ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI KHÁNH LY Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2012-2016 Thái Nguyên, năm 2016 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BÙI KHÁNH LY Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VTRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Lớp : 44-CNSH Khóa học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: PGS.TS Ngô Xuân Bình Bộ khoa học công nghệ 2.ThS Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH-CNTP - Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập em tiến hành thực đề tài “Nghiên khả nhân giống Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) phương pháp in vitro” Kết thúc thời gian thực tập Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh họcCông nghệ Thực phẩm, đến em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Để đạt đƣợc kết nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm thầy cô giáo Khoa tạo điều kiện cho em suốt thời gian thực tập Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Xuân Bình, ThS Nguyễn Thị Tình ThS Ma Thị Hoàn tận tình bảo, giúp đỡ hƣớng dẫn em thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình tạo điều kiện vật chất tốt chỗ dựa tinh thần cho em trình thực tập; cảm ơn bạn bè giúp đỡ em thời gian vừa qua Do thời gian thực đề tài có hạn nên khóa luận tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp chân thành từ thầy cô bạn để đề tài đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2016 Sinh viên Bùi Khánh Ly ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Phân loại khoa học Chi Bình vôi (Stephania spp) [2] Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ hóa chất 25 Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ, thời gian chất khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro sau ngày .27 Bảng 3.3: Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi Bình Vôi sau 20 ngày theo dõi .28 Bảng 3.4: Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA kết hợp với GA3 đến khả tái sinh chồi Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy 28 Bảng 3.5: Nghiên cứu ảnh hƣởng tổ hợp BA đến khả nhân nhanh chồi Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy 29 Bảng 3.6: Nghiên cứu ảnh hƣởng Kinetine đến khả nhân nhanh chồi Bình Vôi sau 30 ngày nuôi cấy 29 Bảng 3.7: Nghiên cứu ảnh hƣởng NAA than hoạt tính (0,5 g/l) đến khả rễ Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy 30 Bảng 3.8: Nghiên cứu ảnh hƣởng IBA than hoạt tính (0,5 g/l) đến khả rễ Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy 30 Bảng 4.1: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ thời gian sử dụng chất khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro (sau ngày) 32 Bảng 4.2: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy 35 Bảng 4.3: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA kết hợp với Bảng 4.4: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Bình vôi sau 30 ngày nuôi cấy 39 Bảng 4.5: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ Kinetine đến khả nhân nhanh chồi Bình vôi sau 30 ngày muôi cấy 41 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Cây Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) .5 Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng số chất kích thích sinh trƣởng đến khả nhân giống invitro Bình Vôi 26 Biểu đồ 4.1: Biểu diễn ảnh hƣởng nồng độ, thời gian khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro (sau ngày) 34 Biểu đồ 2: Biểu diễn ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi Bình Vôi sau 20 ngày nuôi cấy 36 Hình 4.1: Chồi Bình Vôi MT bổ sung nồng độ BA kết hợp với nồng độ GA3 khác sau 20 ngày nuôi cấy 38 Hình 4.2: Chồi Bình Vôi MT bổ sung tổ hợp BA với nồng độ khác đến khả nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy 40 Hình 4.3: Chồi Bình Vôi MT MS bổ sung nồng độ Kinetine khác đến khả nhân nhanh sau 30 ngày nuôi cấy 42 Hình 4.4: Rễ Bình Vôi MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) NAA nồng độ khác sau 40 ngày nuôi cấy 44 Hình 4.5: Rễ Bình Vôi MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) IBA nồng độ khác sau 40 ngày nuôi cấy 46 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT BA : 6-Benzylaminopurine GA3 : Gibberellic Acid IBA : Indole butyric acid MS : Murashige & Skoog (1962) CS : Cộng CT : Công thức CV : Coeficient of Variation Đ/c : Đối chứng LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog (1962) MT : Môi trƣờng NAA : α-Naphthalene acetic acid WHO : World Health Organization v MỤC LỤC Trang Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài .2 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học: 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn: Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung chi Bình vôi 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại Chi .4 2.1.3 Đặc điểm hình thái phân bố 2.2 Giá trị Bình Vôi .6 2.2.1 Giá trị kinh tế 2.2.2 Giá trị dƣợc liệu 2.