Header Page of 16 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Footer Page 1Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009 Footer Page 2Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học đã tận tì nh hướng dẫn và dì u dắt quá trì nh hoàn thành luận văn Luận văn thực Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với hỗ trợ kinh phí Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm gia cầm thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010 Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy tạo điểu kiện cho học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học , đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải – Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng , KS Hà Hồng Hạnh đã giúp đỡ và chỉ bảo rất tận tì nh suốt thời gian thực tập và thực hiện luận văn vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã cung cấp nguyên liệu bèo cho luận văn Cuối cùng , xin dành cho gia đì nh và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho suốt quá trì nh học tập và hoàn thành khóa luận Học viên Trần Thị Kim Dung Footer Page 3Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Trần Thị Kim Dung Footer Page 4Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 NHƢ̃NG TƢ̀ VIẾT TẮT Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid epp Eppendorf EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside kb Kilo base LB Luria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SHPT Sinh học phân tử TAE Tris – acetate – EDTA X - gal v/p 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide vòng/phút Footer Page 5Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Kích thước gen nhân số loài bèo 1.2 Thành phần hàm lượng hợp chất hữu có cánh bèo 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 43 pJETSpUbipin6R 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F Footer Page 6Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 50 Header Page of 16 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hoa Lemna gibba 1.2 Cây phân loại bèo theo Landolt cộng 1.3 Sinh sản vô tính hình thức nảy chồi S polyrrhiza 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 11 1.5 Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II sinh vật nhân chuẩn 12 1.6 Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin thực vật 14 2.1 Lemna aequinoctialis DB1; Spirodela polyrrhiza DB2 21 3.1 Điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 33 3.2 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài 34 bèo Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) vị trí mồi 3.3 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 36 3.4 Điện di plasmid gel agarose 0,8% 38 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme 39 3.6 Trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài bèo 40 Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán vùng chức promoter 3.7 Sơ đồ cấu trúc đoạn yếu tố điều khiển biểu gen ubiquitin loài 44 bèo Lemna aequinoctialis DB1 vị trí mồi 3.8 Điện di sản phẩm PCR gel agarose 0,8% 45 3.9 Điện di plasmid gel agarose 0,8% 47 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme 48 3.11 Trình tự đoạn promoter loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 với dự 49 đoán vùng chức promoter Footer Page 7Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 MỤC LỤC Lời cam đoan Những từ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Mục lục Trang MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung bèo 1.1.1 Phân bố bèo 1.1.2 Đặc điểm hình thái bèo 1.1.3 Cây phân loại bèo 1.1.4 Hình thức sinh sản bèo 1.1.5 Hệ gen bèo 1.1.6 Giá trị dinh dưỡng 1.1.7 Tiềm sử dụng bèo công nghệ sinh học 1.2 Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật 10 1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật 10 1.2.2 Cấu trúc promoter 11 1.2.3 Vai trò biểu gen promoter 13 1.2.4 Phân loại promoter 13 1.2.5 Ứng dụng promoter công nghệ gen thực vật 15 1.