huế 12 Trần Đình Long (1996), Chiến lược bảo tồn sử dụng nguồn tài nguyên di truyền trồng Việt Nam, Tài nguyên di truyền thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 54-61 13 Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus hại khoai tây, NXB khoa học Hà Nội 14 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2007), “Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật bảo tồn nguồn gen lát hoa Côn Đảo (Chukrasia taburais A Juss)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ - Viện Sinh học Nhiệt Đới, 367- 371 15 Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên tăng trưởng số thân gỗ nhiệt đới cận nhiệt đới điều kiện nuôi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 42 - 44 16 Mai Thị Tân (1993), “Phục tráng giống khoai tây Thường Tín phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Kết nghiên cứu khoa học khoa trồng trọt, Trường Đại học Nông Nghiệp 1, NXB Hà Nội, Tr 90 - 94 17 Nguyễn Thị Tần (2013), “Cây dược liệu - lợi để người dân vùng cao Lào Cai thoát nghèo”, Tạp chí kinh tế kỹ thuật Lào Cai:24: 455 18 Hoàng Minh Tấn, Vũ Quang Sáng, Nguyễn Kim Thanh, (2004), Sinh lý thực vật, NXB Đại học Sư phạm Hà Nội 19 Nguyễn Quang Thạch, Đào Huy Chiên, Đỗ Thị Bích Nga (2010), Kết nghiên cứu nhân giống khoai môn sọ phương pháp in vitro, Kết nghiên cứu khoa học công nghệ 2006 - 2010, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 573 - 580 20 Đoàn Thị Ái Thuyền, Nguyễn Thị Quỳnh, Trần Văn Minh, Nguyễn Đức 48 Hùng (1993) “Nhân Giống chuối phương pháp cấy mô”, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 21 Trung tâm nghiên cứu Tài nguyên Môi trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ Quốc gia (2001-2005), Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập 1-3, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 22 Nguyễn Văn Uyển (1985), Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật công tác chọn giống trồng, NXB TP Hồ Chí Minh 23 Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 24 Viện Khoa học Công Nghệ Việt Nam, Sách đỏ Việt Nam, 2007 25 Viện dược liệu (2003), “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam”, tập NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 182-184 26 Vũ Văn Vụ (1992), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục Tài liệu nƣớc 27 Bammi, R.K., Randhava, G.S (1975), Dioscorea Improvement Project Status Report IJHR Bangalore 28 Bhojwani S.S (1980), factors affecting in vitro stage of micropropagation Plant physiol., 65: 90 29 Chaturvedi, H.C., Sinha, M (1979), Mass propagation of Dioscorea floribunda by tissue culture Ext Bull No NBRI Lucknow India 30 Do,H.D.K., Kim,J.S., Kim,J.H.(2014), “Paris verticillata voucher KWU02222 plastid, complete genome”, Genome Biol Evol (7), 1699-1706 31 Doyle JJ, JL Doyle (1987), A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 19: 11-15 32 Deng, D., Lauren, D.R., Cooney, J.M., Jensen, D.J., Wurms, K.V., Upritchard, J.E., Cannon, R.D., Wang, M.Z., Li, M.Z (2008), Antifungal saponins from Paris polyphylla Smith Planta Med 24(11): 1397-1402 49 33 Devkota, K.P (2005), “Bioprospecting studies on Sarcococca hookeriana Bail, Sonchus wightianus DC, Paris polyphylla Smith and related Medicinal Herbs of Nepal”, Ph D Thesis, HEJResearch Institute of Chemistry, International Centre for Chemical Science, University of Karachi Pakistan, Karachi 75,270 34 Ford C.S, Ayres K.L, Toomey (2009), Selection of candidate coding DNA barcoding regions for use on DNA plants Botanical Journal of the Linnean Society, 159 (1): - 11 35 Haberlandt, G (1902) Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen Sitzungsber Akad Wiss Wien Math.