Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái M CL C DANH M C T VI T T T DANH M C B NG BI U DANH M C HÌNH VẼ M Đ U ………………………………………………………………… Ch ng - T NG QUAN ……………………………………………… 1.1 Giới thi u chung v sulfamit (SAs), metronidazole (MTD)……… 1.1.1 Cấu trúc phân tử ………………………………………………… 1.1.2 Tính chất vật lý hoá học c a Sulfamit, Metronidazole ………… 1.1.3 Tính chất dược lý phổ tác dụng c a Sulfamit, Metronidazole 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng khuẩn c a Sulfamit, Metronidazole 1.1.5 Một số chế phẩm c a Sulfamit tiêu biểu ……… ……………… 1.2 Ph ng pháp xác định……………………………………………… 1.2.1 Một số công trình nghiên c u xác định Sas phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………………… 1.2.2 Một số công trình nghiên c u xác định Metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………… 1.2.3 Một số công trình nghiên c u xác định đồng th i sulfamit metronidazole phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC ……… Ch ng - Đ I T 2.1 Đ it NG VÀ PH NG PHÁP NGHIểN C U …… ng, m c tiêu vƠ nhi m v nghiên c u………………… 2.1.1 Đối tượng mục tiêu nghiên c u ………………………………… 2.1.2 Nhiệm vụ nghiên c u …………………………………………… 2.2 Ph ng pháp nghiên c u………………………………………… 2.2.1 Nguyên tắc chung trang bị c a phương pháp HPLC …… Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ 2.2.2 Bùi Minh Thái Phân tích định lượng HPLC ………………………… 2.3 Giới thi u chung v ph ng pháp chi t pha r n ….………… 2.4 Hóa ch t d ng c …………………………………………… 2.4.1 Hoá chất ………………………………………………… 2.4.2 Dụng cụ ……………………………………………………… Ch ng - K T QU VÀ TH O LU N ……………………………… 3.1 Kh o sát u ki n s c ký ……………………………………… 3.1.1 Chọn bước sóng c a detector …………………………………… 3.1.2 Thăm dò kh tách c a Sulfamit cột RP-C18 ……… 3.2 Chọn pha tĩnh …………………………………………………… 3.3 T i u hóa pha động ………………………………………………… 3.3.1 Nồng độ đệm axetat c a pha động ……………………………… 3.3.2 Độ pH cho dung dịch đệm axetat ………………………………… 3.3.3 Tỉ lệ thành phần pha động ……………………………………… 3.3.4 Tốc độ pha động 3.4 Đánh giá ph ng pháp phân tích ………………………………… 3.4.1 Kh o sát lập đư ng chuẩn kho ng nồng độ 0,05 – 1,000ppm 3.4.2 Giới h n phát (LOD); Giới h n định lượng (LOQ) 3.4.3 Độ đúng, độ lặp l i c a phép đo ………………………………… 3.5 M u thực, quy trình xử lý vƠ k t qu phơn tích ………………… 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu, xác định hiệu suất thu hồi ………………… 3.5.2 Phân tích mẫu thực ……………………………………………………… K T LU N ……………………………………………………………… TÀI LI U THAM KH O Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái DANH M C T STT Footer Page of 148 VI T T T Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrin Axetonitrin Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn BNNPTNT CV Coeficient Variation Hệ số biến thiên HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao RP Reversed phase Hấp phụ pha đ o LOD Limit of Detection Giới h n phát LOQ Limit of Quantity Giới h n định lượng Thông tư TT UV - Vis Untraviolet - Visibet Tử ngo i – Kh kiến Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái DANH M C B NG BI U B ng 3.1: Diện tích c a pic phụ thuộc vào bước sóng detector………………… 25 B ng 3.2: Th i gian lưu th tự pic c a chất phân tích……………… 27 B ng 3.3: Sự phụ thuộc k’ vào nồng độ đệm axetat c a pha động…………… 29 B ng 3.4: Hệ số dung tích giá trị pH khác nhau………………………… 31 B ng 3.5: Hệ số dung tích phụ thuộc vào %ACN pha động…………… 33-34 B ng 3.6: Diện tích pic c a chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động 36 B ng 3.7: Diện tích pic sắc ký phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích……… 38-39 B ng 3.8: B ng giá trị Ftính c a chất phân tích 42 B ng 3.9: LOD, LOQ tính theo phương trình hồi quy 43 B ng 3.10: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 B ng 3.11: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 B ng 3.12: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,8ppm) 47-48 B ng 3.13: Chiều cao píc sắc ký mẫu tôm nồng độ thêm chuẩn khác 50 B ng 3.14: Kết qu xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích……………… 51 B ng 3.15: Kết qu phân tích chất mẫu tôm r o…………………… 52 B ng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm r o………………… 53 B ng 3.17: Kết qu phân tích chất mẫu tôm chân trắng…………… 54 B ng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm chân trắng……………… 54 B ng 3.19: Kết qu phân tích chất mẫu tôm sú…………………… 55 B ng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm sú…………………… 55 Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái B ng 3.21: Kết qu phân tích chất mẫu tôm lớt…………………… 56 B ng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm lớt……………………… 57 Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái DANH M C HÌNH VẼ Hình 1.1: Sơ đồ chuyển hoá axít folic thành nucle protein………………… Hình 2.1: Sơ đồ khối hệ thống HPLC đầy đ ……………………………… 19 Hình 3.1: Phổ hấp thụ vùng tử ngo i kh kiến c a Sas…………… 23-24 Hình 3.2: Diện tích c a pic phụ thuộc vào bước sóng detector……………… 25 Hình 3.3: Th i gian lưu c a sulfamit…………………………………… 26-27 Hình 3.4: Sự phụ thuộc c a k’ vào nồng độ đệm axetat pha động…… 29 Hình 3.5: Píc sắc ký giá trị nồng độ đệm khác 29-30 Hình 3.6: Sự phụ thuộc c a K’ vào pH c a pha động 31 Hình 3.7: Sắc đồ sắc ký pH khác 32 Hình 3.8: Sự phụ thuộc k’ vào tỉ lệ % ACN pha động 34 Hình 3.9: Sắc đồ píc sắc ký t i tỉ lệ thành phần pha động khác 34-35 Hình 3.10: Sự phụ thuộc diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động 36 Hình 3.11: Sắc đồ tốc độ khác c a pha động 37 Hình 3.12: Đư ng chuẩn c a chất phân tích kho ng nồng độ 0,05-1,00ppm… 39-40 Hình 3.13: Sắc đồ c a chất phân tích nồng độ khác t i bước sóng 270nm… 40 Hình 3.14: Sắc đồ c a chất phân tích nồng độ khác t i bước sóng 320nm… 41 Hình 3.15: Sắc đồ c a chất phân tích với nồng độ 0,01ppm………………… 43 Hình 3.16: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,08ppm … 45 Hình 3.17: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,4ppm …… 47 Hình 3.18: Sắc đồ chất phân tích sau lần bơm mẫu nồng độ 0,8ppm …… 48 Hình 3.19: Sơ đồ xử lý mẫu Tôm 49 Hình 3.20: Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm 50 Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Hình 3.21: Đư ng chuẩn SGU mẫu tôm r o phân tích thêm chuẩn… 53 Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm r o……… 53 Hình 3.23: Đư ng chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng phân tích thêm chuẩn 54 Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng 54 Hình 3.25: Đư ng chuẩn c a SGU, SMP mẫu tôm sú phân tích thêm chuẩn 55 Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú……… 56 Hình 3.27: Đư ng chuẩn SGU mẫu tôm lớt phân tích thêm chuẩn… 57 Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt…………… 57 Footer Page of 148 Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái M Đ U Dư lượng kháng sinh thực phẩm vấn đề quan ng