ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN Hồ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP Hồ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH Dự THI GIẢI THƯỞNG SINH VÉN NGHIÊN cứu KHOA HỌC - EURÉKA LẦN THỨ 11 NĂM 2009 TÊN CƠNG TRÌNH: XÂY DựNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH LOẠN DƯỠNG Cơ DUCHENNE TRÊN NGƯỜI DựA TRÊN PHẢN ỨNG PCR LĨNH Vực NGHIÊN CỨU: Tự NHIÊN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÁC GIẢ: Phạm Ngọc Khơi Jttă iế eồniỊ trình : (^phần nìuị í'ĨLp thành ghi) ĐỒN INCS HỒ CHÍ MINH BCH TP HỒ CHÍ MINH BAN TỔ CHỨC GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NCKH - EURÉKA LẦN 11 NĂM 2009 CƠNG TRÌNH NGHIÊN cứu XÂY DựNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH LOAN DƯỠNG Cơ DUCHENNE TRÊN NGƯỜI DƯA TRÊN PHẢN ỨNG PCR Tháng - 2009 MỤC LỤC Trang Tóm tắt l Đặt vấn đề II Mục tiêu phương pháp II Mục tiêu cơng trình nghiên cứu II Phương pháp nghiên cứu n.2.1 Xác định giới tính multiplex pCR n.2.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu n.2.1.2 Phương pháp tách chiết DNA n.2.1.3 Phương pháp multiplex PCR n.2.1.4 Đảm bảo chất lượng phản ứng n.2.1.5 Phương pháp điện di gel agarose n.2.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLP A n.2.2.1 Bảo quản mẫu n.2.2.2 Phương pháp MLP A n.2.2.3 Đảm bảo chất lượng phản ứng n.2.2.4 Điện di MLP A hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 n.2.2.5 Phương pháp phân tích kết 10 n.2.3 Đe xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 10 III m Giải vấn đề 10 l Kết cơng trình 10 m.1.1 Xác định giới tính multiplex PCR 10 in.1.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLPA 14 in.1.3 Đồ xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 24 m.2 Thảo luận 24 in.2.1 Xác định giới tính multiplex PCR 24 in.2.2 Chẩn đoán đột biến đoạn gen DMD MLP A 25 in.2.3 Đề xuất lưu đồ tầm soát trước sinh 28 IV Kết luận đề nghị 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đe nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 35 DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình Ngun lý hoạt động hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 Hình Kết điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY 10 mẫu máu 11 Hình Kết điện di sản phẩm PCR khảo sát gen SRY 10 mẫu ối 13 Hình Kết đột biến exon ba multiplex A, B c 16 Hình Kết phân tích mẫu 8029 Probemix P034 - A2 (1) 20 Hình Kết phân tích mẫu 8029 Probemix P034 - A2 (2) 20 Hình Kết phân tích mẫu 8029 Probemix P035 - A2 (1) 21 Hình Kết phân tích mẫu 8029 Probemix P035 - A2 (2) 21 Hình Kết phân tích mẫu chứng nam Probemix P034 - A2 22 Hình 10 Kết phân tích mẫu chứng nam Probemix P035 - A2 22 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐÒ VÀ Lưu ĐỒ BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Vùng đoạn exon gen DMD 24 LƯU ĐỒ Trang Lưu đồ 4.1 Lưu đồ tư vấn tầm soát trước sinh bệnh DMD 29 DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng Thành phần phản ứng multiplex PCR xác định giới tính Bảng Chu trình luân nhiệt cho phản ứng multiplex PCR Bảng Chu trình luân nhiệt cho phản ứng MLP A Bảng Danh sách bệnh nhân làm NST đồ karyotype 11 Bảng Kết khảo sát gen SRY bệnh nhân làm karyotype 12 Bảng Danh sách thai nhi làm kỹ thuật FISH 13 Bảng Kết khảo sát gen SRY thai nhi làm kỹ thuật Bảng Danh sách gia đình mắc DMD với đột biến