-Naturwiss Kl., Abt J 111, 69 - 92 36 Jun, Z (1989), “Some bioactive substances from plants of West china”, Pure & Appl Chem, 61(3), 457 - 460 37 Kim M Wilson, Mark A Schembri, Peter D Baker, Christopher P Saint, (2000), ”Molecular characterization of the toxic cyanobacterium cylindrospermopsis raciborskii and design of a Species-Specific PCR”, Applied and Environmental Microbiology, 66 (1) 332 - 338 38 Kumar M.H., Dhiman V., Choudhary R., Chikara A (2014), Anticancer activity of hydroalcoholic extracts from Paris polyphylla rhizomes against human A549 lung cancer cell lines using MMT assay, IRJP, 5(4): 290 - 294 39 Lee KH, Kwon KR, Kang Wm, Jeon EM, Jang JH (2010), ”Identification and analysis of the chloroplast rpoC1 gene differentially expressed in wild giseng” , J Pharmacopuncture, 15(2): 20-3 40 Lee M.S., Yuet-Wa J.C., Kong S.K., Yu B., EngChoon V.O., Nai-Ching H.W., Wai T.M., Fung K.P (2005), Effects of polyphyllin D, a steroidal saponin in Paris polyphylla, in growth inhibition of human breast cancer cells and in xenograft, Cancer Bio Ther., 4(11): 1248-1254 41 Li P K., Yi X L., Tolga E., Else D., He S Y., Yang Z., Cheng Q X., Chao L., Thomas E., Bai P M (2012), “Polyhydroxylated Steroidal Glycosides from Paris polyphylla”, Journal of Natural Products, 75, 1201-1205 50 42 Li F.R., Jiao P., Yao S.T., Sang H., Qin S.C., Zhang W., Zhang Y.B., Gao L.L (2012), Paris polyphylla Smith extract induces apoptosis and activates cancer suppressor gene connexin26 expression, Asian Pac J Cancer Prev, 13(1): 205-209 43 Limasset cad Cornel (1949), Recherche du virus de la masoïque du tabac (Marmor tabaci Holmes) dans les méristèmes des plantes infectées, C.R Acad Sci Paris 228 1888-1890 44 Murashige T (1980) Plant Growth, Substances & Commercial uses of tissues verlarg, Berlin, Heidelberg, Newyork, 642-677 45 Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth on bio assays with tabaco tissue culture Physiol Plantar 15: 473-477 46 Murashige, T., Serpa, M., Jones, J.B (1974), Clonal multiplication of Gerbera Through tissue culture Hortcience, 9, 175-180 47 Morel, Martin (1952), Guerison de pomes de terre attains d’une maladie a virus C.R Acad Sci: 235, 1324 - 1325 48 Staritsky, G (1970), Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq) as a tool for its vegetative propagation, Euphytica, 288 - 292 49 Vijayan K, Tsoul C H (2010) DNA barcoding in plant: taxonomy in a new perspective, Curent Science, 99 (11): 1530-1538 50 Wang Qiang (2005): Acta Botanica of nanging pharmaceutical University in press, Journal of Chinese Pharmaceutical, 14(3), 1.762.180 51 Yan, L.L., Zhang, Y.J., Gao, W.J., Man, S.L., Wang, L (2009), In vitro anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var yunnanensis Exp Oncol., 31(1): 27-32 Trang Website 52 https://vi.wikipedia.org 53 ww.langson.gov.vn/binhgia/ /DE%20AN%20NTM%20BINH%20GIA 54 http://duan600.vn/huyen-ngheo/Huyen-Quan-Ba-Ha-Giang-28/ 51 55 http://trungtamhoclieuthainguyen.com/chi-tiet/danh-gia-da-dang-sinh-hocthuc-vat-dac-huu-va-quy-hiem-tai-vuon-quoc-gia-hoang-lien-huyen-sa-patinh-lao-cai-38747.html 56 http://timtailieu.vn/tai-lieu/phan-loai-sinh-hoc-phan-tu-32678/ 57 http://text.123doc.org/document/2575722-dai-cuong-ve-phan-loai-hoc-thucvat.htm 58 http://www botanyvn.com/default.asp 59 http://www.baithuocquy.com/suc-khoe/bai-thuoc-tu-cay-that-diep-nhat-chimai/d3277 60 http://www.zhongyao.org.cn/zy/tp/gj/201102/246087.html 61 https://websrv1.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch1.htm 62 http://www.vnbiobarcode.org/publication?id=27 63 http://www.bvtvhcm.gov.vn/handbook.php?id=13&cid=1 64 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 52 ... kỹ thu t sinh học phân tử nghiên cứu định loại mẫu Thất diệp chi hoa Lưu trữ số mẫu cấy Thất diệp chi hoa phòng sinh trưởng nuôi cấy in vitro Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm thu thập. .. Nguyên Nghiên cứu bảo tồn Thất diệp chi hoa kỹ thu t nuôi cấy in vitro Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung Thất diệp chi hoa 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây Thất diệp chi hoa có tên khoa... điểm mẫu Thất diệp chi hoa thu thập huyện Quản BạHà Giang 29 3.1.3 Đặc điểm mẫu Thất diệp chi hoa thu thập huyện Sa Pa- Lào Cai 30 3.2 Kết phân tích gen rpoC1 Thất diệp chi hoa 32