TẤC GIẢ: Bùi Hoàng Bảo Ngọc MỤC LỤC MUC LUC i DANH MUC CẢC BẢNG ii DANH MUC CÁC HÌNH VÀ ĐỊ THI iii PHẤN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Human papillomavirus ngụy eâv ung thư cổ từ cung 1.2 Cấu trúc vả chức protein E7 1.3 Các nghiên cứu ELISA phát hiên protein E6 E7 HP V PHẦN 2: MỤC TIÊU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Muc tiêu nghiên cứu 2.2 Nôi dung thưc hiên 2.3 Phương pháp tiến hành 2.3.1 Phương pháp chuyển gene vảo té bào đông vât Lipofectamine 2000 2.3.2 Phương pháp lai miễn dỉch huỳnh quang (immunofluorescence! 2.3.3 Phương pháp ELISA 2.3.4 Phương pháp xử lý bênh phẩm UTCTC PHẰN 3: KẾT QUẢ 3.1 KIỂM TRA TÍNH ĐÀC HIẼU CỦA KHẢNG THỂ ĐON DÒNG VÀ ĐA DÒNG BÂNG PHƯƠNG PHÁP LAI MIÊN DICH HUỲNH QUANG (IMMUNOFLUORESCENCE) TRÊN DÒNG TỂ BÂO CHO-K1 CHUYỂN GENE E7 HPV 18 VẢ DÒNG TẾ BẢO UNG THƯ CỒ TỬ CUNG HELA 10 3.3.1 Lai với kháng thể đơn dòng 11 3.3.2 i Lai với kháng thể đa dòng 15 3.2 XÂY DƯNG QUY TRÌNH ELISA PHÁT HEN PROTEIN E7 HPV 18 TÁI TỒ HOP TỬ HAI KHẢNG THỂ ĐON DÒNG VẢ ĐA DÒNG 22 3.2.1 Khảo sát nồng kháng thể đa dịng phủ giếng 23 3.2.2 Khảo sát nồng đô ỊcháĩìP thể đơn dịng vả kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme .25 3.2.2.1 Kháng thể đơn dòng .25 3.2.2.2 Kháng thể thứ cấp đánh dấu Alkaline phosphatase (API .27 3.2.3 Khảo sát tác nhân block giếng .29 3.3 ÁP DƯNG QUY TRÌNH ELISA TRÊN BÊNH PHẲM 30 3.4 XÁC ĐINH ĐỔ NHAY CỦA QUY TRÌNH ELISA 33 PHÀN 4: KÉT LUẬN - Ỷ NGHĨA KHOA HỌC KẾT LUÂN! ! 35 Ỷ NGHĨA KHOA HOC 35 TẰI LTẼIT THAM KHẢO 36 PHU LUC 38 ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Két quà giá tri OD khảo sát nồng kháng thể đa dịng phủ giếng ■■ 23 Bảng 3.2: Kêt quà giá tri OD khảo sát nồng kháng thể đan dịng 25 Bảng 3.3: Kẻt giá tri OD khảo sát nồng đô kháng thể thứ cấp đánh dấu AP 27 Bảng 3.4: Kẻt quà giá tri OD khảo sát tác nhân block 29 Bảng 3.5: Kầt quà ELISA ưên bênh phẳm UTCTC 30 Bảng 3.6: Kầt đinh tvpe hênh phẩm HPV 32 Bảng 3.7 : Ket quà dựng đường chuẩn xác định độ nhạy quy trình ELISA 33 iii DANH MỤC CÀC HĨNH VẢ ĐO THỊ Hình 1.1: cấu trúc protein E7 Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp checkerboard Hình 3.1: Kẻt lai miễn dich huỳnh quang tế bảo CHO-K1 mang vector pEGFP-F.7 vái khánp thể đơn dòng quan sát kính hiển vi huỳnh quang (100X1 12 Hình 3.2: Kết quà lai miễn dich huỳnh quang ưên té bảo CHO-K1 mang vector pEGFP-C2 với kháng thể đon dòng quan sát kinh hiển vi huỳnh quang (100X) 13 Hình 3.3: Ket lai miễn dich huvnh quang tế bảo HeLa vói kháng thể đơn dịng quan sát dưỏi kính hiển vỉ huỳnh quang với bưóc sóng kích thích 541 nm (100X1 14 Hình 3.4: Ket lai miễn dich huvnh quang tế bảo Heĩ.a lchơnp có kháng thể đơn dịng ('chứng âml quan sát kính hiển vi huỳnh quang vái bước sóng kích thlch 541 nm (100X1 14 Hình 3.5: Kẻt lại miễn dich huỳnh quang tế bảo CHO-K1 mang vector PEGEP-E7 với kháng thể đa dịng quan sát dưói kính hiển vi huỳnh quang (100X1 ■■ 17 Hình 3.6: Kêt quà lai miễn dich huỳnh quang tế bảo CHO-K1 mang vector PEGEP-C2 