chẩn đoán 15 Bảng Kích thước 25 exon khuếch đại bộmultiplex PCR 15 Bảng 10 Danh sách 18 bệnh nhân DMD với đột biến chẩn đoán 16 Bảng 11 Kết chẩn đoán DMD Probe P034 - A2 17 Bảng 12 Kết chẩn đoán DMD Probe P035 - A2 18 FISH 14 Bảng 13 Danh sách bệnh nhân DMD bị đột biến exon (MLPA) 23 Bảng 14 Tần suất đoạn vùng exon gen DMD 23 TÓM TẮT Loạn dưỡng Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) bệnh thần kinh - di truyền phổ biến với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai đẻ sống Bệnh DMD có chất đột biến gen dystrophin nhiễm sắc thể giới tính X Hơn 65% trường hợp đột biến lặp đoạn gen Kỹ thuật MLPA gần cho chẩn đoán đoạn gen hiệu Mục tiêu: Sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính trước chẩn đoán đột biến DMD đánh giá hiệu kỹ thuật MLPA phát đột biến đoạn gen DMD Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Hai mươi mẫu DNA bệnh nhân dừng để xác định giới tính hai mươi mẫu DNA bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng bệnh DMD/BMD phát đột biến đoạn gen multiplex PCR Bảy mươi chín exon gen khảo sát kit SALSA® MLPA® P034 - A2 P035 - A2, điện di mao quản CEQ™ 8000 phân tích tự động phần mềm Gene Marker Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật multiplex PCR để xác định giới tính phương pháp MLPA cho phép xác định xác kích thước đoạn DNA bị đột biến, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh có độ lặp lại cao Tất exon gen DMD bị khẳng định biểu đồ kết Bộ ba multiplex PCR chẩn đoán trước khảo sát hai mươi lăm exon có exon khơng phát so với MLPA Kết luận: Kỹ thuật multiplex PCR dùng để xác định giới tính xác, đặc hiệu; phương pháp MLPA giúp phát nhanh chóng, tồn diện đột biến đoạn gen DMD ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR Hiệu kinh tế áp dụng thực tiễn: Hồn thiện quy trình xác định giới tính người kỹ thuật di truyền phân tử nhận thấy với kỹ thuật hiệu kinh tế đem lại lớn so với kỹ thuật khác áp dụng Phòng Di truyền nhiễm sắc thể đồ karyotype, FISH, quy trình triển khai nhằm khảo sát gen SRY NST Y bệnh nhân rối loạn giới tính Bên canh đó, với kỹ thuật MLPA khảo sát 79 exon gen DMD bước đầu thành cơng chẩn đốn phân tử chuẩn lại quy trình chẩn đoán để sớm triển khai nhằm ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh trường hợp đoạn gen cho thai nhi dễ dàng giúp cho việc phòng bệnh chủ động tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh, bước chuẩn bị cho việc điều trị liệu pháp gen tương lai giảm gánh nặng cho xã hội, nâng cao chất lượng dân số I Đặt vấn đề Bệnh loạn dưỡng Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính Bệnh gây nên đột biến gen dystrophin, gen nằm vị trí Xp21 NST X, đến chúng biết gen lớn thể người với chiều dài 2400 kb, mã hóa phiên mã mRNA dài 14 kb, bao gồm 79 exon 99,4% cấu trúc gen intron Protein mã hóa gen dystrophin với khối lượng phân tử 427 kDa, có chức việc trì ổn định màng Bệnh DMD bệnh nặng, hầu hết trẻ trai mắc bệnh có triệu chứng suy yếu tiến triển, cuối dẫn đến tàn phế, khả lại lứa tuổi 12 tử vong lứa tuổi 20 - 25 tổn thương tim rối loạn hô hấp Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao số nhóm bệnh di truyền thần kinh (1/3500 trẻ trai) gây hậu nặng nề cho gia đình người bệnh cộng đồng xã hội Cho đến đồ đột biến gen dystrophin gần xác định hoàn tất với hai vùng đột biến đoạn trọng điểm (hotspot region) vùng 