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen bèo 17 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 17 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 21 2.1 Nguyên liệu 21 Footer Page 8Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 2.1.1 Nguyên liệu thực vật 21 2.1.2 Hóa chất 21 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22 2.2.2 Phương pháp điện di DNA gel Agarose 24 2.2.3 Nhân gen kỹ thuật PCR 24 2.2.4 Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26 2.2.5 Xác định trình tự gen 30 2.2.6 Xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ bèo 31 3.2 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen loài S polyrhiza 33 3.2.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33 3.2.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pJET1.2 33 3.2.3 Xác định đoạn điều khiển biểu gen RE 38 3.2.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter 39 3.3 Phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen loài L aequinoctialis 43 3.3.1 Thiết kế tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43 3.3.2 Nhân đoạn DNA kỹ thuật PCR tách dòng vector pCR1.2 44 3.3.3 Xác định đoạn điều khiển biểu gen RE 46 3.3.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Footer Page 9Sốofhóa 16.bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 10 of 16 MỞ ĐẦU Khi người có sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, khu vực Tiểu Á lưu vực sông Nin người ta bắt đầu việc trồng trọt truyền thống với mục đích trì cải thiện chất lượng giống trồng nhằm thỏa mãn yêu cầu người ngày tốt Con người biết tạo giống trồng mang đặc tính mong muốn phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính hai dòng trồng) Phương pháp cần nhiều thời gian, công sức nhiều trường hợp lai thu kèm theo tính trạng không mong muốn Ngày nay, công nghệ gen sử dụng phương pháp đại khắc phục hạn chế Công nghệ gen cho phép nhà di truyền chọn giống thực vật xác định thiết kế gen đặc hiệu cho mục tiêu mong muốn (kể gen có nguồn gốc từ sinh vật khác loài) chuyển gen vào giống sử dụng, tạo giống trồng biến đổi gen mang đặc tính đáp ứng yêu cầu người đem lại lợi ích quan trọng tăng tính chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng suất chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng Công nghệ gen thực vật mở khả sử dụng thực vật nhà máy sản xuất loại thuốc cần thiết cho người vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin loại thuốc chữa bệnh khác [3] Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh gen có giá trị mã hoá cho tính trạng mong muốn, promoter cần thiết cho biểu gen nhận quan tâm đặc biệt nhà nghiên cứu công nghệ gen thực vật Promoter thành phần quan trọng cấu trúc tất gen, khởi đầu cho phiên mã, đóng vai trò then chốt việc biểu gen Việc phân lập promoter biểu gen hữu hiệu trồng, đặc biệt promoter đặc hiệu cho loại cây, biểu loại mô tế bào khác ngày quan tâm đến Nhiều promoter từ gen thực vật phân lập số phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter gen mã hóa sucrose synthase [4] Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có Footer Page 10 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 55 of 16 3.3.2.2 Tách dòng vector pCR2.1 Nhằm mục đích tách dòng xác định trình tự đoạn promoter, chúng tiến hành gắn sản phẩm PCR nhân giống bèo L.aequinoctialis DB2 vào vector pCR2.1 sử dụng hóa chất GeneJET TM PCR Cloning Kit nhờ đặc điểm ưu việt vector pCR2.1 Vecctor pCR2.1 chứa đầy đủ thành phần cần thiết vector tách dòng để tự chép tế bào chủ Vector có khả cho số lượng lớn tế bào (200 sao/ tế bào), có khả tải đoạn gen tốt ổn định tế bào chủ Đồng thời nhờ có kích thước nhỏ mà dễ dàng biến nạp vào tế bào pCR2.1 chứa vùng trình tự đa điểm cắt, mang hai dấu chuẩn chọn lọc gen kháng sinh ampicilin kanamycin Vector pCR2.1 thiết kế để nhân gen ngoại lai vùng MCS Ở đầu 3’ sợi gắn thêm nucleotide T Nucleotide T dễ dàng bắt cặp bổ sung với nucleotide A đầu 3’ sản phẩm PCR sử dụng Taq DNA polymerase Khi đó, sản phẩm PCR