i c a hầu hết quan kiểm soát thực phẩm giới Một số lo i kháng sinh thông thư ng (chloramphenicol, malachite green, metronidazole…) b n thân gây tác động có h i cho s c khoẻ ngư i tiêu dùng, số lo i khác kháng sinh nhóm nitrofurans qua trình trao đổi chất thể động vật sinh hợp chất có độc tính cao thể sống Họ thuốc kháng khuẩn Sulfamit (SAs) nhóm kháng khuẩn có ho t phổ rộng, sử dụng nhiều trong nuôi trồng, chế biến nông th y s n, v.v Việc sử dụng chất cách tùy tiện dẫn đến tồn dư lượng lớn giới h n cho phép thể động vật Khi ngư i tiêu dùng sử dụng thực phẩm có dư lượng lớn sulfamit hay chất kháng sinh th i gian dài gây lo t ph n ng rối lo n đư ng tiết niệu, rối lo n t o máu, rối lo n chuyển hóa porphyrin Cho nên việc xác định xác lượng sulfamit, chất kháng sinh th c ăn chăn nuôi lượng tồn dư s n phẩm từ động vật quan trọng Dựa thực tế đó, luận văn này, tiến hành nghiên c u điều kiện tách xác định đồng th i chất kháng sinh metronidazole sulfamit sulfaguanidine, sulfamethoxazone, sulfamethoxypiridazine, sulfadoxin phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector UV – Vis, phương pháp có độ chọn lọc, độ nh y tốt trang bị nghiệm c a nước ta, có tính kh thi ng dụng vào thực tế cao Footer Page of 148 nhiều s kiểm Header Page of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Ch ng - T NG QUAN 1.2 Giới thi u chung v sulfamit (SAs), metronidazole(MTD) 1.1.1 C u trúc phân tử [3,6] Họ SAs có cấu trúc phân tử tổng quát: R2 N SO NH R1 Khi thay nhóm R1, R2 gốc khác nhau, có SAs khác nhau.Vì có c họ SAs Khi R2 = H sulfamit có ho t tính kháng khuẩn Khi R2 # H, chất tiền thuốc R1 m ch thẳng, dị vòng Tuy nhiên R1 dị vòng hiệu lực kháng khuẩn m nh hơn, thông thư ng dị vòng 2-3 dị tố Cấu trúc Metronidazole(MTD): Là thuốc kháng sinh thuộc họ nitroimidazole sử dụng đặc biệt vi khuẩn kỵ khí động vật nguyên sinh MTD thành phần có mặt th c ăn chăn nuôi, thuốc kháng sinh nuôi trồng th y s n (với tên thương m i Enro DC) 1.1.3 Tính ch t v t lý hoá học c a Sulfamit, Metronidazole [3] 1.1.2.1 Tính chất vật lý SAs d ng tinh thể màu trắng vàng nh t, không mùi, thư ng tan nước, tan dung dịch axít, tan dung dịch kiềm (trừ sulfagu-anidin) Footer Page of 148 Header Page 10 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái MTD tinh thể bột kết tinh, vàng, không mùi, bền không khí, sẫm màu dần tiếp xúc với ánh sáng Nóng ch y kho ng 159oC – 163oC Metronidazol khó tan nước, aceton 1.1.2.2 Tính chất hoá học - SAs có tính chất lưỡng tính:  Có tính kiềm có nhóm amin thơm tự do, nên tan dung dịch axít Ví dụ: cho kết t a muối picrat dung dịch HCl loãng N-amit linh động, nên dễ tan dung  Có tính axít có nguyên tử H dịch kiềm t o muối natri tan để pha thuốc tiêm (trừ Sulfaguanidin): R H2N SO2 R N H2 N H H 2N SO2 SO2 N N H R Na - SAs t o muối ph c kết t a với ion Ag+, t o ph c màu kết t a với ion Cu2+, Co2+, … nhóm amin bậc c a SAs có đôi điện tử tự do, giúp SAs thực ph n - ng t o ph c chuyển điện tích với phenosafranine (PSF) cho ph c màu tím có bước sóng hấp thụ cực đ i 270-273 nm - Nhóm amin thơm tự cho ph n ng diazo hoá, ngưng tụ với n phẩm azoic màu đỏ cam hấp thụ bước sóng 460nm Ar-NH2 + NaNO2 + 2HCl = [Ar-N+ ≡N]Cl- + NaCl + 2H2O Muối diazoni đây, Ar – thành phần -C6H5-SO2NH-R1 c a phân tử SAs Nh mà việc định lượng SAs theo hai phương pháp diễn dễ dàng Footer Page 10 of 148 10 Header Page 57 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Các kết qu nghiên c u trình bày hình 3.20, b ng 3.13 b ng 3.14: 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 4/8.956 5/9.743 3/6.149 1.0 2/4.201 1.0 1/3.493 mV 6.