5’ tận (vùng exon - 19) vùng trung tâm (vùng exon 45 - 52) chiếm 60% tỷ lệ đột biến, đột biến điểm đứng thứ chiếm 25 - 30%, lại đột biến lặp đoạn chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% Ở Việt Nam, có số nghiên cứu mức độ phân tử Tuy nhiên, khó khăn việc tách chiết RNA tổng số từ máu tươi, nghiên cứu xác định đột biến mức DNA Do sử dụng 19 cặp mồi để khuếch đại 19 exon hay xảy đột biến đoạn nên kết phát gần 40% số bệnh nhân có đột biến đoạn so với tỷ lệ thường gặp 60% Điều chứng tỏ khoảng 20% đột biến nằm vùng 19 exon hay xảy đột biến đoạn bệnh nhân DMD nghiên cứu Việt Nam Trong chẩn đốn bệnh DMD kỹ thuật MLPA (Multiplex ligationdependent probe amplification) khuếch đại tồn chiều dài gen dystrophin Xác định đột biến kỹ thuật MLPA xác định tồn đột biến đoạn lặp đoạn gen dystrophin bệnh nhân DMD Bên cạnh đó, bệnh DMD hầu hết xảy trẻ trai xây dựng quy trình xác định giới tính ta sàng lọc bệnh giai đoạn đầu mà khơng cần đến việc phải chẩn đốn đột biến sau Việt Nam có tần suất bệnh cao, chi phí điều trị lại lớn nước ta nguồn lực lại có hạn khơng thể kham chi phí Do đó, chẩn đốn trước sinh biện pháp hiệu làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội Vì việc thành lập chương trình phịng chống bệnh DMD với kỹ thuật di truyền thích hợp Việt Nam cần thiết Cơng trình nghiên cứu nằm chương trình phịng chống bệnh DMD vừa kể mang tên ‘Thiết lập kỹ thuật chẩn đoán bệnh loạn dưỡng Duchenne dựa phản ứng PCR” II Mục tiêu phương pháp 11.1 Mục tiêu cơng trình nghiên cứu Xây dựng protocol cho phản ứng multiplex PCR xác định giới tính thai nhi Sử dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán loại đột biến gen dystrophin gây nên bệnh DMD, so sánh kết chẩn đoán MLPA với kết chẩn đốn trước Bệnh viện Nhi Trung ương dùng kỹ thuật multiplex PCR với 25 cặp mồi đặc hiệu Thiết lập quy trình chẩn đốn bệnh DMD trước sinh 11.2 Phương pháp nghiên cứu 11.2.1 Xác định giới tính multiplex PCR 11.2.1.1 Phương pháp thu xử lý mẫu Đối với mẫu máu: dùng ống tiêm 3ml với kim 20G lấy khoảng 3ml máu tĩnh mạch mặt trước cánh tay bệnh nhân trưởng thành Mầu máu ngoại vi cho vào ống đựng mẫu máu có sẵn chất chống đơng EDTA, sau mẫu trộn nhẹ, để lắng bảo quản 4°c đến tiến hành ly trích DNA Đối với mẫu ối: hướng dẫn đầu dò siêu âm dừng ống tiêm 10ml với kim gây tê tủy sống 18G đưa qua thành bụng đến buồng ối hút khoảng 10 - 20ml nước ối tùy theo tuổi thai Cho lượng nước ối vào ống chứa mẫu 15ml đáy nhọn vô trùng, để lắng bảo quản điều kiện 4°c đến tiến hành ly trích DNA 11.2.1.2 Phương pháp tách chiết DNA Nguyên tắc: Mau ly trích DNA ly trích DNA “High Pure PCR Template Preparation Kit” Roche sản xuất Te bào bị phá vỡ, ly giải Binding Buffer Proteinase K Dịch ly giải lọc qua cột lọc với nồng độ muối cao Màng gel silica cột lọc giữ DNA lại cho chất khác trôi qua DNA tinh hịa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp Tách chiết DNA cách sử dụng màng gel silica có ưu điểm đơn giản nhanh chóng mà khơng cần dùng 41 SALSA® MLPA® kit Pro be mix P034 - A2 DMD (tt) (1) (2) 402 Exon 28 410 Exon 68 418 426 Xql3 Exon 09 434 Exon 49 442 Exon 29 450 Exon 69 458 Exon 10 466 Exon 50 474 Exon 30 482 Exon 70 490 Xq28 ■ SALSA® MLPA® kit Probemix P035 - A2 DMD Chiều dài (nt) Vị trí NST Reference (1) 64-70-76-82 88 - - DMD (2) Chứng Q: kiểm tra nồng độ DNA Chứng D: kiểm tra q trình