vói kháng thể đa dịng quan sát kính hiền vi huvnh quang (100X1 18 Hình 3.7: Ket lai miễn dỉch huỳnh nuang tế bào HeLa vói kháng thể đa dịng quan sát kính hiển vi huỳnh quang (1 ũ0X1 20 Hình 3.8: Ket lai miễn dich huvnh quang tế bảo Heĩ.a khônp có kháng thể đa dịng quan sát kính hiển vi huỳnh quang (100X1 .21 Hình 3.9: Đồ thi khảo sát nồng kháng thể đa dòng phủ giếng 24 Hình 3.10: Đồ thi khảo sát nồng kháng thể đơn dòng 26 iv Hình 3.11: Đồ thi khảo sát nồng đô kháng thể thứ cấp 28 Hình 3.12: Đường chuẩn xác đinh Tìhav quy trình ELIS A 34 V PHẦN ĐẶT VÁN ĐÈ ĐẶT VẤN ĐỀ Khoảng 15% ca chết ung thư tồn giới có liên quan đến loại virus khối u người Một toong virus gây ung thư người điển hình nghiên cứu nhiều human papillomavirus (HPV) - virus gây ung thư cổ tử cung, bệnh nguy hiểm hàng đầu phụ nữ Neu phút có người giới chết ung thư phổi phút có phụ nữ chết vi ung thư cổ tử cung Ở Mỹ, năm 2009 ước tính có khoảng 12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung Với tỉ lệ 26 ca 100 ngàn phụ nữ, ung thư cổ tử cung trở thành nguyên nhân ung thư gây tù vong hàng đầu cho phụ nữ Việt Nam nước phát triển Khuyến cáo ung thư cổ tủ cung năm 2009 xác định phịng ngừa chìa khóa then chốt chiến chống bệnh Do đó, phương pháp tầm sốt hiệu bệnh giúp ngăn ngừa giảm ti lệ tử vong gây Khoảng 95% trường họp ung thư cổ tử cung có liên quan đến HPV Nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ mật thiết việc nhiễm lâu dài số chùng “có nguy cao”, đặc biệt HPV type 16 HPV type 18, với khả phát triển bệnh ung thư cổ tù cung Do đó, dựa vào mối quan hệ này, ta phát triển phương pháp chẩn đoán hiệu để phát sớm diện HPV thể, từ đưa phương pháp điều trị hiệu Vì vậy, với nghiên cứu mong muốn phát triển cơng cụ chẩn đốn sớm diện HPV type có nguy cao toong thể thông qua diện toong hai protein có liên quan đến khả gây ung thư HPV protein E7 Dựa vào điều kiện phịng thí nghiệm chúng tơi tạo kháng thể đơn dòng đa dòng kháng protein E7 HPV 18, đề tài tiếp nối cách sử dụng hai kháng thể để xây dựng quy trình sandwich ELISA nhằm phát protein E7 HPV 18 bệnh phẩm ung thư cổ tử cung (UTCTC) 1.1 Human papillomavirus nguy gây ung thư cổ tử cung Một nguyên nhân chủ yếu dẫn đến UTCTC nhiễm lâu dài loại virus phổ biến dễ lây nhiễm human papillomavirus (HPV) [1] Tuy nhiên, chi vài type HPV có khả gây nên ung thư Đó type HPV có nguy cao gồm type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59; lây truyền qua đường tiếp xúc tình dục, có khả gắn chèn DNA vào gene tế bào chủ, tù đố ảnh hường đến chế kiểm soát phân bào tế chủ Nêu nhiễm lâu dài type HPV thuộc nhóm có nguy mắc UTCTC cao Nhóm thường phát trường hợp tổn thương biểu mô mức độ cao ung thư xâm lấn HPV 16 HPV 18 chịu trách nhiệm cho 70% ca UTCTC toàn giới [5, 4, 3, 2], HPV dạng virus cổ, khơng có màng bao, đường kính khoảng 55 nm, có DNA mạch đơi dạng vịng, kích thước khoảng 8.000 cặp hase vỏ capsid hình khối đa điện, gồm 72 capsomer bao quanh gene Lớp vỏ capsid gồm protein: protein capsid (Ll) protein