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc giới 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam .10 2.4 Khái niệm sở khoa học nuôi cấy mô-tế bào thực vật 11 2.4.1 Khái niệm 11 2.4.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô-tế bào thực vật 12 2.5 Các giai đoạn nhân giống vô tính in vitro 12 2.5.1 Giai đoạn chuẩn bị 12 2.5.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy .13 2.5.3 Giai đoạn nhân nhanh chồi 13 2.5.4 Tạo hoàn chỉnh 14 vi 2.5.5 Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên .14 2.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 15 2.6.1 Vật liệu nuôi cấy .15 2.6.2 Điều kiện nuôi cấy 15 2.6.3 Môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật 16 2.7 Tình hình nhân giống sử dụng củ Bình Vôi 22 2.7.1 Nhân giống phƣơng pháp hữu tính 23 2.7.2 Phƣơng pháp nhân giống vô tính 23 2.7.3 Phƣơng pháp nhân giống in vitro .23 2.7.4 Phƣơng pháp chế biến sử dụng .24 Phần ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 25 3.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 25 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 25 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 25 3.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất .25 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy invitro .26 3.5.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 3.5.3 Nội dung nghiên cứu .27 3.5.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 30 3.6 Xử lí số liệu 31 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ thời gian sử dụng chất khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vitro 32 4.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng Cytokinine Gibbererllin đến khả tái sinh chồi Bình Vôi 34 vii 4.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ 34 4.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA kết hợp với GA đến khả tái sinh chồi Bình Vôi từ đoạn thân mang chồi ngủ 36 4.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng số cytokinine đến khả nhân nhanh chồi Bình Vôi 39 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Bình Vôi .39 4.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ Kinetine đến khả nhân nhanh chồi Bình Vôi 41 4.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng số Auxin đến khả rễ Bình Vôi 43 4.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ NAA đến khả rễ Bình Vôi .43 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ IBA đến khả rễ Bình Vôi .45 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Kiến nghị 47 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề PGS, TS Lê Xuân Cảnh (Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật) cho biết: năm 1992, trung tâm giám sát bảo tồn giới xếp Việt Nam 16 quốc gia có đa dạng sinh học cao giới Theo số liệu báo cáo quốc gia đa dạng sinh học (năm 2011) cho thấy, Việt Nam ghi nhận đƣợc khoảng 49 nghìn loài sinh vật, bao gồm: khoảng 7.500 loài/chủng vi sinh vật; 20 nghìn loài thực vật cạn dƣới nƣớc; 10.500 loài động vật cạn; 11 nghìn sinh vật biển [44] Nguồn dƣợc liệu Việt Nam phong phú, đa dạng đƣợc sử dụng rộng rãi cộng đồng để chữa trị nhiều bệnh khác Theo kết điều tra nguồn tài nguyên dƣợc liệu Việt Nam giai đoạn 2001 – 2005 Viện dƣợc liệu (2006) cho biết Việt Nam có khoảng 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp nấm lớn đƣợc dùng làm thuốc [45] Một số thuốc đƣợc sử dụng nhiều Bình Vôi Trong củ Bình Vôi có chứa alkaloid bao gồm L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Ngoài có tinh bột, đƣờng khử oxygen, acid malic, men oxydase [22] Trong quan trọng Ltetrahydropalmatin (rotundin) roemerin cepharanthin Rotundin có tác dụng giảm đau, an thần, gây ngủ hiệu quả, điều hòa hô hấp điều hòa tốt tim mạch [12] Hàm lƣợng hoạt chất có củ Bình Vôi tƣơi khoảng 0,12 – 0,3% Roemerin có tác dụng gây tê niêm mạc, giãn mạch, hạ huyết áp Cepharanthin đƣợc coi chất có tác dụng kích thích miễn dịch làm giảm nhẹ cách hữu hiệu tác dụng phụ thuốc chống ung thƣ Ngoài ra, Bun Sok-Siya cs (2009) chiết xuất cepharanthin có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng ung thƣ gan [40] Mặt khác, ức chế phát triển trực khuẩn lao Ngoài công dụng điều trị bệnh, củ Bình Vôi dùng làm vật trang trí đẹp đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng [5] 45 4.