biến tính DNA 100 Chứng X: đặc hiệu cho NST X 105 Chứng Y: đặc hiệu cho NST Y 130 Xqll.2 138 Exon 11 146 Exon 51 154 Exon 31 162 170 Exon 71 178 Exon 52 186 Exon 32 Exon 12 42 ■ SALSA® MLPA® kit Probemix P035 - A2 DMD (tt) (1) (2) 194 202 Exon 72 Xp22 210 Exon 13 218 Exon 53 226 234 Exon 33 242 Exon 14 250 Exon 54 258 Exon 34 266 274 Exon 74 Exon 73 Xq28 282 290 Exon 15 298 Exon 35 306 Exon 75 314 Exon 16 322 Exon 56 330 Exon 36 338 Exon 76 354 Exon 17 362 Exon 57 370 Exon 37 378 Exon 77 386 Exon 18 394 Exon 58 402 Exon 38 410 Exon 78 418 426 Exon 55 Xql3 Exon 19 43 ■ SALSA® MLPA® kit Probemix P035 - A2 DMD (tt) (1) (2) 434 Exon 59 442 Exon 39 450 Exon 79 458 Exon 20 466 Exon 60 474 Exon 40 482 Exon DP427c 490 Xq28 ■ DMD probe xếp theo thứ tự NST Chiều dài (nt) DMD exon P034/P035 (1) (2) Trình tự nucleotide Khoảng cách đến (20 nt vị trí nối) exon (kb) (3) (4) 482* Exon DP427c CAGTAATAGA-ATGCTTTCAG 127.9 138* Exon 01 CCCCCTACAG-GACTCAGATC 191.3 170* Exon 02 CAAAAGAAAA-CATTCACAAA 170.4 210 Exon 03 CTCTTC AG TG- ACC T AC AGG A 242 Exon 04 CCCTGAACAA-TGTCAACAAG 282 Exon 05 AGATGG A AAT- c AT AA ACTG A 6.7 314 Exon 06 CCAACAGTGA-AAAGATTCTC 7.0 354 Exon 07 GGAATAGTGT-GGTTTGCCAG 110.4 386 Exon 08 TTGAAGCCAT-CCAGGAAGTG 1.2 426 Exon 09 ACAGGG ATAT- G AG AG AACTT 458 Exon 10 AGACAAGTCA-TTTGGCAGTT 0.8 138 Exon 11 TTGACAGCCC-ATCAGGGCCG 29.9 170 Exon 12 AGCCTCTTGG-ACCTGATCTT 18.5 210 Exon 13 242 Exon 14 GGTAGTTGAT-GAATCTAGTG 22.0 0.2 282 Exon 15 TGGCTTTCAG-AAAAAGAAGA GGGCAAAC AT- CTGTAG ATGG 5.0 21.5 52.8 7.8 44 ■ DMD probe duqrc sap xep theo thii tir NST (tt) (1) (2) (3) (4) 314 Exon 16 GCAATCCATG-GGCAAACTGT 20.6 354 Exon 17 AACAGATCCT-GGTAAAGCAT 27.2 386 Exon 18 AAGCTGTGTT-GCAGAGTCCT 16.3 426 Exon 19 AAGCTG AG A A- GTTC AG A AA A 10.4 458 Exon 20 GTGGATCGAA-TTCTGCCAGT 6.4 154 Exon 21 AAGGACAAGG-ACCCATGTTC 12.7 186 Exon 22 AGGAGACCAT-GAGTGCCATC 3.6 226 Exon 23 GGCCTATACT-ATCTCAGCAC 4.0 258 Exon 24 GGCCTGCCCT-TGGGGATTCA 1.1 298 Exon 25 CAGAAG ATA A- AG A ATG A AGC 8.8 330 Exon 26 GTAAGCCTCC-AGAAAGATCT 6.2 370 Exon 27 TGAGTCTGT A- AAT AGTGTC A 7.3 402 Exon 28 GGCATGAGTT-ATTGTCATAC 3.0 442 Exon 29 ACAGACCCTA-ACAGATGGCG 26.4 474 Exon 30 AAGTTGCTTG-AACAGAGCAT 21.8 154 Exon 31 GGAGGCTGCC-CAAAGAGTCC 0.6 186 Exon 32 CTGC ATTG G A- A AC A A AG AG T 3.1 226 Exon 33 TCTGAAGTGG-AAATGGTGAT 5.8 258 Exon 34 GAAAGG A AAT- GAATGTCTTG 298 Exon 35 CCTGAAGAGT-ATCACAGAGG 0.5 330 Exon 36 ATCACAAAGT-GGATCATTCA 1.8 370* Exon 37 TGGCTGCAAA-TCGATGGTTG 14.4 402 Exon 38 CTGAAATTCA-GCAGGGGGTG 2.4 442 Exon 39 TGC A A AG AGG- AG AC A AC TT A 2.8 474 Exon 40 AAGGCTCTAG-AAATTTCTCA 1.0 15.5 146 Exon 41 GGGCTTGTCT-GAGGATGGG 32.0 178 Exon 42 CGATGATGGT-GATGACTGAA 22.6 218 Exon 43 ATTGCAAAGT-GCAACGCCTG 70.6 250 Exon 44 ACAGTTTCTC-AGAAAGACAC 248.6 45 ■ DMD probe xếp theo thứ tự NST (tt) (1) (2) (3) (4) 290 Exon 55 ACTC AT AG A T- T AC TG c A AC A 120.5 322 Exon 56 TCCTGTTACA-AAGACGTTTG 10.5 362 Exon 57 GAAAG ATG AT- GAATTAAGCC 17.8 394 Exon 58 AGACTGT ACG- A AT ATTTCTG 0.8 434 Exon 59 GATGAGACCC-TTGAAAGACT 33.6 466 Exon 60 GCCTCTGAAA-GAGAACGTGA 96.0 162 Exon 61 GCAGCTGCAT-GAAGCCCAC 25.0 194 Exon 62 TCCCTGGGAG-AGAGCCATCT 62.6 234* Exon 63 AAAC A ACTTG- CTGGG ACC AT 37.9 266* Exon 64 CTGCAGTCTT-CGGAGTTTCA 13.4 306 Exon 65 GCTGCATGTG-ATGCCTTGGA 3.0 338 Exon 66 CTGTCTTTTA-AAACTGGCAT 2.6 378* Exon 67 ACACTTGGCT-CAATGTTACT 