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.460 mV 6.0 Detector A Ch1:270nm 0.0 0.0 0.0 2.5 5.0 7.5 0.0 2.5 5.0 (a) 7.5 10.0 (b) Hình 3.20 Sắc đồ hiệu suất thu hồi theo quy trình xử lý mẫu tôm (a) chưa thêm chuẩn, (b) thêm chuẩn (trong đó: (1) SGU; (2) MTD; (3) SMP ;(4)SDO; (5) SMX) Bảng 3.13: Diện tích pic sắc ký mẫu tôm nồng độ thêm chuẩn khác Ct(ppm) 0,2 0,4 SGU 9610 30104 51859 MTD 24056 43824 SMP 25742 50795 SDO 23144 49734 SMX 21975 48753 S pic(mm) Từ kết qu trên, hiệu suất thu hồi chất b ng 3.13 Hiệu suất thu hồi xác định sau: H = (Cx/Ct)* 100% Footer Page 57 of 148 57 nồng độ Header Page 58 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Trong đó: Ct - lượng chất biết trước thêm vào Cx - lượng chất xác định phương pháp thêm Với Cx  (S x  So )  A B Sx – Diện tích pic thêm lượng Cx vào mẫu So – Diện tích pic thêm c a mẫu chưa thêm chất phân tích A, B - hệ số phương trình đư ng chuẩn c a chất phân tích Bảng 3.14: Kết xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích Các Sas SGU MTD SMP SDO SMX Ct (ppm) Cx(ppm) H% 0,200 0,165 82,50 0,400 0,200 0,400 0,349 0,151 0,31 87,3 75,5 77,7 0,200 0,167 83,5 0,400 0,361 90,3 0,200 0,146 72,9 0,400 0,343 85,8 0,200 0,142 71,0 0,400 0,352 88,1 Như kho ng nồng độ 0,2 – 0,4ppm, hiệu suất thu hồi metronidazole chất kháng khuẩn SAs đ t từ 71 – 90 %, hiệu suất thu hồi đ t yêu cầu 3.5.2 Phân tích m u thực Các mẫu tôm (bỏ đầu, vỏ, chân, đuôi) lấy phần thịt, sau đông khô xử lý theo sơ đồ 3.19 Sau dung dịch cuối tiến hành phân tích theo phương pháp thêm chuẩn Xây dựng đồ thị biểu diễn diện tích pic theo nồng độ chất thêm  Nồng độ chất phân tích mẫu Cx tính theo công th c: Cx = A/B (với A, B - hệ số phương trình hồi quy c a đồ thị thêm chuẩn) Footer Page 58 of 148 58 Header Page 59 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái  Kho ng tin cậy c a nồng độ chất phân tích mẫu là: S S Sx  ( a )2  ( b )2 Cx a b Trong đó: Cx : Nồng độ chất phân tích có dung dịch bơm vào cột tách a,b hệ số phương trình hồi qui Sa, Sb : sai số c a hệ số phương trình hồi qui Sx sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn Khối lượng chất phân tích có a(g) mẫu cân đông khô ban đầu : mcpt = V*Cx*F*10-3(mg) Trong mcpt : Khối lượng chất phân tích a (g) mẫu (mg) V : Thể tích dung dịch pha từ a(g) (ml) F : Hệ số pha loãng Cx : Nồng độ c a chất phân tích xác định từ phương trình hồi quy 10-3 : Hế số chuyển từ µg sang mg 3.5.2.1 Mẫu tôm rảo Khối lượng mẫu thịt tôm tươi : 142,8g Khối lượng mẫu sau đông khô : 32,9g Lượng nước có mẫu : 77% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp l i ba lần lấy giá trị trung bình Kết qu phân tích sau: Bảng 3.15: Kết phân tích chất mẫu tôm rảo Chất phân tích SGU Footer Page 59 of 148 Mẫu tôm R o 22151 Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 45766 75734 59 Header Page 60 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Ta có phương trình hồi quy: 80000 Spic(mAu.s) 70000 60000 50000 40000 Y=A+B*X He so Gia tri Sai so -A 21092.16667 2367.62331 B 267915 18339.5313 30000 20000 R SD N P -0.99767 2593.60139 0.04351 10000 -0,15 -0,10 0,00 -0,05 0,05 0,10 0,15 0,20 CSGU(ppm) Hình 3.21: Đường chuẩn SGU mẫu tôm rảo phân tích thêm chuẩn Bảng 3.16: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm rảo Chất phân tích CSAs từ đư ng chuẩn (ppm) Hàm lượng chất mẫu đông khô (ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi (ppm) SGU 0,079 ± 0,010 0,53 ± 0,07 0,12 ± 0,02 mV 7.0 Detector A Ch1:270nm mV 7.0 Detector A Ch1:270nm 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 3.0 3.0 mV Detector A Ch1:270nm 7.0 1/3.407 6.0 4.0 3.0 1/3.441 2.0 1/3.363 5.