vector pCR2.1 tự nối ghép với cách dễ dàng Một đặc điểm cấu trúc vector pCR2.1 vùng MCS có chứa operon LacZα mã hóa cho enzym β-galactosidaza dấu hiệu chọn lọc trắng- xanh để biến nạp mang plasmid tái tổ hợp: môi trường có chứa chất Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D(-)-galactopyranoside) IPTG (isopropylthio--D-galactoside) khuẩn lạc tái tổ hợp có mầu trắng đoạn chèn làm bất hoạt enzyme Để chuẩn bị ghép nối, sản phẩm PCR tinh Wizard kit Như biết, việc sử dụng Taq DNA polymerase PCR tạo khoảng 70 - 90% sản phẩm PCR có thêm nucleotide A đầu 3’, phản ứng ghép nối sản phẩm PCR thực sau: µl đệm phản ứng 10X; µl sản phẩm PCR, µl H2O, µl vector pCR2.1 µl enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm phản ứng ghép nối đem biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Các tế bào sau nuôi cấy môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ml), Xgal (50g/ml) IPTG (50g/ml) 370C qua đêm Kết Footer Page 55 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 56 of 16 chúng thu nhiều khuẩn lạc trắng dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid Để xác định xem plasmid có thực mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tiến hành tách chiết DNA plasmid từ số khuẩn lạc để kiểm tra 3.3.2.3 Tách chiết plasmid DNA Kết hình 3.9 cho thấy giống bèo L aequinoctialis DB1 có dòng từ 1, 3, 4, 10, 11, 13, 14,15, 16 cao dòng đối chứng, kết luận sơ dòng chèn thêm đoạn DNA ngoại lai ĐC 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3.9 Điện di plasmid gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-16: DNA plasmid mang gen giống bèo L aequinoctialis DB1 3.3.3 Xác định đoạn điều khiển gen RE Để kiểm tra kích thước thực tế đoạn DNA nối vào vector, chúng tiến hành phân tích mẫu DNA plasmid pCRLaUbipin phương pháp xử lý với enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra kích thước đoạn gắn Các plasmid pCRLaUbipin số 10, 11, 31 thu băng 3,9 kb 2,1 kb tương ứng với kích thước vector pCR2.1 (3,9 kb) sản phẩm PCR – LaUbipin (hình 3.10 A) chọn để khảo sát Các dòng xử lý tiếp enzyme hạn chế Sall trình tự đoạn promoter có điểm nhận biết enzyme hạn chế Các dòng pCR2.1 LaUbipin thu băng 5,9 kb (hình 3.10B) Cũng tương tự dòng pCRLaUbip, sau xử lý với enzyme EcoRI chọn dòng pCRLaUbip số có hai băng 3,9 kb kb tương ứng với kích Footer Page 56 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 57 of 16 thước vector pCR2.1 sản phẩm PCR LaUbip Dòng pCRLaUbip kiểm tra SalI cho băng 4,9 kb (hình 3.10 C) Như vậy, kết kiểm tra vị trí enzyme cắt hạn chế dự đoán đoạn gắn đoạn chúng cần tìm 10 11 31 M Đ/C Đ/C M 10 11 31 M 5,9kb 3,9kb 4,9kb 3,9kb 2kb 1kb B A B C Hình 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid enzyme M Thang DNA chuẩn 1kb Đ/C Plasmid đối chứng A Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt EcoRI B Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt SalI C Plasmid pCRLaUbip cắt EcoRI Sall 3.2.4 Xác định phân tích trình tự đoạn promoter Chúng xác định trình tự DNA mẫu plasmid số 10, 11 pCRLaUbipin mẫu plasmid số pCRLaUbip máy xác định trình tự tự động dựa sở phương pháp Sanger Sau số liệu xử lý phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit v7.0.5, nhận đoạn promoter 5’UTR có chiều dài 964 bp giống bèo L aequinoctialis DB1 Sau chúng tiến hành so sánh trình tự với trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin loài Mỹ công bố GenBank Kết so sánh đoạn LaUbipin mẫu số 10 với trình tự GenBank trình bày hình 3.10 Từ kết cho thấy đoạn có vị trí thay đổi so với loài Mỹ thống kê bảng 3.2 Footer Page 57 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 58 of 16 La-Ubi-pin Laubi-10 R 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | AGTGTACCAATATTTTAAACCCTACATTTATCATTCTTTATTCATTATTGCCATAAGTTA La-Ubi-pin Laubi-10 R 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | ATGAATATTGAAATTCAAATACGCGCAAGATGTCAATATCGATCGAATATGAATACCAGA La-Ubi-pin Laubi-10 R 