21.1 410 Exon 68 GACTGG ATG A- G ACTGG A ACC 2.4 450 Exon 69 TTTTTTTCTG-GTCGAGTTGC 1.7 482 Exon 70 CCCCG A ATGG- GC T AC c TGC c 0.8 162* Exon 71 TCTGATCAAC-TTCTGGCCAG 4.4 194 Exon 72 CCTCAGCTTT-CACACGATGA 1.2 234* Exon 73 TATCATTTAG-ATAAGATCCA 2.9 266 Exon 74 306 Exon 75 cc AG ATC TT G- ATTTC c TT AG TGAGCTCATT-GCTGAGGCCA 22.1 1.0 338 Exon 76 ACCTCTCTAC-AGAGGTCCGA 12.2 378 Exon 77 CCAGGACACA-AGCACAGGGT 7.5 TGGAAAGC c A- ATG AG AG AGG 4.8 410* Exon 78 450 Exon 79 CCACATGGC A- GATGATTTGG * Là probe đặc hiệu trình tự chi DNA ngược có phân trình tự intron 46 • Phụ lục Cách tiến hành tách chiết DNA ly trích DNA “High Pure PCR Template Preparation Kit” Roche sản xuất Trước ly trích, làm ấm Elution Buffer 70 °c máy ủ nhiệt Cho 200 pl mẫu vào tube 1,5 ml + 200 pi Binding Buffer + 40 pi Proteinase K Đối với mẫu tế bào ối: quay ly tâm 10ml nước ối với tốc độ 1500 vòng/phút 10 phút, thu nhận 200 pl cặn lắng tế bào Trộn vortex ủ 70°c 10 phút Thêm vào 100 pl Isopropanol vortex thật kỹ Đặt cột lọc vào ống thu thập hút toàn dung dịch sau ủ cho vào cột lọc Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút phút Sau ly tâm, bỏ dịch ống thu thập, chuyển cột lọc vào ống thu thập Cho vào 500 pi Inhibitor Removal Buffer ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút phút Sau ly tâm, Cho vào 500 pi Washing Sau ly tâm, bỏ dịch ống thu thập, chuyển cột lọc vào Buffer ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút bỏ dịch ống thu thập, chuyển cột lọc vào ống thu thập phút ống thu thập Tiếp tục cho vào 500|il Washing Buffer lần thứ ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút phút Đổ bỏ dịch, ly tâm cột với tốc độ tối đa 14000 vòng/phút 10 giây để loại bỏ hồn tồn Washing Buffer Hịa tan DNA: chuyển cột lọc vào tube 1,5 ml Cho vào cột Buffer làm ấm 70°c trước ly tâm tốc độ 10000 200 pi Elution vòng/phút phút Thu mẫu DNA: dung dịch thu chứa DNA, dừng cho chẩn đốn, hay lưu trữ tạm thời - 8°c lưu trữ lâu dài -15 đến -25°c Đo nồng độ đánh giá chất lượng DNA trước sử dụng máy định lượng DNA (Eppendorf Biophotometerplus) 47 • Phụ lục Cách tiến hành điện di gel agarose Chuẩn bị gel agarose 2% (Bio - Rad) dung dịch đệm TBE IX bể điện di nằm ngang (Mupid®exU) Trộn pl sản phẩm PCR với pl đệm tải xanh (cyanole bromophenole blue) tải vào giếng điện di Tải vào pl thang kích thước 100 bp (Promega) vào giếng kích thước Nối máy điện di với nguồn điện di 100 V Sau điện di, gel nhuộm dung dịch ethidium bromide (0,5 pg/ml) khoảng phút Khảo sát chụp hình gel nhuộm máy chụp hình gel (Bio - Rad Molecular Imager® Gel Doc™ XR) lưu lại kết • Phụ lục Cách tiến hành phưorng pháp MLP A Bước 1: Chuẩn bị biến tính DNA Pha lỗng DNA thành 10 - 20 ng/pl với dung dịch pha loãng TE IX Cho pl dung dịch DNA vào tube spin nhanh để DNA xuống đáy tube Giới hạn cho phép lượng DNA từ 20 đến 500 ng DNA, tốt khoảng 50- 100 ng Biến tính mẫu 98°c phút giữ 25°c trước mở nắp máy luân nhiệt để thực bước Bước 2: Chuẩn bị Hybridisation Master Mix lai đoạn dị Rã đơng SALSA MLPA Buffer SALSA Probemix trộn thật kỹ pipette nhiều lần Thao tác nguồn sáng yếu Probemix có huỳnh quang không vortex Chuẩn bị Master Mix chứa 1,5 pi SALSA MLPA Buffer + 1,5 pi SALSA Probemix cho phản ứng trộn thật kỹ bang pipette nhiều lần Khi máy luân nhiệt 25°c, thêm pi Master Mix vào tube Trộn thật kỹ pipette nhiều lần ủ 95°c phút tiếp