capsid phụ (L2) Khơng giống virus có màng bao xâm nhiễm vào thể qua vùng da lành, HPV phải xâm nhiễm qua vết thương da [] Bộ gene HPV chia thành phần: vùng gene sớm, vùng gene muộn vùng điều hịa dài Vùng gene sớm (early gene); nằm phía vùng điều hịa dài; có chiều dài khoảng 4.500 cặp base; chúa gene cần thiết cho trình mã gene virus, q trình điều hịa nhân tố phiên mã hoạt động biến đổi tế bào gây ung thư, đồng thời có vai trị toong tăng sinh khơng kiểm sốt tế bào Gồm ORF mã hóa cho protein sớm El, E2, E4, E5, E6, E7 [5, 6, 1, 7] Nhiều nghiên cứu cho thấy diện type HPV nguy cao gần 100% trường hợp UTCTC [8] Trong đó, HPV 16 HPV 18 hai type phổ biến nhất, chiếm hai phần ba trường hợp ung thư biểu mô tế hào vảy ung thư tế hào tuyến Tám type HPV thường gặp toong UTCTC 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58 35; chịu trách nhiệm cho khoảng 90% trường hợp ung thư toàn giới [2], Cơ chế gây ung thư HPV Tất type HPV phân chia toong nhân tế bào chủ Đối với nhóm HPV gây tổn thương lành tính thi DNA gene virus tồn độc lập với DNA tế bào chủ nhân đôi dạng episom plasmid Ngược lại, tổn thương ác tính liên quan tới HPV 16 HPV 18 thi DNA virus lại thường sát nhập vào gene tế bào chủ Để sát nhập vào gene tế bào chủ thi phải xảy đứt gãy gene virus, thường vùng E1/E2 Sự đứt gãy dẫn tới việc chức gene El E2, từ kiểm sốt biểu E6 E7, làm cho tế bào bị biến đổi Vị trí sát nhập vào gene tế bào chủ ngẫu nhiên dường vai trị nhiều q trinh phát sinh ung thư Hoạt tính gây ung thư E6 E7 chủ yếu khả tương tác với protein nội bào có vai trị điều hịa kiểm sốt chu trình tế bào p53 pRB Hai protein biết protein ức chế khối u ức chế phân chia tăng trường tế bào Việc E6 gắn lên p53 E7 gắn lên pRB dẫn đến phân hủy hai protein này, làm chức kiểm soát tăng trưởng tế bào chúng gây phát sinh ung thư [9] 1.2 Cấu trúc chức protein E7 Bên cạnh E6, E7 nhân tố gây ung thư cấc type HPV có nguy cao Protein E7 polypeptid nhỏ, có tính acid, gồm khoảng 100 amino acid E7 có vùng bảo tồn (CR) vùng CR1 đầu NH2, vùng CR2 vùng CR3 đầu COOH [10] Vùng CRI CR2 E7 cho thấy tương đồng trình tự với phần vùng CR1 tồn vùng CR2 adenovirus El A Cũng giống E1A, hai vùng bảo tồn đóng vai trị quan trọng hoạt động gây ung thư E7 type HPV có nguy cao Vùng CR1 cần thiết cho hoạt động biến đổi tế bào phân hủy pRB (retinoblastoma tumor suppressor protein) lại khơng tham gia trực tiếp vào q trình gắn lên pRB E7 Vùng CR2 có chứa motif Leu-X-Cys-X-Glu (LXCXE) cần cho gắn kết E7 pRB Kế motif LXCXE vị trí phosphoryl hóa kinase casein n (CK n) cần cho hoạt động biến đồi tế bào E7 Vùng CR3 chứa cẩu trúc gắn kẽm gồm hai motif CysX-X-Cys có chức dimer hóa chưa có chứng thuyết phụ cho thấy E7 tồn in vivo hay in vitro dạng dimer nhu dạng dimer cần thiết cho hoạt tính sinh học E7 cấu trúc motif tuơng tự protein E6 HP V, từ cổ thề suy hai protein có tổ tiên chung Các nghiên cứu cẩu trúc E7 chứng minh vùng CRI CR2 E7 không gấp cuộn vùng CR3 gấp cuộn thành dạng cẩu trúc gắn kẽm đặc trung [10,11] Hình 1.1: cấu trúc protein E7 pi] E6 E7 hai protein virus trì biểu hoạt tính chúng suốt chu trình sổng virus trình phát sinh ung thư Theo sổ nghiên cứu, protein E7 tìm thấy chủ yếu nhân, noi mà nỗ liên kết với pRB protein thuộc họ ‘^pocket protein” pl07 pl30 thông qua motif LXCLE CR2, để lách thỉch tể bào tiến vào pha s Trong tế bào bình thường, pRB đuợc phosphoryl hóa vào giai đoạn sám pha GI gắn vói nhân tố phiên mã E2F - tác nhân điều hòa quan trọng cho q trình tế bào thóat khơi pha GI tiến vào pha s - hỉnh thành phức hợp ức chế phiên mã Bằng cách gắn vào cảm ứng phân hủy pRB thông qua co chế hình thành phức hợp ly giải protein (proteosomal), E7 ngăn cân pRB liên kết với E2F E2F tợ hoạt động nhân tố tăng cưởng phiên mã, kích thỉch tế bào vượt qua pha GI vả tiến vào pha s cách khơng kiểm sốt Giá trị ngưỡng: 0,276 Ghi chú: +: dương tính với HPV ăm tính với HPV ❖ Xác định giá trị ngưỡng (cut off): Đối với thử nghiệm ELISA, để khẳng định mẫu dương tính với kháng nguyên định thi giá trị OD mẫu phải lớn giá trị ngưỡng đáng tin cậy Giá trị ngưỡng thường xác định giá trị OD phản ứng mà mẫu có giá trị OD lớn giá trị ngưỡng coi mẫu dương tính, ngược lại mẫu âm tính Thơng thường, giá trị ngưỡng tính dựa giá trị OD lượng lớn mẫu âm tính với kháng nguyên mục tiêu, số mẫu âm lớn thi giá toi ngưỡng đáng tin cậy Công thức xác định giá trị ngưỡng (cut off) [Error! Reference source not found., Error! Reference source not found.]: Giá trị ngưỡng = ODtrang bình mẫu âm+ 3* STDifr, nhít mẫu âm (*) Trong số 15 bệnh phẩm, có bệnh phẩm cho kết định tính HPV PCR âm tính Vì vậy, chúng tơi dùng bệnh phẩm để xác định giá trị ngưỡng phản ứng Dựa vào công thức (*) giá trị OD mẫu âm bảng 3.5 chúng tơi tìm giá trị ngưỡng 0,276 Tuy nhiên, số lượng bệnh phẩm thu nhận (5 mẫu) nên độ tin cậy giá trị ngưỡng không cao ❖ Nhận xét: Sau tiến hành áp dụng quy trình ELISA xây dựng bệnh phẩm thu nhận được, nhận thấy 10 mẫu dương tính với HPV đem xét nghiệm có mẫu cho giá trị OD lớn giá trị ngưỡng mẫu 2, mẫu 3, mẫu mẫu 30 Băng 3.6: Kết định type 15 bệnh phẩm HPV Bệnh phâm Kêt fljnh type HPV Mầu 1, 2, HPV 18 Mầu 5, 6, HPV 16 Mâu 10 HPV 16 + 18 + 58 So sánh kết ELISA với kết định type HPV bảng 3.6, nhận thấy: - Trong mẫu nhiễm HPV 18 (mẫu 1, 2, 4) có mẫu mẫu cho giá trị OD lớn hom giá trị ngưỡng (0,303 0,281) Như vậy, quy trình chúng tơi bước đầu phát protein E7 HPV 18 Mầu mẫu có OD thấp giá trị ngưỡng Không giống xét nghiệm DNA, xét nghiệm protein phụ thuộc nhiều vào lượng mẫu lấy Protein E7 lại protein có độ biểu khơng lớn tế bào [13] nên xét nghiệm E7 cần lượng protein E7 đủ cao đến ngưỡng ELISA phát Có nhiều nguyên nhân khác dẫn đến lượng E7 thu nhận ơong hai mẫu không đủ cao như: lượng tế bào thu từ bệnh phẩm ít; dịch phết lấy vùng cổ tử cung khơng lấy trúng vùng khu trú HPV nên không thu nhận tế bào có biểu protein E7 cao Trong mẫu nhiễm HPV 16 (mẫu 5, 6, 8) có hai mẫu có giá trị OD cao giá trị ngưỡng (0,289 0,298); hai mẫu lại có giá trị OD thấp giá trị