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | TATAAAATCAAAAATCAAATATCAAATTAATAAAGATATAAAATATTGAATCCAAAAGCA La-Ubi-pin Laubi-10 R 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | ATAAAGAATATCACTATTAATATCAAAATATCGATTTGAAGTTCAAAAATTGGGTCCATT La-Ubi-pin Laubi-10 R 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | AGGAGCCAAGACCGATCATGATCCGATACTGATATCAATATCTGTAGCTCAGTGGCTAGG La-Ubi-pin Laubi-10 R 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | CCCCTCAATTTGCCTGGCCGAAGGCAGTGTACAAAACCTGGCTCTCGCAAGGGCAAAGAA La-Ubi-pin Laubi-10 R 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | AGAGTCTTTCCCAAAAAAAAAAAAATCGAACCCATTTGTAGTATCCAATATTTGGATTGA La-Ubi-pin Laubi-10 R 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | CATAAGATACCAAAA-CATAAAGTACTAACCACCCAATCTTATAATTAATCAAGATTTAT .A La-Ubi-pin Laubi-10 R 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | ATCACATCCAATATCAAGATCCGATATCAATACCTAGACCGGTAAACCCTAATTTACTCT La-Ubi-pin Laubi-10 R 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | TCCCCCCTCTAAAAATTTCCAATAAATATCTCCACATATTTAACTATTAAAAAATTGATA La-Ubi-pin Laubi-10 R 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | AGAGATAGGCCCTAGCCCTAAGTCCTAACATATAACCACTCTCTATGAAAAGTCCTATTA A ABRE G-box670 La-Ubi-pin Laubi-10 R 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | AATGACGTCATTTATTTATTTATTGCCGGTTGGCTGCTCCACAGCCGCAATTTAATGGAT Footer Page 58 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 59 of 16 HSE DRE ABRE 730 La-Ubi-pin Laubi-10 R 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | GGCTGACACGGCACGAAACCGACGGGCGGTGCCGTGGGAATAATTCTAGAGTAAACCTAA La-Ubi-pin Laubi-10 R 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | CGGCGCCGTTAACTTTGACGGTGGCGAAGACGCGTGGGGATAGGTGGTTGGTCCGCGTGA La-Ubi-pin Laubi-10 R 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | CGGCGGCGGTTCAGCCCGTCGACCTTGAGCCGAGACTATAAATCGAGGCGAAGGGATGAG G La-Ubi-pin Laubi-10 R 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | CTTTGCCATTGCGTTCTTCTTCTGTTCATCTCTGAAATTCGGGCGGAATCCTTCTTCTTC - - La-Ubi-pin Laubi-10 R | TCAAG TATA Hình 3.11 Trình tự đoạn promoter loài bèo L aequinoctialis DB1 với dự đoán vùng chức promoter Bảng 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt La-Ubi-pin với La-Ubi-10F STT Vị trí (tính từ vị trí khởi đầu yếu tố điều khiển gen) 644 884 La-Ubi-pin (Mỹ) La-Ubi-10F T A C G Kết giải trình tự cho chúng thấy đoạn intron mẫu LaUbipin đọc số điểm chưa quán Cần phải nhấn mạnh vùng intron thường có nhiều đoạn trình tự A/T dài nên việc nhân PCR xác định trình tự thường gặp khó khăn cần phải lặp lại nhiều lần Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức trình tự http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html, http://www.softberry.ru/cgi- bin/programs/promoter cho thấy đoạn có vùng chức promoter (hình 3.11) Hộp TATA vị trí 876 điểm khởi đầu phiên mã dự đoán vị trí 916 Ngoài có trình tự đặc trưng cho G - box (662), ABRE (716), Footer Page 59 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 60 of 16 DRE (738), HSE (758),… Đây yếu tố điều hòa promoter gen cảm ứng với ánh sáng, abscisic acid, điều kiện nước… Trong đoạn trình tự yếu tố biểu gen đặc hiệu hai loài bèo chúng quan sát thấy trình tự DNA bảo thủ thường có mặt hầu hết đoạn promoter hộp TATA hộp CCAAT, trình tự bảo thủ có tác động trực tiếp đóng vai trò quan trọng trình biểu gen Kết thu cho thấy mẫu sử dụng nghiên cứu có trình tự đoạn nucleotide sai vài điểm so với trình tự gen dùng làm tham khảo công bố [24] Đối với trình tự nucleotit đoạn promoter 5’UTR SpUbipin16 mà chúng phân lập dài 1033 bp có vị trí nucleotide khác biệt với trình tự Mỹ công bố, vị trí C->T (599); A->G (729); C->T (741) T->C (859) Với trình tự nucleotide đoạn LaUbipin10 (964bp) có vị trí thay đổi so với loài Mỹ T->A (644) C->G (884) Trong đó, trình tự đoạn promoter 5’ UTR gen Ubiquitin ngô 982 bp (899 bp trước TSS 83 bp 5’UTR) [22], lúa 1309 bp Còn đoạn intron gen ngô dài 1010 bp đoạn intron lúa dài 1141 bp [53] Như vậy, promoter chúng phân lập có