tục ủ 60°c 16 48 Giữ mẫu 60°c thực bước Bước 3: Chuẩn bị Ligase - 65 Mix nối đoạn dò Rã đông Ligase - 65 Buffer A Ligase - 65 Buffer B trộn thật kỹ pipette nhiều lần Chuẩn bị hỗn hợp Ligase Buffer cho phản ứng: pl Ligase - 65 Buffer + pl Ligase - 65 Buffer B + 25 pl nước cất lần Trộn vortex Chuẩn bị Ligase - 65 Mix: Thêm pl Ligase - 65 cho phản ứng vào hỗn hợp Ligase Buffer trộn kỹ bang vortex Giảm nhiệt độ máy luân nhiệt xuống 54°c giữ 54°c Khi máy luân nhiệt 54°c, thêm 32 pl Ligase - 65 Mix vào tube phản ứng trộn thật kỹ pipette nhiều lần ủ 54°c 15 phút, tiếp tục ủ 98°c phút Giữ mẫu 4°c thực bước Có thể giữ sản phẩm 4°c tuần hay -20°c lâu Bước 4: Chuẩn bị PCR Buffer Mix thực phản ứng PCR Rã đông SALSA PCR Buffer trộn thật kỹ pipette nhiều lần Đánh dấu tube PCR 0,2 ml với ký hiệu ban đầu mẫu Chuẩn bị PCR Buffer Mix cho phản ứng: pi SALSA PCR Buffer + 26 pl nước cất lần Trộn vortex Cho 30 pl PCR Buffer Mix vào tube PCR 0,2 ml vừa chuẩn bị Cài đặt máy luân nhiệt 60°c giữ máy nhiệt độ Cho 10 pl sản phẩm phản ứng nối vừa thực bước vào tube PCR tương ứng chứa 30 pl PCR Buffer Mix Trộn thật kỹ pipette nhiều lần spin thật nhanh để đưa hỗn hợp sản phẩm nối PCR Buffer Mix xuống đáy tube Đặt tube vào máy PCR Giữ mẫu 60°c thực bước 49 Bước 5: Chuẩn bị Polymerase Mix Rã đông SALSA PCR Primer Mix, SALSA Enzyme Dilution Buffer trộn thật kỹ bang pipette nhiều lần Chuẩn bị Polymerase Mix cho phản ứng: pi SALSA PCR Primer Mix + pi SALSA Enzyme Dilution Buffer + 5,5 pi nước cất lần Trộn vortex Thêm vào phản ứng 0,5 pi SALSA Polymerase trộn tiếp pipette nhiều lần Máy luân nhiệt 60°c từ bước Thêm 10 pi Polymerase Mix vào tube máy luân nhiệt 60 °c Rồi trộn thật kỹ bang pipette nhiều lần Đậy nắp máy luân nhiệt cho chạy chu trình ln nhiệt phản ứng PCR • Phụ lục Cách tiến hành điện di phân tách đoạn MLPA hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 Chuẩn bị mẫu điện di đĩa mẫu: 32 pi Sample Loading Solution + 0,5 pi 60 - 600 size marker có đánh dấu huỳnh quang [Dl] + 2,5 pl sản phẩm PCR (0,7 - pl) + giọt dầu khoáng Mineral Oil Trộn thật kỹ bang pipette nhiều lần Chuẩn bị Genome Lab™ Separation Buffer đĩa Buffer: Cho Separation Buffer vào khoảng 2/3 giếng Cài đặt thông số cho phân tách đoạn Nhiệt độ mao quản: 50°c Biến tính: 90°c phút Thời gian bơm mẫu: 30 giây điện kv Thời gian phân tách: 60 phút điện 4,8 kv Vận hành hệ thống điện di mao quản CEQ™ 8000 Khởi động máy Lựa chọn Database Làm Wetting Tray (Wetting Tray khay có chứa nước cất lần dừng để ngâm đầu mao quản Gel sau bơm đầy hệ thống mao quản thường 50 thải Wetting Tray tạo cặn bẩn Trước lần vận hành, làm Wetting Tray thay nước để tránh cặn bẩn bám vào đầu mao quản) Lắp đặt gel Lắp mao quản Chuẩn bị mẫu đưa mẫu lên máy Chạy kiểm tra máy Purge Gel (Purge Gel làm thông phần tiếp xúc với mao quản, tránh bơm cục gel khơ hình thành máy lâu ngày không sử dụng trực tiếp vào mao quản Gel bơm từ ống gel qua phần tiếp xúc với mao quản vào lọ đựng chất thải mà bơm trực tiếp lên mao quản) Fill Capillary (Gel bơm lên mao quản Wetting Tray hay Buffer Plate tùy chọn) Optical Alignment (Kiểm tra đường hai chùm sáng laser có thẳng với tâm mao quản hay khơng) Monitor Baseline (Thông thường Baseline thường nhỏ 6000 Nếu cao hơn, tháo mao quản làm cửa sổ quang học giấy bụi) Đặt lệnh thí nghiệm Bắt đầu chạy mẫu tự động Bơm gel vào mao quản với