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Mẫu chưa thêm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.22: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU mẫu tôm rảo 3.5.2.2 Mẫu tôm chân trắng Khối lượng mẫu thịt tươi : 150,1g Khối lượng mẫu sau đông khô : 30,5g Lượng nước có mẫu Footer Page 60 of 148 :79,7% 60 4.0 Header Page 61 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Bảng 3.17: Kết phân tích chất mẫu tôm chân trắng Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích Mẫu tôm Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm chân trắng 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 30407 59365 74137 SGU Ta có phương trình hồi quy: 90000 6000 Spic(mAu.s) 80000 5000 70000 4000 60000 50000 3000 40000 Y=A+B*X 20000 10000 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 2000 He so Gia tri Sai so -A 31104.66667 1560.03009 B 268650 12083.94113 30000 0.00 1000 R SD N P -0.99899 1708.92734 0.02862 0.05 0.10 0.15 0.20 0.0 CSGU(ppm) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Hình 3.23: Đường chuẩn SGU mẫu Hình 3.24: Sắc đồ pic sắc ký thêm tôm chân trắng phân tích thêm chuẩn chuẩn SGU mẫu tôm chân trắng Bảng 3.18: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm chân trắng Chất phân tích CSAs từ đư ng chuẩn (ppm) SGU 0,115 ± 0,008 Hàm lượng chất Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) mẫu tươi(ppm) 3.5.2.3 Mẫu tôm Sú Khối lượng mẫu thịt tôm tươi 0,77 ± 0,05 0,16 ± 0,01 : 123,6g Khối lượng mẫu sau đông khô: 37,4g Lượng nước có mẫu : 69,7% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp l i ba lần lấy giá trị trung bình Kết qu phân tích sau: Footer Page 61 of 148 61 Header Page 62 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Bảng 3.19: Kết phân tích chất mẫu tôm sú Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm chất phân tích 0,2ppm chất phân tích 18451 30532 45849 7010 20175 35745 tích Mẫu tôm sú SGU SMP Ta có phương trình hồi quy: 40000 50000 45000 Spic(mAu.s) 35000 40000 Spic(mAu.s) 30000 35000 25000 30000 20000 25000 Y=A+B*X 20000 15000 10000 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 C (ppm) He so Gia tri Sai so -A 6609.16667 896.29058 B 143675 6942.63699 10000 R SD N P -0.99768 1321.09147 0.04334 5000 -0,20 Y=A+B*X 15000 He so Gia tri Sai so -A 17911.66667 1205.986 B 136990 9341.52736 5000 -0.10 -0.05 0.00 R SD N P -0.99883 981.83714 0.03074 0.05 0.10 0.15 0.20 SGU CSMP(ppm) Hình 3.25: Đường chuẩn SGU, SMP mẫu tôm sú phân tích thêm chuẩn Bảng 3.20: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm sú Chất phân CSAs từ đư ng Hàm lượng chất Hàm lượng chất tích chuẩn (ppm) mẫu đông khô (ppm) mẫu tươi (ppm) SGU 0,130 ± 0,012 0,87 ± 0,08 0,26 ± 0,02 SMP 0,046 ± 0,007 0,30 ± 0,04 Footer Page 62 of 148 62 0,09 ± 0,01 Header Page 63 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái mV 5.0 Detector A Ch1:270nm mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 1/3.308 1/3.358 3.0 2.0 1.0 2/4.476 1.0 2/4.675 2.0 2/4.877 2.0 1/3.340 mV 5.0 Detector A Ch1:270nm 1.