cấu trúc giống promoter gen Ubiquitin loài thực vật khác Ngoài ra, qua kết nghiên cứu thực tế chúng nhận thấy việc sử dụng enzyme Pfu DNA polymerase phản ứng PCR mang lại hiệu tốt sử dụng enzyme Dream Taq DNA polymerase phản ứng PCR Ta biết cấu trúc enzyme Pfu DNA polymerase có 12 cuộn xoắn trình tổng hợp DNA với độ xác cao enzyme Taq DNA polymerase (Stratagene) có vai trò làm tăng hiệu trình nhân PCR không gây đột biến Trên thực tế, việc tối ưu hóa phản ứng PCR cho Pfu DNA polymerase thường khó khăn Chúng tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR loài S polyrrhiza DB2 tiếp tục tiến hành tối ưu điều kiện phản ứng PCR Pfu cho loài L aequinoctialis DB1 Footer Page 60 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 61 of 16 Ubiquitin HSP nhỏ Cấu trúc gen polyubiquitin ngô, lúa có vùng promoter, 5’UTR, intron exon Đoạn intron dự đoán có chức tăng cường khả biểu gen Vì vậy, để biểu gen thực vật, người ta sử dụng đoạn promoter mà đoạn promoter intron gen Ubiquitin Nghiên cứu sử dụng vùng riêng biệt đoạn trình tự yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin lúa rubi3 biểu gen GUS cho thấy: tác động promoter 5’UTR, gen GUS biểu tất các dạng mô tế bào, đoạn intron tăng cường biểu gen số mô tế bào định, đó, ngô, intron tăng cường biểu phần lớn tất mô [22], [41], [55] Như vậy, khả sử dụng đoạn yếu tố biểu gen Ubiquitin hai loài bèo vấn đề cần nghiên cứu tiếp Footer Page 61 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 62 of 16 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết đạt được, chúng rút số kết luận sau: Đã hoàn thiện phương pháp tách chiết DNA từ loài bèo khác sử dụng kết hợp CTAB PVP, CTAB PEG SDS PVP Đã phân lập đoạn yếu tố điều khiển biểu gen mã hóa cho Ubiquitin loài bèo Spirodela polyrrhiza DB2 bao gồm promoter, 5’UTR intron promoter có độ dài 1033 bp, đoạn bao gồm promoter , 5’UTR intron có độ dài 2013 bp Đã phát thấy có vị trí nucleotide promoter khác với gen phân lập Mỹ Đã phân lập đoạn promoter 5’UTR gen mã hóa cho Ubiquitin loài bèo Lemna aequinoctialis DB1: promoter 5’UTR có độ dài 964 bp, có vị trí nucleotide khác với promoter phân lập từ loài Mỹ Đề nghị - Xác định đoạn intron đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin mẫu bèo Lemna aequinoctialis DB1 - Sử dụng đoạn yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin phân lập Spirodela polyrrhiza DB2 vào việc thiết kế vector mang gen cần thiết để chuyển vào bèo Footer Page 62 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 63 of 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt : Lê Thị Thu Hiền, Lê Trần Bình, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải (2000), “Phân tích trình tự đoạn điều khiển gen tổng hợp đường (Rsuc1-Promoter) từ giống lúa C71 ”, Tạp chí sinh học 23 : 45-50 Lê Thị Thu Hiền, Phạm Bích Ngọc, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình (2003), “Cây trồng biến đổi gen di truyền : Thực trạng triển vọng ”, Tạp chí Công nghệ sinh học : 265-285 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(1): 1-18 Trần Bích Lan, Nguyễn Lan Hoa, Nguyễn Đức Doanh, Trần Duy Quý (1998), “Kết bước đầu sử dụng Agrobacterium tumefaciens nghiên cứu chuyển gen vào lúa”, Hội nghị Toàn quốc lần thứ Công nghệ sinh học Cây lúa, Huế : 98101 Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (1997), “Chuyển tổ hợp gen GUS-BNG vào thuốc lá”, Tạp chí Khoa học Công nghệ : 23-27 Đặng Trọng Lương, R Offringa, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đồng, Trần Duy Quý, W Dolff, Pau J J Hooykaas (1999), “Thiết kế lại cấu trúc gen Bt (Bacillus thurigensis) để chuyển gen vào hai mầm”, Báo cáo Khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội : 1371-1376 Vũ Văn Tiến, (2007), “Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh chuyển gen bèo Lemna aequinoctialis”, Luận văn thạc sỹ khoa học Tài liệu tiếng Anh: Amin J., Anathan J., Voellmy R (1988), “Key features of heat shock regulatory elements”, Mol Cell Biol 8: 3761-3769 