ngưỡng (0,234 0,230) Điều cho thấy quy trình ELISA có khả cho phản ứng chéo với type 16 Việc hai mẫu có OD thấp giá trị ngưỡng giải thích giống trường hợp mẫu Tuy nhiên, để có kết luận chắn cần tiến hành xét nghiệm nhiều mẫu nhiễm HPV type 16 khác để có kết có ý nghĩa thống kê Đồng thời nên tiến hành xét nghiêm nhiều mẫu nhiễm HPV type khác để có khẳng định chắn độ đặc hiệu quy trình, type 45 - type gần gũi mặt tiến hóa với type 18 31 Mầu 10 đồng nhiễm type 16, 18, 58 cho giá trị OD thấp hom giá trị ngưỡng Chúng tơi phân tích kết mẫu dạng đồng nhiễm nhằm mục đích xem xét xem quy trình chúng tơi phát protein E7 type 16 18 trường hợp xảy đồng nhiễm với nhiều type khác hay khơng tình trạng phổ biến tiến hành định type HPV Tuy nhiên với kết không phát protein E7 HPV 16 18 dạng đồng nhiễm Điều lượng tế bào thu hai mẫu nên lượng protein E7 hai type 16 18 không đủ lớn để phát quy trình > Như vậy, dựa kết xét nghiệm 15 bệnh phẩm UTCTC, nhận thấy quy trình ELISA chúng tơi phát protein E7 HPV 18, đồng thời cho phản ứng chéo với protein E7 HPV 16 Tuy nhiên, quy trinh chưa hoàn chinh, cần phải tối ưu quy trinh lấy xử lý bệnh phẩm tiến hành số lượng lớn bệnh phẩm để kết có ý nghĩa thống kê 3.4 XÁC ĐỊNH Độ NHẠY CỦA QUY TRÌNH ELISA Do khơng thể xác định xác lượng protein E7 HPV 18 biểu bệnh phẩm nên xác định độ nhạy quy trình trực tiếp bệnh phẩm Chúng tơi sử dụng protein E7 tái tổ hợp để xác định cách tưomg đối độ nhạy quy trình Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành pha lỗng bậc protein E7 tái tổ hợp từ nồng độ 62,5 ng/ml (tưomg đương vái 3,125 ng E7 giếng) xuống 3,906 ng/ml (tương đương với 0,195 ng E7 giếng) để dựng đường chuẩn mối tương quan tuyến tính nồng độ E7 giá trị OD Dựa vào đường chuẩn giá trị ngưỡng quy trình ELISA suy lượng E7 tối thiểu mà quy trình phát Đó giới hạn phát hay độ nhạy quy trình Thí nghiệm lặp lại lần kết trình bày bảng 3.7 32 Bảng 3.7: Kết đựng đường chuẩn xác định độ nhạy quy trình EUSA Nơng độ £7 E7 (ng/ml) OD E7 (ng/giếng) Lần Lần Làn Trung bành ± STD 62,500 3,125 0,916 0,869 0,914 0,900 ±0,027 31,250 1,563 0,648 0,592 0,584 0,608 ± 0,035 15,625 0,781 0,429 0,396 0,404 0,410 ±0,017 7,813 0,391 0,309 0,304 0,305 0,306 ±0,003 3,906 0,195 0,277 0,266 0,251 0,265 ± 0,013 Từ bảng kết vẽ đồ thị sau: Hình 3.12: Đường chuẩn xác định độ nhạy quy trình ELISA Nhận xét: Đồ thị thu cỏ dạng tuyển tỉnh vởi giá trị R2 0,993 giống với dạng đồ thị xác định độ nhạy quy trình ELISA dựa protein E7 HPV 18 tái tổ hợp Selvay L A cộng [12] Vì vậy, giá trị OD thu phụ thuộc tuyến 33 tính vói hàm lượng kháng ngun E7 HPV 18 Giá trị ngưỡng tính từ mẫu âm HPV mục 0,276 So sánh với kết bảng 3.7, nhận thấy giá trị OD giếng có lượng kháng nguyên E7 3,125 ng 0,195 ng 0,900 0,265 Giá trị ngưỡng quy trình ELISA nằm khoảng Vì ngoại suy từ đồ thị để tính lượng protein E7 thấp mà quy trình ELISA chúng tơi phát Sù dụng giá trị ngưỡng để ngoại suy từ đồ thị, thu lượng protein E7 tưcmg ứng với giá trị OD ngưỡng 0,276 0,197 ng Như