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả rễ Bình Vôi Bảng 4.7: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ IBA đến khả rễ Bình Vôi sau 40 ngày nuôi cấy Nồng độ Số mẫu Số mẫu IBA nuôi cấy rễ (mg/l) (mẫu) (mẫu) CT1(Đ/c) 0,0 30 0,0 CT 0,5 30 13,33 Rễ tốt CT 1,0 30 30,0 Rễ tốt CT 1,5 30 12 40,0 Rễ trung bình CT 2,0 30 16 53,33 Rễ trung bình Công thức Tỷ lệ mẫu rễ(%) CV% 5,6 LSD.05 0,19 Chất lƣợng rễ Qua bảng 4.7 ta thấy: tiêu tỷ lệ mẫu rễ với LSD.05 = 0,19 CV = 5,6%, CT có sai khác có ý nghĩa mức độ tin cậy 95% CT sử dụng IBA nồng độ 2mg/l cho tỷ lệ mẫu rễ cao đạt 53,33% Tiếp CT 4, 3, sử dụng IBA nồng độ tƣơng ứng lần lƣợt 1,5mg/l, 1mg/l, 0,5mg/l cho tỷ lệ rễ đạt lần lƣợt 40%, 30% 13,33% Thấp CT (ĐC) không bổ sung IBA cho tỷ lệ rễ 0% Ở tiêu chất lƣợng rễ cho thấy: chất lƣợng rễ CT đạt chất lƣợng tốt, nhiên CT mặc tỷ lệ rễ cao nhƣng chất lƣợng rễ lại trung bình Vì vậy, ta cần quan tâm đến tỷ lên rễ nên chọn CT 5, nhƣng ta cần quan tâm đến chất lƣợng rễ nên chon CT3 Kết lý giải nhƣ sau: IBA chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin có tác dụng việc hình thành kéo dài rễ điều khiển hình rễ [3] 46 Từ thí nghiệm ta rút kết luận: sử dụng NAA cho tỷ lệ rễ cao (66,67%) so với sử dụng IBA (53,33%) Mặt khác, sử dụng NAA cho chất lƣợng rễ tốt sử dụng IBA a, 0,0 mg/l IBA không thu đƣợc rễ b,5 mg/l IBA tỷ lệ mẫu rễ đạt 13,33% d, 1,5 mg/l IBA tỷ lệ rễ 40% c, 1,0 mg/l IBA tỷ lệ rễ 30% e, 2,0 mg/l IBA tỷ lệ rễ 53,33% Hình 4.5: Rễ Bình Vôi MT MS bổ sung than hoạt tính (0,5 g/l) IBA nồng độ khác sau 40 ngày nuôi cấy 47 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: - Phƣơng pháp khử trùng tốt đoạn thân non, bánh tẻ Bình Vôi (Stephania rotunada Lour) là: HgCl2 0,1% thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt cao 76,67% - Môi trƣờng tối ƣu cho phát sinh chồi mẫu Bình Vôi là: Môi trƣờng MS + 1,0 mg/l BA + 0,5 mg/l GA3 với tỷ lệ tái sinh chồi đạt 193,33% - Môi trƣờng tốt cho nhân nhanh chồi Bình Vôi là: Môi trƣờng MS + 2,0 mg/l BA đạt 3,6 lần - Môi trƣờng thích hợp cho giai đoạn rễ có chất lƣợng tốt: Môi trƣờng MS + 1,5mg/l NAA + 0,5 g/l than hoạt tính đạt 66,67% 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu ảnh hƣởng số chất kích thích sinh trƣởng khác (TDZ, nƣớc dừa, dịch chiết hữu (dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây) tới khả nhân nhanh chồi Bình Vôi (Stephania rotunada Lour) - Nghiên cứu ảnh hƣởng IAA tới khả rễ Bình Vôi (Stephania rotunada Lour) - Nghiên cứu ảnh hƣởng số giá thể đến khả sinh trƣởng phát triển Bình Vôi (Stephania rotunada Lour) sau giai đoạn in vitro TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt I Bộ Giáo dục Đào tạo, Bộ Y tế, Viện Dƣợc liệu (2005), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược - Giáo trình Sau đại học, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín việt nam, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thị Thúy Hà (2003), Giáo trình công nghệ sinh học, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Bùi Thị Bằng (2006), Các phương pháp hóa lí ứng dụng phân tích kiểm nghiệm dược liệu, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn thị Mỹ Duyên (2014), “Sự ảnh hƣởng auxin cytokinin đến khả tạo nhân chồi Bình vôi (Stephania rotunda Lour.)”, Tạp chí khoa học, Quyển 2(1), 48 – 54 Trịnh Đình Đạt (2007), Công nghệ Sinh học - T4, Nxb Giáo dục Trầ n Hùng Ngô Vân Thu, “Khảo sát mang tên Bình Vôi ”, Tạp chí Dược học, Tâ ̣p 26, số 1, 1986, 6-8 Trầ n Hùng và Ngô Vân Thu , “Bƣớc đầ u nghiên cƣ́u Bình Vôi Biể n”, Thông tin Dược học, Số 5, 1988, 65 - 67 Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam 10 Phan Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1997), Bài giảng dược liệu, tập 2, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 11 Đỗ Tất Lợi (1991), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ Thuật 12 Đỗ Tất Lợi (2009), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Hà Nội, Nxb Y học 13 Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011), “Nghiên cứu khả tạo rễ bất đinh sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro”, tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 27: 