Albani D., Altossar I., Arnison P G., Fabijanski S F (1991), ”A gene showing sequence similarity to pectin esterase is spesificially expressed in developing pollen Footer Page 63 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 64 of 16 of Brassica napus Sequences in its 5’ flanking region are conserved in other pollenspecific promoter”, Plant Mol Biol 16: 501-513 10 Angeles J.G.C., Laurena A.C., Tecson-Mendoza E.M (2005) Extraction of genomic DNA from the lipid-polysaccharide, and polyphenol-rich coconut (Cocos nucifera L.) Plant Mol Biol Rep 23: 297a-297i 11 Ainley W.M., Key J.L (1990), “Development of heat shock inducible expression cassette for plants characterization of parameters for its use in transient espression assay”, Plant Mol Biol 14: 949-967 12 Back E., Dunne W., Schneiderbauer A., De Framond A., Rasogi R., Tein S.J (1991), ”Isolation of the spinach nitrite redutase gene promoter which confer nitrate inducibility on GUS gene espression in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 17: 9-18 13 Bernard R.G., Jack J.P., 2006 “Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA”, Department of Biology, University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada 14 Becker C., Shutov A.D., Nong Van Hai, Senyuk V.I., Jung R, Horstmann C., Fischer J., Nielsen N.C., Muntz K (1995) Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B an asparagine-specific endopeptidase Eur J Biochemystry 228: 456-462 15 Binet M N., Lepetit M., Weij J H., Tessier L H (1990), “Analysis of a sunflower polyubiquitin promoter by transient expression”, Plant Sci 79: 87-94 16 Buchanan C.D., Klein P.E., Mullet J.E (2004), “Phylogenetic analysis of 5’ – noncoding regions from ABA – responsive rab 16/17 gene family of sorghum, maize, and rice provides insight in to the composition, organization and function of cis – regulatory modules”, Genetics 168: 1639 – 1654 17 Bustos M M., Begum D., Kalkan F A., Battraw M J., Hall T C (1991), ”Positive and negative cis-acting DNA domain are required for spatial and temporal regulation of gene expression by a seed storage protein promoter”, EMBO 10: 14691479 Footer Page 64 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 65 of 16 18 Buzby J S., Yamada T., Tobin E M (1990), “A light-regulated DNA-binding activity interacts with a conserved region of a Lemna gibba rbcS promoter”, Plant Cell 2: 805-814 19 Callis J., RaaschJ A., Vierstra R D (1990), “Ubiquitin extension proteins of Arabidopsis thaliana – structure, localization, and expression of their promoters in transgenic tobacco”, J Biol Chem 265: 12486-12493 20 Chang W C., Chiu L (1978), “Regeneration of Lemnaceae gibba G3 through callus culture”, Z Pflanzenphisiol 89: 91-94 21 Chiera J M., Bouchard R A., Dorsey S L., Park E H., Buenrostro – Nava M T., Ling P P., Finer J J (2007), “Isolation of two highly active soybean promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system”, Plant Cell Rep 26: 1501-1509 22 Christensen A.H., Sharrock RA, Quail P.H., (1992), “Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation” Plant Mol Biol 18: 675689 23 Cornejo M J., Luth D., Blankenship K M., Anderson O D., Blechl A E (1993), “Activity of a maize uniquitin promoter in transgenic rice”, Plant Mol Biol 23(3): 567-581 24 Dickey LF, Cox KM, Peele CG (2007) Expression control elements from the lemnaceae family US Patent Application 20070180583 25 D’Halluin K., Bonne E., Bossut M., De Beukeleer M., Leemans J (1992), “Transgenic maize plants by tisue electroporation”, The Plant Cell 4: 1495-1505 26 Departer B S., Schilperoort R A (1992), “Structer and expression of a rootspecific rice gene”, Plant Mol Biol 18: 161-164 27 Eldeman M., Perl A., Flaishman M., Blumethal A (1999), ”Transgenic Lemnaceae”, Patent No WO 99/19498 28 Garbarino J E., Oosumi T., Belknap W R (1995), “Isolation of a polyubiquitin promoter and its expression in transgenic potato plamts”, Plant Physiol 109: 13711378 Footer Page 