vậy, quy trình ELISA chúng tơi phát lượng tối thiểu 197 pg protein E7 tái tổ hợp 34 PHẦN KÉT LUẬN Ý NGHĨA KHOA HỌC KẾT LUẬN Từ kết thực nghiệm, rút kết luận sau: - Kháng thể đơn dòng đa dòng sử dụng quy trình ELISA tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV 18 biểu toong dòng tế bào CHO-K1 tế bào HeLa - Xây dựng quy trình sandwich ELISA phát E7 HPV 18 dựa E7 tái tổ hợp với thông số sau: kháng thể đa dòng phủ giếng (625 ng/giếng), kháng thể đơn dòng (375 ng/giếng) kháng thể thứ cấp đánh dấu alkaline phosphatase (độ pha loãng 1/1000) Tác nhân block sù dụng BSA 1% - Áp dụng quy trình ELISA số mẫu bệnh phẩm HPV 18 type khác: quy trình ELIS A chúng tơi bước đầu phát diện protein E7 HPV 18; cho phản ứng chéo với HPV type 16 - Quy trình phát lượng tối thiểu 197 pg protein E7 tái tổ hợp Ý NGHĨA KHOA HỌC Nghiên cứu xây dựng quy trình ELISA phát protein E7 HPV 18 bệnh phẩm UTCTC Những ích lợi đạt tù nghiên cứu này: • Ở hướng ứng dụng thực tiễn: - Đây công cụ giúp phát nhanh diện HPV type có nguy cao thể Từ đó, giúp dự đốn khả mắc UTCTC có phương pháp phịng ngừa điều trị kịp thời cho người bệnh, sử dụng chiến lược vaccine hiệu - Đơn giản, áp dụng số lượng mẫu lớn nên ứng dụng rộng rãi toong bệnh viện trung tâm y tế để xét nghiệm HPV ■ Ở hướng nghiên cứu bản: - Tạo tiền đề cho nghiên cứu nhằm xây dựng quy trinh ELISA để phát tác nhân gây bệnh toong thể 35 - Đóng góp vào nghiên cứu nhằm phát diện HPV khả tiến triển thành UTCTC nhiễm HPV type nguy cao 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO GlaxoSmithKline 2007 Cervical cancer key facts Wright T C J 2006 HPV DNA Testing for Cervical Cancer Screening International journal of gynecology & obstetrics 95 (1): S239-S246 Stanley M 2008 Immunobiology of HPV and HPV vaccines Gynecologic Oncology 109: S15-S21 Dolinsky C., Hill-Kayser C 2009 Cervical cancer: the basic Oncolink Bristow E R., Montz FJ 1998 Human papillomavirus: Molecular biology and screening applications in cervical neoplasia—A primer forprimary care physicians Prim Care Update Ob/Gyns 5: 238 246 Beutner K R., Tyring S 1997 Human papillomavirus and Human disease The American Journal of Medicine 102 (5A): 9-15 Hawley-Nelson P., Ciccarone V., Moore M L 2008 Transfection of culture eukaryotic cells using cationic lipid reagents Current Protocols in Molecular Biology 9.4.1-9.4.17 Castellsague X 2008 Natural history and epidemiology of HPV infection and cervical cancer Gynecologic Oncology 110: S4-S7 Beutner K R., Tyring S 1997 Human papillomavirus and Human disease The American Journal of Medicine 102 (5A): 9-15 10 Boulet G., Horvath C., Broeck D V., Sahebali S., Bogers J 2007 Human papillomavirus: E6 and E7 oncogenes The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 39: 2006-2011 11 McLaughlin-Drubin M E., Miinger K 2008 The human papillomavirus E7 oncoprotein Virology 384: 335-344 37 H.Selvey L A., Dunn L A., Murray B., Tindle R W., Frazer L H 1992 An ELISA capture assay for the E7 transforming