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú 3.5.2.4 Mẫu tôm lớt Khối lượng mẫu tôm tươi : 132,5g Khối lượng mẫu sau đông khô: 28,4g Lượng nước có mẫu : 78,6% Với mẫu xử lý ba lần, phân tích lặp l i ba lần lấy giá trị trung bình Kết qu phân tích sau: Bảng 3.21: Kết phân tích chất mẫu tôm lớt Diện tích píc sắc ký (mAu.s) Chất phân tích SGU Mẫu tôm lớt Mẫu thêm chuẩn Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm 0,1ppm chất phân tích chất phân tích 26845 40548 Ta có phương trình hồi quy: Footer Page 63 of 148 63 60849 Header Page 64 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái 65000 60000 Spic(mAu.s) 55000 50000 45000 40000 35000 30000 Y=A+B*X 25000 He so Gia tri Sai so -A 25745.3333 2458.929 B 170020 19046.78538 20000 15000 10000 R SD N P -0.99883 2693.62222 0.07102 5000 -0,20 -0,15 -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20C SGU (ppm) Hình 3.27: Đường chuẩn SGU mẫu tôm lớt phân tích thêm chuẩn Bảng 3.22: Hàm lượng chất phân tích mẫu tôm lớt Chất phân CSAs từ đư ng tích chuẩn (ppm) SGU 0,151 ± 0,022 Hàm lượng chất mẫu đông khô(ppm) Hàm lượng chất mẫu tươi(ppm) 1,00 ± 0,15 0,21 ± 0,03 9.0 9.0 9.0 8.0 8.0 8.0 7.0 7.0 7.0 6.0 6.0 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 4.0 3.0 3.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0 3.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 Mẫu chưa thêm 0.0 1.0 2.0 3.0 1/3.485 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.395 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 1/3.427 mV 10.0 Detector A Ch1:270nm 5.0 4.0 5.0 Mẫu thêm chuẩn 0,1ppm 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 64 Mẫu thêm chuẩn 0,2ppm Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU tôm lớt Footer Page 64 of 148 4.0 Header Page 65 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Nhận xét: Với kết qu xác định cho thấy mẫu tôm xuất chất dư lượng kháng khuẩn SGU Với giới h n dư lượng sulfamit thịt th y s n cho phép 0,1ppm( theo thông tư số:29/2010/TT-BNNPTNT) mẫu tôm mà phân tích vượt m c giới h n Với mẫu tôm sú, tôm lớt dư lượng gấp lần lượng cho phép Không phát thấy MTD, SMX, SDO, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm Footer Page 65 of 148 65 Header Page 66 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái K T LU N Trên s nghiên c u điều kiện thực nghiệm, nhằm ng dụng kỹ thuật phân tích HPLC – UV-Vis để tách, xác định đồng th i metronidazole số sulfamit (SGU, SMP, SDO, SMX) số lo i tôm, thu số kết qu sau đây: Đã chọn điều kiện tối ưu cho trình sắc ký:  Cột tách RP - C18: 25 cm × 4,6 mm; m  Detector UV-VIS: kênh = 270 nm; =320nm.Rise time = 0,1 s; Range = 0,01 AUFS  Máy ghi: tốc độ giấy = mm/phút; ghi = 10 mV  Thành phần pha động: dung dịch đệm axetat (pH = 4,5) 10mM /acetonitril: 80/20 (v/v)  Tốc độ pha động: ml/phút Đã đánh giá phương pháp phân tích:  Kho ng tuyến tính c a sulfamit: 0,05 – 1,00ppm  Giới h n phát hiện: 0,012 – 0,029 ppm  Giới h n định lượng: 0,040 - 0,096 ppm  Hệ số biến thiên: 0,2% – 5% kho ng nồng độ 0,08- 0,8ppm Kh o sát mẫu thực  Chọn quy trình xử lý mẫu thích hợp, hiệu suất thu hồi chất phân tích mẫu tôm đ t từ 71 -90%  Xác định dư lượng SGU mẫu tôm chân trắng: 0,16 ± 0,01ppm, tôm lớt: 0,21±0,03ppm, tôm r o:0,12±0,02ppm, tôm sú :0,26±0,02ppm, dư lượng SMP tôm sú 0,09 ± 0,01ppm Footer Page 66 