áp suất khoảng 800 psi Điều chỉnh nhiệt độ mao quản đến nhiệt độ chạy mẫu Biến tính mẫu chạy khơng tải Dừng phút để hạ nhiệt độ mẫu Bơm lúc mẫu phân tích Phân tách mẫu Sau phân tách, hệ thống đẩy gel bình thải với áp suất 300 psi Thu thập lưu liệu thơ Phân tích xuất liệu 51 Phụ lục 10 Kết đối chứng xác định giới tính kỹ thuật NST đồ karyotype K n ) k >? H ) ì * ỉ ỉ u ì í i ti *>■> « $ ĩi ị 10 11 II >1 13 ỉ II ' iT 11 ii? II 14 (1 ¿ÍP >* ế A »1 46, XX ìf M V Casename - 3 Kết mẫu 336 lễ ì n n iỉ I ì 1 M « SI -»a K ặ 40 M íơ ti SI *nr II * A 20 11 w 46,XY Kết mẫu 336H 12 ồì Ub 15 K * 95 X V i Case name 09-336H 52 Phụ lục 11 Kết đối chứng xác định giới tính kỹ thuật FISH NST 18 NSTX \ F09 -910 46, XX Kết mẫu 910 NST 18 m — NST Y NST X _ NST 18 *# m F09 - 924 46, XY Kết mẫu 924 Phụ lục 12 Kết MLPA khảo sát đột biến gen DMD phần mềm Gene Marker 53 Ket cua Probemix P034 - A2, Báng I I I'.*i ■■'i iyin 5'inmii ■ PIJI ; Put* rw ¿o» ú ‘1 •O* M» ’¡7J gjri '1 y; VIi Cd taH «2/ &HJBH*T líffl :■ CWJjlJ ■»R3 E '0 W 'I JI OSK X ' rw ^ JW SELTír gj’liii ■i- Cw\úf~ K'il,:-3.¡l3i‘ § _ O ¡c*c>_wo* 1J?3 zzrunji 4i 1KE* *?T •f la* iüi MÍ ■» Wl IS-I i w.'iaí ! 15* KJ mui nwI^tj-áSu Mi JJ* 13 »«■ ioy XA i II rl WJI 3J OÍD 11 i.1 n n.'i JI USA* SÉiS' AIS ti óm~ IB lUb tlOH.'l X ¿Yiv TT~ Eiíisr iST t'IÚÚj.'l I.' üíđ ti iX-V J irmsTor uUE II ¡Wfc su »• 11 11! '1 11 i n S»í>25 ¿¡■A JÍTTSTOT i nú > >:* J jím Jü.ilii i Uü 71 111! ^iPIQJIiXf ¡>5* Ü (8*5CH +ji i ■SF^-amr SITt 25CS5•MTI J-ll Ül.'t a¡- IJh 3Si 7!Tr É Sin ÚS.'IU i ¿SE v4 S sriTHTUớr ĩ50 ôJ ihia n II.'I.x.' E*đ ESE^nJiớ a 21 n.ilaiií ¿tüL a 3T ® M MI sn n IU.'E xi ITt' > ¿¿•j!Wll Una TíTTHTrsr ■ TO* >2 SKÍarKvr TFiFTTTrar CMC ffMt.iKli ?+> h ■ HQiJIJI i ni i TđT TiFiüimr üTSff WJ TÍTftKi7í lí IK4 -f «■JWU «% 51 inm'i i i im ií wr-jKkj Tila uiunjiji un íf" ÍMIES! J ;;41 -Eiisajji «W Ti ÍWF-í»M 3F* SU W « 31 >T' ir ■jrmrrrr rrer Q n nfe WT r-í-* n*» El' W7l »' IW Ll V'¡M9 JIC »•i wiia? TW r BHVjrfl Ss * " ■■ WT- ms SSL !L laJ * IB ■> l»W mm k¿n.ojúa« i tówMiiit ■3 KIMAI AIJ BI a gwn KW 3RI fin i (W im Ü_«TI> l-JW 11> l-PI f-yüi ■ X4 OTO ■■31» ■ ■& _ 'ÍW nrs J_ p Á _ • BẮk "EJ" I4> ■ ni 7H3 11H ■ MI i IU IES Í2B TP3 liEM r Í24 1® 9'¿11 9'iMI US B mi 'IV'I 13fl ■ 1U B ffl* •• Bm B >M l’wí IW T mi -r m •m ■ t?? UW iw ■J'W MI C#íi im ■3ÚX' aon 00» TOS? op», ÍÜSL ■;Üt _ I 8S ¿«ü¿ fwSS^ n Ü«k MI Uttl I¡E1 - ¡3SS t 0n3 tm i í*l Til '*•» i J:1 Jdá san 1M rrntr r¡3F5 Ti®5 Wji _ ILWÍ ííó\ 10» sm 0» JÚM u35 -rm C3K -I5F! *!' o» a-üi ii» i i*ri OLOM nrr O’lí Slftl nv.1» 335 USB i ■:*;> ■iór isn JÚ ir» ici 'W >w iwr i iar '^Jí JWP i lio OTT TTPI i ¡W ' ' *■ W5 i s> ió.?9 * ■ ówi 3»^ n £® _ \J^32SU1H -!3J!.«í _ 07» Sfll! d OH?» OH-3 ora ¿ir* 113 ÍT7 Tk-í otn TT71 XJHL lis J si l ■= ¿tfj cin 1K 73a i iM 0*i» Í'8Í>3 L*J TEST— fUI-jOlMU ■3 K¿ J: j.%1; 91 u nwn.iôi đ otro Un Iii*cụ.ôeùl MKM ỹ lili 2R r n#* J ãil itä «15 isiiait» I3Ï7 f BE zd!_j Jg¿ yaciaiLii MP l«lỉ IR: 3I.-I raleari K*3 ! BflEjBB ms let-lií'té IBằ ô r-fci-1-H Mrc iR.iiTlicùr run 'LI lUJ.kf-j- -ãi/j IhitfUH u.'n Ql PHD -rT 3r*i ! IR 1*1 n.'cija 111 '.J iu -■ ĩ' III ia»'IUMlM 5SỴ CJ r*c ằ wa U ,1 tf 1ầ ?I iroô 41 r4f' ró¿B mi llilüJf» HIM '■’ỉ LktV.lL' isït ỴÏT(SÏÏỴỴ55 ỉiảat m [Mi -.,31 un ¡rompit«.ant Ịf lĩrL JU ruiia || >■>1 KMljXI Pi r BSE läi muivNiiin ifl fija T.r-S Ffa r til tna 'BỈ 51? 