30 - 36 14 Trần Thị Lệ, Trƣơng Thị Bích Phƣợng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 15 Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Văn Vinh (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro khảo sát hợp chất Alkaloit Rotudine từ Bình vôi (Stephania rotunda Lour)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 49, số 4, năm 2011, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 16 Ngô Đại Quang (1999), Tạp chí công nghiệp hóa chất, Nxb Vinachem 17 Ngô Đại Quang (1999), “ Sản xuất thuốc giảm đau từ củ Bình vôi”, Viện Hóa học công nghiệp Hà Nội 18 Sách đỏ Việt Nam (2007), Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ Hà Nội 19 Nguyễn Kim Thanh, Nguyễn Thuận Châu (2005), Giáo trình sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội 20 Trần Trung Thành, Lê Thị Thu Hiền (2013), “ Xây dựng phát sinh chủng loại số loài thuộc chi Bình vôi (Stephania) vƣờn Quốc gia Cúc Phƣơng dựa trình tự nucleotide vùng ITS, trnL matK”, Tạp chí Công nghệ sinh học, T 11, S.3 (2013) 21 Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở Công nghệ sinh học-tập 3, Nxb Giáo dục 22 Nguyễn Viết Thân - Kiểm nghiệm dƣợc liệu phƣơng pháp hiển vi- NXB khoa học kỹ thuật- 2003 Tr.57-59 23 Đỗ Năng Vịnh (2002), Công nghệ sinh học trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 24 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ Sinh học - T2, Nxb Giáo dục 25 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (1998), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục 26 Viện dƣợc liệu, Tài nguyên thuốc Việt Nam (1993), Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 27 Viện dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Nxb Khoa học kỹ thuật 28 Dược điển Việt Nam, tập III Tr 321-322 29 Thủ tƣớng phủ Về việc phê duyệt "Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hoá dược đến năm 2020", số 61/2007/QĐ-TTg Tài liệu tiếng anh II 30 Behera K K., Pani D and Shahoo S (2010), “Effect of plant growth regulator on in vitro multiplucation of turmeric (Curcumar longa L.cv.Ranga)”, International Journal of Biological Technology, 1(1): 16 - 23 31 Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada Masao Tomita (1984), A major alkaloid of the leaves and stems of Stephania Rotunda, Kyoto pharmaceutical University, Misasagy, yamasbina- ku, Kyoto 607, Japan 32 Nayak S., Parida R and Mohanty S (2011), “Evaluation of genetic fidelity of in vitro propagated greater Galangal (Alpinia galanga L.) using DNA based markers”, International Journal of Plant, Animal and Environmental Sciences, 1(3): 124 - 133 33 Duong Tan Nhut, Nguyen Phuc Huy, Vu Quoc Luan, Nguyen Van Binh, Nguyen Ba Nam, Le Nu Minh Thuy, Dang Thi Ngoc Ha, Hoang Xuan Chien, Trinh Thi Huong, Hoang Van Cuong, Le Kim Cuong and Vu Thi Hien (2011), “Shoot regeneration and micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv from ex vitro leaf-derived callus”, African Journal of Biotechnology, 10(84):19499 - 19504 34 Sen A., Goyal A.K., Ganguly K and Mishra T (2010), “In vitro multiplication of Curcuma Longa Linn.- an important medicinal zingiber”, Journal of Plant Science, 4: 21 - 24 35 Shahinozzaman M., Faruq M O., Azad M A K and Amin M N (2013), “Studies on in vitro propagation of an important medicinal plant - Curcuma zedoaria Roscoe using rhizome explants”, Persian Gulf Crop Protection Available online, 2( 4): 1- 36 Sharma G.J., Sinha S.K and Chirangini P (2005), “In vitro propagation and microrhizome induction in Kaempferia galanga Linn and Kaempferia rotunda Linn.”, Indian Journal of Biotechnology, 4: 404 - 408 37 Fakhrutdinov Sf (1992), On the pharmacology of the alkaloid Roemerin and it derivatives, Med Zh Uzb 38 Jala A and Patchpoonporn W (2012), “Effect of BA, NAA and 2,4-D on micropropagation of Jiaogulan (Gynostemma pentaphyllum makino)”, International Transaction Journal of Enginneering, Management, Applied Sciences & Technologies, 3(4): 363 - 370 III Tài liệu internet 39 WWW.duoclieu.org 40 http://thaoduocminhtam.com/cay-thuoc-vi-thuoc/binh-voi-stephania-sinicadiels.html 41 http://www.duoclieu.org/2012/03/binh-voi-stephania-spp-ho-tiet-de.html 42 www.cayduoclieu.com 43 http://123doc.org/doc-search-title/1341795-nghien-cuu-dac-diem-sinh-vat-hocva-nhan-giong-loai-cay-binh-voi-stehania-rotunda-lour-bang-phuong-phap-giamhom.htm 44 http://www.nhandan.com.vn/khoahoc/item/28823402-bao-ton-da-dang-sinhhoc-o-viet-nam.html 45 http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc 46 http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/nhan-giong-cay-binh-voi-tim-stephaniarotunda-lour-bang-ky-thuat-nuoi-cay-doan-than-12662.html PHỤ LỤC 1: MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY Table 1: Preparation of modified Murashige and Skoog’s (MS medium) Amount to Bottle Component Stock take Solution (g/l preparation (ml) I II III IV V Final concentratic (mg/l) NH4NO3 82,5 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,23 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 KI 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 20 1.650,0 1.900,0 370,0 10 10 10 22,3 10,6 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 20.0000,0 Agar 5.000,0 pH 5,6-5,8 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm 1: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ, thời gian HgCl2 đến khả tạo vật liệu vô trùng nuôi cấy in vitro BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMS FILE KT 21/ 5/** 15:14 PAGE VARIATE V003 TLMS LN SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 14096.7 1566.30 78.31 0.000 * RESIDUAL 20 400.000 20.0000 * TOTAL (CORRECTED) 29 14496.7 499.885 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KT 21/ 5/** 15:14 PAGE MEANS FOR EFFECT CT CT 10 NOS 3 3 3 3 3 DF TLMS 0.000000 33.3333 76.6667 63.3333 43.3333 70.0000 63.3333 60.0000 70.0000 56.6667 SE(N= 3) 2.58199 5%LSD 20DF 7.61678 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KT 21/ 5/** 15:14 PAGE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLMS GRAND MEAN (N= 30) NO OBS 30 53.667 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 22.358 4.4721 8.3 0.0000 | | | | Thí nghiệm 2: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi Bình Vôi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSTS FILE LY9 21/ 5/** 20:10 PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhan tai sinh choi cay Binh Voi VARIATE V003 HSTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 582667 145667 31.21 0.000 * RESIDUAL 10 466667E-01 466667E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 629333 449524E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LY9 21/ 5/** 20:10 PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhan tai sinh choi cay Binh Voi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 HSTS 0.866667 1.23333 1.43333 1.33333 1.10000 SE(N= 3) 0.394405E-01 5%LSD 10DF 0.184279 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LY9 21/ 5/** 20:10 PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhan tai sinh choi cay Binh Voi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSTS GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 1.1933 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.21202 0.68313E-01 3.4 0.0000 | | | | Thí nghiệm 3: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA kết hợp với GA3 đến khả tái sinh chồi Bình Vôi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSTS FILE LY8 21/ 5/** 19:37 PAGE Anh huong cua nong BA ket hop voi GA3 den kha nang tai sinh choi cay Binh Voi VARIATE V003 HSTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 656000 164000 49.20 0.000 * RESIDUAL 10 333334E-01 333334E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 689333 492381E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LY8 21/ 5/** 19:37 PAGE anh huong cua nong BA ket hop voi GA3 den kha nang tai sinh choi cua cay Binh MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 HSTS 1.33333 1.56667 1.93333 1.73333 1.46667 SE(N= 3) 0.333334E-01 5%LSD 10DF 0.105035 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LY8 21/ 5/** 19:37 PAGE Anh huong cua nong BA ket hop voi GA3 den kha nang tai sinh choi cay Binh Voi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSTS GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 1.6067 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.22190 0.57735E-01 3.6 0.0000 | | | | Thí nghiệm 4: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ BA đến khả nhân nhanh chồi Bình vôi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE LY2 14/ 5/** 23:49 PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhan nhanh cay bình voi VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 6.57067 1.64267 88.00 0.000 * RESIDUAL 10 186666 186666E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 6.75733 482667 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LY2 14/ 5/** 23:49 PAGE Anh huong cua nong BA den