of 148 66 Header Page 67 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái  Không phát thấy MTD, SDO, SMX, SMP( trừ tôm sú) mẫu tôm Từ kết qu thu được, thấy phương pháp HPLC – Detector UVVis có độ nh y cao, thích hợp cho phân tích đồng th i metronidazole chất kháng khuẩn SGU, SMP, SDO SMX tôm Chúng hy vọng nghiên c u góp phần vào việc ng dụng kỹ thuật HPLC – UV-Vis nói riêng kỹ thuật HPLC nói chung để xác định metronidazole hợp chất thuộc họ sulfamit thực phẩm, nhằm phục vụ đắc lực cho ngành khoa học đặc biệt lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm, giúp b o vệ s c khoẻ cho ngư i Footer Page 67 of 148 67 Header Page 68 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái TÀI LI U THAM KH O Ti ng vi t Chu Đình Bính, Ph m Luận, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Phương Thanh (2007), “Xác định dư lượng chất kháng khuẩn họ sulfamit thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 45(1B), tr 33 – 41 Nguyễn Thị Kim Dung (2004), Xác định sulfonamide thuốc phương pháp hấp thụ nguyên tử, Luận văn Th c sĩ khoa học, Đ i học Quốc gia Hà Nội Trần Đ c Hậu, Nguyễn Đình Hiển, Thái Duy Thìn, Huỳnh Kim Thoa, Nguyễn Văn Thục (2006), Hoá dược tập 2, Bộ môn hoá dược, Đ i học Dược, Hà Nội Nguyễn Thị Phương Linh (2006), Xác định gián tiếp hàm lượng sulfamethoxazole thuốc phép đo F-AAS, Luận văn th c sĩ khoa học, Đ i học Quốc gia Hà Nội Ph m Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu nâng cao, Đ i học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2007), Nghiên cứu tách xác định đồng thời số sulfamit thức ăn chăn nuôi thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC), Luận văn th c sĩ khoa học, Đ i học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần T Hiếu, Từ Vọng Nghi(2003), Hóa học phân tích- Phần 2(Các phương pháp phân tích công cụ), Đ i học Quốc Gia Hà Nội T Thị Th o (2005), Thống kê hoá phân tích, Đ i học Quốc gia Hà Nội Tiêu chuẩn ngành (2004), Sulfonamit sản phẩm thuỷ sản-Phương pháp định lượng sắc ký lỏng hiệu cao, 28 TCN 196:2004 10 Vũ Cẩm Tú (2009), Xác định sulfamit mẫu Dược phẩm thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao(HPLC), Khóa luận tốt nghiệp, Đ i học Khoa học Tự nhiên Footer Page 68 of 148 68 Header Page 69 of 148 Luận văn Thạc sĩ Bùi Minh Thái Ti ng Anh 11 A V Pereira, Q B Cass(2005), “High- performance liquid chromatography method for the simultaneous determination of sulfamethoxazole and trimethoprim in bovine milk using an on-line clean-up column”, Journal of chromatography B, 826, pp 139- 146 12 Cheong, C.K., Hajeb, P.Jinap, S and Ismail-Fitry, M.R(2010), “Sulfonamides determination in chicken meat products from Malaysia’’, International Food Research Journal,17, pp 885-892 13 Craig D.C Salisbury, Jason C Sweet, Roger Munro(2004), “ Determination of sulfonamide residues in the Tissues of food animals using automated precolumn derivatization and liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of AOAC international, 87( 5), pp.1264-1268 14 D.G Kennedy, R.J.McCracken, A.Cannavan, S.A.Hewitt (1998),“Use of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of residues of antibiotics on meat and milk” Journal of chromatography A, 812, pp.77-98 15 Gertraud Suhren and W Heeschen(1993) “Detection of eight sulphonamides and dapsone in milk by a liquid chromatographic method”, Analytica Chimica Acta, 275, pp 329-333 16 Hadir