1W PW PfẳóM|A nsu.'im P* a SM tut# m -w XVỉOìliii uM isas I toi iB Ăôff 141 I JJH 5Pr1 I|r> 1258 13đ ID® iiiỉ 4.55 L5E _ 11^ >™ I7lt nr IB W» w* IBM UK IT* ill JORI 1SI OBJ» «rot IV uui his LLK un JW? Hrin L5g nnn II a** rue im LLL iJS 1K-.I Eta It® JKH L aij till JHu MÈ lH3 iSS IL’t n«y 11ÚI 1Ú 1Ü IÜS 1ÏT? rsa JSfc Ũ1TỈ TBH rwi Bf B it träl ỵir? n IBM 55S fü3 mi Ü’TỴ ■ orV sä oVr*1 rriö m: :■** S*P5 in rtư IHI rw IBM mr Viær rira rsrt TTm -% - c tv «S 'ÍÌTT 1W Ỉ un EhB IH m E .S ICđ 321f Iôm ë» an TBF* nwi> b¿n LM ÏÏÊÏ I ÚJÍ ÍJIH ras trs— TW nSsr“ S I I*TflJ L'B* IU uni S35f tẼĨ ỵŒi TEE ¿Ai 553 1H àüi BUE Tlỉ jjväv Tsa TES TEE ĨSĨ tỊSÍ TTỴ T^ỉ TEỈ Hñ usa Aï IBM dd LKH iTE i5*i - VĨS iva ỈM nn T5W Igi ¡n ürrr ET E L-W, » ! S4 wcS TT ewr^offHTÍc_i¿y » jsfcv wr «.-‘J KW£T»ái !ST»3Z 3h :iv ¡rj m _r ÜM WC *SS y HCrflT !il V » -fl ■x / « » U»L_é»K E¡M TíTTTW"^T3Í PrtíiT M-Jí-*» r*r T»(? [**■ >r>rp [ML JiitTS ís.ijyV IH * = ã5-S! ô.i Ei-ằ 3tớ II> T7ẽ-ằ y.-,- iú.-ili1" T T-r ¿t;u M.-ien I U1I t ■ ».■»-i IKJ Ei » I2ÍI JC: 11« 1»." 3i, MI ian TT333 -IÇ » fljriïi '1'TM JJ.ilBLÜLE .LJB 'ijtn-fji' ¿3SI iÍF- i i i-Kiü lú T£J?Ï£> TLLKI '7* »nn-i-i'ji ỴK** »¡'IfttliG' a«-i JI.'C «k IJt ‘ri IbJfc Ufe Ui :P< CH Sfr ? " Blft IMP Mil -H- r.l W (VJillr 1.1 >< _rï *fjp :>t C-’jl ?ür ỵ S J i k •i ■i VJ •il Tl "H TT 1! ï[ I! a H t 57 aa K JJ II 1T 1* iH H CE stfi Aiai J.1Ü 1C »»-H rfirÜBan JCX C.T ¡hỵ ¡PC +JZÍ >C fü» tir k ÏTTỴ\>< ■K r¡íT >n r ■ r TTằ iTTT iTi'ia X ô -51 Hợ ISLT >-c I 'I TTJMT" IM* -vc ifiini (il* 7?i l ci »'ram ntj ợf.imi-PM a va ựsilEl> WIVK TC ù;i i iÊẻ5ợÊ Tu? itíi rjiđi ri mn -!iuwi-ni ÚM s*i i tm-in □ a van vi iO:*', fliv- Icm iï5 ■i/‘YV -JH WnJW ! EJ* 111 Cl m cv 1« ».irirtioi ma lien i!iiyiùj.ằjti picô ằi&BiiMK o -a* ẻPiiợ.-.n? i^J J7i*W i7W ' JW auitivi :-3 ci UBÜ SiđHivin •HUI ii iiiarnia al? Ji «0?* '"'ÏW 31«S»MH Pt» Il »iíS'úíú *Ơl lỹaAi'iui ùùiS :HO#*.PK 9T2 ã-Sợù liợ.'iili? TH* 1M4I ^TiTTO" J1 I I EUi rJC1 uni H ' O S3-''O H PỵN iJi i TúniCC: TH1 üi'oiri'ilm Tea tTỵ7ï*TïrTrr" Tma jTT K J* r*r ằằr: rô! ằrt F ãa ¡1 EH PEd lu^m -rra im • Hï T*T X?TỴ i >>:■ !J ELU 3H an ifln fl»' >3«0 IN i ns J W-' aE /ỵl" il-.U !ỵw T51H wfS IBP •JM ùiU B.»H il Hlk SKI Tn^> 751T7 psiằ |iilằ Pô5 _ -fl ô8 [lùil itil'l l>njô 9ẻE5 ~CKS ÜlIt'ilPP.1 üi'i rtiTief 9TTS WSE TB ~Z*a - T9B - p ô' ùỗsrama SIMPII UHi TT i Lian «ni B? 9nu?aDDn ¿-a -a SoHwS^r-fc ’ U» TU ppûiinMi UHri i n: Tir- i.tit JP» ítfj T T* JOC* lire OifX Jl'A s? 3PT «t apu TB U*.1 TWI TÜS â«i 7«H iiS JM "rai jô Tợù! Rợù TfW 50ằ i i!i* an ma TW y™ T7ST i ¡ai TO®! TTTI ~7Wt m r ? ' m -ri b? t raj ¿.i iwrts flïTS :i-t »s «J fl jd' i' fen&fc MV ' n in i™ rûS T5 «■; «■ nu CEB ïTSS 'V * ! '■» i era ■ pp IM PU ỵ(* tu i rriB lit» pTTO ÇWI iïïi i.tim ụT? rfls iïS l WJ EU SM rm iw UÍ.J ïRi ras TB3 nsa nu I nr* 51BI rra fl HT 'ô '7* TSủ ỷợv i lia inln TKT TT?P nsa ras i ỴB TTf? ÏÜS rsa rtr TTW TT?" 3dô Hợ1 i ma 5>:4 'ô? WJ aôô* 53s:>* fla>4 Ăđssr TSS 59ô 4M (SM i AA* OW ựuj DMS n® ros !>< lü3T HT :W; i.JC iki ^SíSfííSír m E li.'jLy I dm ¿: ni V.r* UIP ïil'OSOlPỴC ÏÏT3 TiSS Tiii Kraw TTBl -7*;ïf m Tr» ïr,J i.1 usr.-uia üm OBII IIICISIIJCô Tớđ ips -fllfliiflCa ill _ _±üj_ _ KP rn *1 wj r» 1« i lin CUB TiB jpjc ríos ËJÏS iàs_ : ir- riü-ia I® - i V.i ' SM t Sa *0 ru- 'V i “» nrr >r i.r* *HTT «¡.ÍÍV Ùfc TiJT Mb 0*.r niT* Ăras fợFẻ5