65 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 66 of 16 29 Gasdaska J R., Spencer D., Dickey L (2003), ”Advantages of therpeutic protein production in the aquatic plant Lemna”, Biology Review 67: 16-37 30 Golovchenko VV, Ovodova RG, Shashkov AS, Ovodov YS (2002) Structural studies of the pectic polysaccharide from duckweed Lemna minor L Phytochemistry 60(1):89-97 31 Hadi M.Z., McMullen M.D., Finer J.J, (1996), “Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment”, Plant Cell Rep 15: 500 – 505 32 Hernandez-Garcia CM, Martinelli AP, Bouchard RA, Finer JJ (2009), “A soybean (Glycine max) polyubiquitin promoter gives strong constitutive expression in transgenic soybean”, Plant Cell Rep 28: 837-849 33 Kehoe DM., Dgenhardt.J, Winicov I, Tobin EM., (1994), “Two 10-bp regions are critical for Phytochorome regulation of a Lemna gibba Lhcb gene promoter”, The Plant Cell 6: 1123-1134 34 Keim P, Olson TC, Shoemaker RC (1988) A rapid protocol for isolating soybean DNA Soybean Genet Newsl 15: 150-152 35 Kohli A., Grifiths S., Palacios N., Twyman R.M.,Vai P., Laurie D.A., Christou P (1999), “Molecular characterization of transforming plasmid rearrangements in transgenic rice reveals a recombination hotspot in the CaMV 35S promoter and confirms the predominance of microhomology mediated recombination”, The Plant Journal 17: 591 – 601 36 Landolt E (1986), The family of Lemnaceae - a monographic study Vol.1, Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 71 37 Landolt, E.and Kandeler, R (1987) The family of Lemnaceae - a monographic study Vol.2, Veroff Geobot Inst ETH, Stiftung Rubel, Zurich, Heft 95 38 Les D.H., Crawford D.J., Landolt E., Gabel J.D., Kimball R.T (2002), “Phylogeny and systematics of Lemnaceae, the Duckweed Family”, Systematic Botany 27(2): 221-240 39 Lewin B, (2004), Genes VIII, Oxford University Pres, Oxford – New York – Tokyo Footer Page 66 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 67 of 16 40 Li J., Jain M., VunshR., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M (2004), “Callus induction and generation in Spirodela and Lemna”, Plant Cell Report 22: 457-464 41 Lu J, Sivamani E, Li X, Qu R (2008) Activity of the 5’ regulatory regions of the rice polyubiquitin rubi3 gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and GFP reporter genes Plant Cell Rep 27: 1587-1600 42 Mardanov A V (2008), “Complete Sequence of the Duckweed ( Lemna minor ) Chloroplast Genome: Structural Organization and Phylogenetic Relationships to Other Angiosperms”, J Molec Evol 66(6):555-564 43 McElrroy D., Chamberlain D.A., Moon E., Wilson K.J (1995), “Development of gusA reporter gene constructs for cereal transformation: Availability of plant transformation vectors from the CAMBIA molecular genetics resource serevice”, Mol Breed 1: 27-37 44 Noad R.J., Turner D.S., Covey S.N (1997), “Expression of function elements inserted into the 35S promoter region of infectious cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic Acids Res 15: 1123 – 46 Okubaca PA, Tobin EM, (1991), “Isolation and characterization of three genes negatively regulated by Phytochrome action in Lemna gibba”, Plant Physiol 96: 1237-1245 46 Pineda Rodo A, Brugiere N, Vankova R, Malbeck J, Olson JM, Haines SC, Martin RC, Habben JE, Mok DWS, Mok MC (2008), “Over-expression of a zeatin O-glucosylation gene in maize leads to growth retardation and tasselseed formation” J Exper Bot 59(10): 2673-2686 47 Plesse B., Criqui M C., Durr A., Parmentier Y., Fleck J., Genschik P (2001), “Effects of the polyubiquitin gene Ubi.u4 leader intron and first ubiquitin monomer on reporter gene expression in Nicotiana tabacum”, Plant Mol Biol 45: 655-667 48 Rothwell G.W., Van M.R., Ballard H.E., Stockey R.A (2004), ”Molecular phylogenetic Relationships among Lemnaceae and Araceae using Chrotoplast trnLtrnF intergenic spacer”, Molecular phylogenetics and Evulotion 30: 378-385 Footer Page 67 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 