proteins of HPV 16 and HPV 18 Journal of VirologicalMethods 37: 119-128 13 Frazer I, Dunn L., Tindle R W., Fernando G 1995 Immunoassay for cervical cancer World Intellectual Property Organization 14 Roger B P., Schweizer J., Weigl B 2006 A magnetic immunochromatographic strip test fpr detection of Human papillomavirus 16 E6 Clinchem 15.Sehr P., Muller M., Hopfl R., Widschwendter., Pawlita M HPV antibody detection by ELISA with capsid protein LI fused to glutathione Stransferase Journal of Virological Methods 106: 61 - 70 16 Hawley-Nelson P., Ciccarone V., Moore M L 2008 Transfection of culture eukaryotic cells using cationic lipid reagents Current Protocols in Molecular Biology 9.4.1-9.4.17 17 Crowther J R 2001 The ELISA guidebook Humana Press 18 Ressler S., Scheinden R., Dreier K 2007 High-risk Human Papillomavirus E7 Oncoprotein Detection in Cervical Squamous Cell Carcinoma Clin Cancer Res 13 (23): 7067-7072 19 Feilder M., Müller-Holzner E.,Viertler H-P 2004 High level HPV-16 E7 oncoprotein expression correlates with reduced pRb-levels in cervical biopsies The FASEB Journal 20 Feilder M., Ressler S 2005 Expression of the high-risk human papillomavirus type 18 and 45 E7 oncoproteins in cervical carcinoma biopsies Journal of General Virology 86: 3235-3241 38 PHỤ LỤC KÉT QUẢ XÁC ĐỊNH NÒNG ĐỘ KHẢNG THẺ ĐƠN DÒNG VÀ ĐA DÒNG sử I ELISA 1.1 Xác định nồng độ kháng thể đa dòng OD Nồng độ Pab nhủ giếng E7 ug/ml E7 2.5 ug/nd E7 1.25 ug/ml (l»gÁnl) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 50,000 2,047 1,842 1,704 1,681 1,548 1,374 1,358 1,194 1,157 25,000 2,024 2,074 1,605 1,603 1,464 1,321 1,307 1,188 1,155 12,500 1,916 1,655 1,548 1,519 1,399 1,302 1,244 1,194 1,13 6,250 1,697 1,532 1,387 1,349 1,282 1,196 1,182 1,078 1,054 3,125 1,494 1,331 1,171 1,181 1,123 1,038 1,012 0,969 0,923 1,563 1,072 1,042 0,862 0,888 0,853 0,745 0,835 0,687 0,657 0,781 0,926 0,829 0,73 0,628 0,629 0,505 0,551 0,539 0,423 0,391 0,877 0,726 0,459 0,35 0,373 0,354 0,359 0,621 0,486 39 1.2 Xác định nồng độ kháng thể đon dòng kháng thể thứ cấp Nằng độ Mab ‘ (pg/ml) 15,00 7,50 3,75 1,88 0,94 0,47 0,23 blank Mab OD Kháng thứ cấp mooo Lân Lân Lân 3,496 3,194 2,883 3,229 2,708 2,775 2,885 2,545 2,492 2,554 2,179 2,165 2,207 1,904 1,827 1,754 1,458 1,46 1,294 1,173 1,139 0,046 0,164 0,176 Kháng thứ cấp 1/2000 Lân Lân Lân 1,979 1,819 1,713 1,828 1,692 1,666 1,684 1,581 1,336 1,443 1,331 1,263 1,302 1,101 1,074 1,021 0,988 0,954 0,805 0,812 0,728 0,108 0,096 0,104 40 Kháng thề thứ cấp 1/4000 Lân Lân Lân 31,012 1,119 1,034 1,018 0,958 0,967 0,908 0,784 0,881 0,758 0,77 0,749 0,715 0,667 0,628 0,615 0,603 0,481 0,498 0,499 0,071 0,083 0,081 1.3 Ket thống kẽ khảo sát nồng độ kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme Multiple Range Tests for Col_2 by Col_l Method: 95.0 percent LSD Col_l Count Mean Homogeneous Groups Contrast 3 1.055 1.837 3.191 X X 1-2 1-4 2-4 X Sig * * # Difference 1.354 2.136 0.782 +/- Lmits 0.391293 0.391293 0.391293 * denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Col_3 by Col_l Method: 95.0 percent LSD Col_l Count Mean Homogeneous Groups Contrast 3 0.992 1.72867 2.904 X X 1-2 1-4 2-4 X Sis■ * * * Difference 1.17533 1.912 0.736667 +/- Limits 0.343845 0.343845 0.343845 * denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Col_4 by Col_l Method: 95.0 percent LSD CoU Count Mean Homogeneous Groups Contrast 3 0.886333 1.53367 2.64067 X X 1-2 1-4 2-4 X * denotes a statistically significant difference 41 Sig # # * Difference 1.107 175433 0.647333 +/- Lừnừs 0.338578 0.338578 0.338578 Multiple Range Tests for Col_5 by Col_l Method: 95.0 percent LSD ColJ Count Mean Homogeneous Groups Contrast 3 0.803 1.34567 2.29933 X X 1-2 1-4 2-4 X Sig * * * Difference 0.953667 1.49633 0.542667 +/- Limits 0.286174 0.286174 0.286174 * denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Col_6 by Col_l Method: 95.0 perỗoit LSD Col_l Count Mean Homogeneous Groups Contrast 3 0.710333 1.159 1.97933 X 1-2 1-4 2-4 X X Sig * * * Difference 0.820333 1.269 0.448667 +/- Limits 0.276772 0.276772 0.276772 * denotes a statistically significant difference Multiple Range Tests for Col_7 by Col_l Method: 95.0 perỗoit LSD ColJ Count Mean Homogeneous Groups Contrast Sig Difference 3 0.615333 0.987667 1.55733 X 1-2 1-4 2-4 * * * 0.569667 0.942 0.372333 X X * denotes a statistically significant difference 42 +/- Limits 0.200747 0.200747 0.200747 Multiple Range Tests for Col_8 by Col_l Method: 95.0 perỗoit LSD ColJ Count Mean Homogeneous Groups Contrast 3 0.492667 0.781667 1.202 X X 1-2 1-4 2-4 X Sig * * * Difference 0.420333 0.709333 0.289 +/- Lmi 0.10889 0.10889 0.10889 Sig * Difference +/-LÒ -0.0743333 -0.0103333 0.008 -0.043 -0.0666667 0.064 0.0823333 0.0313333 0.00766667 0.0183333 -0.0326667 -0.0563333 -0.051 -0.0746667 -0.0236667 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 0.038 * denotes a statistically significant difference KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢO SÁT TÁC NHÂN BLOCK GIẾNG Multiple Range Tests for Col_2 by Col_l Contrast 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 2-3 2-4 2-5 2-6 3-4 3-5 3-6 4-5 4-6 5-6 Method: 95.0 perỗoit LSD Col_l Count Mean Homogeneous Groups 3 3 3 0.154 0.162 0.172333 0.205 0.228667 0.236333 X X XX XX X X * denotes a statistically significant difference 43 * * * * * * * ... với protein E7 biểu toong bệnh phẩm nhiễm HPV 18 Chúng sù dụng hai loại kháng thể để tiến hành xây dựng quy trình ELISA để phát protein E7 19 3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ELISA PHÁT HIỆN PROTEIN E7. .. quy trình ELISA số mẫu bệnh phẩm HPV 18 type khác: quy trình ELIS A chúng tơi bước đầu phát diện protein E7 HPV 18; cho phản ứng chéo với HPV type 16 - Quy trình phát lượng tối thiểu 197 pg protein. .. dòng kháng protein E7 HPV 18, đề tài tiếp nối cách sử dụng hai kháng thể để xây dựng quy trình sandwich ELISA nhằm phát protein E7 HPV 18 bệnh phẩm ung thư cổ tử cung (UTCTC) 1.1 Human papillomavirus