kha nang nhan nhanh cay bình voi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 HSNC 1.60000 2.20000 3.60000 2.76667 2.40000 SE(N= 3) 0.788810E-01 5%LSD 10DF 0.248557 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LY2 14/ 5/** 23:49 PAGE anh huong cua nong BA den kha nang nhan nhanh cay bình voi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSNC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.5133 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.69474 0.13663 3.4 0.0000 | | | | Thí nghiệm 5: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ Kinetine đến khả nhân nhanh chồi Bình vôi BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE LY3 15/ 5/** 0:28 PAGE Anh huong cua nong Kinetine den kha nang nhan nhanh choi cua cay binh voi VARIATE V003 HSNC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 3.02267 755667 59.66 0.000 * RESIDUAL 10 126667 126667E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 3.14933 224952 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LY3 15/ 5/** 0:28 PAGE Anh huong cua nong Kinetine den kha nang nhan nhanh choi cua cay binh voi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 HSNC 1.60000 2.10000 2.53333 2.90000 2.00000 SE(N= 3) 0.649787E-01 5%LSD 10DF 0.164750 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LY3 15/ 5/** 0:28 PAGE Anh huong cua nong Kinetine den kha nang nhan nhanh choi cua cay binh voi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSNC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.2267 STANDARD DEVIATION C OF V |CT SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.47429 0.11255 3.1 0.0000 | | | | Thí nghiệm 6: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ NAA đến khả rễ Bình vôi BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLRR FILE LY4 15/ 5/** 10: PAGE Anh huong cua nong NAA den kha nang re cua cay binh voi VARIATE V003 TLRR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 710667 177667 66.62 0.000 * RESIDUAL 10 266667E-01 266667E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 737333 526667E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LY4 15/ 5/** 10: PAGE Anh huong cua nong NAA den kha nang re cua cay binh voi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TLRR 0.333333E-01 0.266667 0.500000 0.666667 0.466667 SE(N= 3) 0.298143E-01 5%LSD 10DF 0.219458 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LY4 15/ 5/** 10: PAGE Anh huong cua nong NAA den kha nang re cua cay binh voi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLRR GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 0.38667 STANDARD DEVIATION C OF V SD/MEAN BASED ON BASED ON % TOTAL SS RESID SS 0.22949 0.51640E-01 6.4 |CT | | | 0.0000 | | | | Thí nghiệm 7: Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ IBA đến khả rễ Bình vôi sau 40 ngày nuôi cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLRR FILE LY5 15/ 5/** 10:32 PAGE Anh huong cua nong IBA den kha nang re cua cay binh voi VARIATE V003 TLRR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT 536000 134000 100.50 0.000 * RESIDUAL 10 133333E-01 133333E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 549333 392381E-01 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LY5 15/ 5/** 10:32 PAGE Anh huong cua nong IBA den kha nang re cua cay binh voi MEANS FOR EFFECT CT CT NOS 3 3 TLRR 0.000000 0.133333 0.300000 0.400000 0.533333 SE(N= 3) 0.210818E-01 5%LSD 10DF 0.194296 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LY5 15/ 5/** 10:32 PAGE Anh huong cua nong IBA den kha nang re cua cay binh voi F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLRR GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 0.27333 STANDARD DEVIATION C OF V SD/MEAN BASED ON BASED ON % TOTAL SS RESID SS 0.19809 0.36515E-01 5.6 |CT | | | 0.0000 | | | | ... khả nhân nhanh chồi Bình Vôi .39 4.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ Kinetine đến khả nhân nhanh chồi Bình Vôi 41 4.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng số Auxin đến khả rễ Bình Vôi. .. Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY BÌNH VÔI (Stephania rotunda Lour) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VTRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa... số nhân lớn thời gian ngắn Nhận thức đƣợc việc bảo tồn phát triển loài thuốc quý tiềm năng, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu khả nhân giống Bình Vôi (Stephania rotunda Lour) phương pháp