68 of 16 49 Rollfinke I K., Silber M V., Pfizner U M (1998), “Charaterization and expression of a heptaubiquitin gene from tomato”, Gene 211: 267-276 50 Rusoff L.L., Blamkeney E W., Gulley D.D, (1980), “Duckweeds (Lemnaceae): A potential Source of Protein and Amino Acid”, J Agricult Food Chem 28: 848850 51 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (2001), "Molecular Cloning: A laboratary manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 52 Shahmuradov I.A., Gammerman A.J., Hancock J.M., Bramley P.M., Solovyev V.V (2003) “ PlantPron: a database of plant promoter sequences”, Nucleic Acids Research 31(1): 114-117 53.Sivamani E., Qu R (2006), “Expression enhancement of a rice polyubiquitin gene promoter”, Plant Mol Biol 60: 225-239 54 Soltis DE, Soltis PS, Bennett MD, Leitch IJ (2003), “Evolution of genome size in the angiosperms1”, American Journal of Botany 90:1596-1603 55.Stefaniak B., Wozng A., Budna T (2002), “Callus induction and plant regeneration in Lemna minorL”, Biologia Plantarium 45(3): 469-472 56 Stewart C.N.Jr., Via L.E.(1993) A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications BioTechniques 14: 748-751 57 Stomp A M., Rajbhardari N (2000), “Generatically engineered duckweed”, US patent No 6040498 58 Van De Meer I M., Spelt C E., Mol J N., Stuitje A R (1990), ”Promoter analysis of chalcone synthase (chsA) gene of Petunia hybrida: A 67 bp promoter region directs flower –specific expression’, Plant Mol Biol 15: 95-109 59 Walden R., Koncz C., SchellJ (1990), “The use of gene vectors on plant moleculer biology”, Methods in Molecular and Cellular Biology: 175-194 60 Wang J., Oard J H., (2003), “Rice ubiquitin promoters: deletion analysis and potential usefulness in plant transformation systems”, Plant Cell Rep 22: 129-134.; Footer Page 68 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Header Page 69 of 16 61 Weathermax S C., William S A., Tingay S., Tobin E M (1998), “The phytochrome response of the Lemna gibba NPR1 gene is mediated primarily through changes in absscisic acid levels”, Plant Physiol 116: 1299-1305 62 Weeks K.E., Chuzhanova N.A., Donnison I.S., Scott I.M (2007), “Evolutionary hierarchies of conserved blocks in 5’ noncoding sequenced of dicot rbcS genes”, BMC Evol Biol 7: 51 63 Wei H R., Wang M L., More P H., Albert H H (2003), “Comparative expression analysis of two sugarcane polyubiquitin promoters and flanking sequences in transgenic plants”, Plant Physiol 160: 1241-1251 64 Yamaguchi Shinozaki K., Mino M., Mundy J., Chua N H (1990), “Analysis of an ABA – Responsive rice gene promoter in transgenic tobacco”, Plant Mol Biol 15: 905-912 65 Yamamoto Y.T.; Rajbhandari N.; Lin X.; Bergmann B.A.; Nishimura Y.; Stomp A.M (2001) "Genetic transformation of duckweed Lemna gibba and Lemna minor." In Vitro Cellular and Development Biology - Plant 37(3):349-353 66 Yin Y., Chen L., Beachy R (1997), “Promoter elements required for phloemspecific gene espression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal 12: 1179-1188 67 Zuccarello GC, Critchley AT, Smith J, Sieber V, Lhonneur GB, West JA (2006) Systematics and genetic variation in commercial Kappaphycus and Eucheuma (Solieriaceae, Rhodophyta) J Appl Phycol, 2006, DOI:101007 10811-006-9066-2 68 http://www.lemnagene.com 69 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf Footer Page 69 Số of hóa16 Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.Lrc-tnu.edu.vn ... PHẠM - TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học... mang gen đem lại lợi ích cho người để chuyển vào bèo tấm, chúng xin đăng ký thực đề tài: Nghiên cứu phân lập yếu tố điều khiển biểu gen Ubiquitin từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela. .. khiển biểu gen đặc hiệu từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis DB1 Spirodela polyrrhiza DB2 PCR; Tách dòng xác định trình tự đoạn yếu tố điều khiển biểu gen đặc hiệu từ hai loài bèo Lemna aequinoctialis