M Maher, Rasha M Youssef, Riad H Khalil and Sabry M ElBahr(2008), “ Simultaneous multiresidue determination of metronidazole and spiramycin in fish muscle using high performance liquid chromatography with UV detection ’’, Journal of Chromatography B, 876(2), pp.175-181 17 Han-Wen Sun, Feng-Chi Wang and Lian-Feng Ai(2007), “ Simultaneous determination of seven nitroimidazole residues in meat by using HPLC-UV detection with solid-phase extraction”, Journal of Chromatography B, 857(2), pp 296-300 18 Ivan Pecorelli, Rita Bibi, Laura Fioroni, Roberta Galarini (2004) ,“Validation of a confirmatory method for the determination of sulphonamides in muscle according to the European Union regulation 2002/657/EC”, Journal of chromatography A, 1032(1-2),pp 23-29 Footer Page 69 of 148 69 Header Page 70 of 148 Luận văn Thạc sĩ 19 Bùi Minh Thái M Brandtner, W Hela, R Widek, R Suhuh (2003), “Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC-DAD for detection”, Food Chemistry, 83, pp 601-608 20 Naser Tavakoli, Jaleh Varshosaz, Farid Dorkoosh and Mohammad R Zargarzadeh (2007), “Development and validation of a simple HPLC method for simultaneous in vitro determination of amoxicillin and metronidazole at single wavelength’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(1), pp.325- 329 21 Naoto Furusawa(2000), “Simplified determining procedure for routine residue monitoring of sulphamethazine and sulphadimethoxine in milk” Journal of chromatography A, 898, pp.185 – 191 22 PVinas, C.Lopez Erroz,N.Campillo, M.Hernandez(1996), “ Determination of sulphonamides in foods by liquid chromatography with postcolumn fluorescence derivatization”, Journal of Chromatography A, 726(1-2), pp.125-131 23 Qiong-Hui Zou, Xiang-Feng Wang,Yuan Liu, Jin Wang, Jia Song, Hui Gao, Jie Han(2007), “ Determination of sulphonamides in animal tissues by high performance liquid chromatography with pre-column derivatization of 9fluorenylmethyl chloroformate”, Journal of Separation Science ,30(16), pp 2647–2655 24 Richard Lindberg, Per-Åke Jarnheimer, Björn Olsen, Magnus Johansson and Mats Tysklind (2004), “Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards”, Chemosphere, 57(10) ,pp.1479 -1488 25 Rodrigo H.M.M Granja, Alfredo M Montes Niño, Fernanda Rabone and Alessandro Gonzalez Salerno(2008), “A reliable high-performance liquid chromatograph with ultraviolet detection for the determination of sulfonamides in honey” , Analytica Chimica Acta , 613(1), pp 116-119 26 Ticiano Gomes Nascimento, Eduardo de Jesus Oliveira and Rui Oliveira Macêdo(2005),’’ Footer Page 70 of 148 Simultaneous determination 70 of ranitidine and Header Page 71 of 148 Luận văn Thạc sĩ metronidazole Bùi Minh Thái in human plasma using high performance liquid chromatography with diode array detection’’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 37( 4), pp 777-783 27 Theresa A Gehring, Bill Griffinb, Rod Williams , Charles Geiseker ,Larry G Rushing , Paul H Siitonen(2006), “ Multiresidue determination of sulfonamides in edible catfish, shrimp and salmon tissues by highperformance liquid chromatography with postcolumn derivatization and fluorescence detection”, Journal of Chromatography B, 840,pp.132–138 28 W.M.A Niessen(1998), “Analysis of antibiotics by liquid chromatography – mass spectrometry” Journal of chromatography A, 812, pp 53 – 75 29 W Hela, , M Brandtner, R Widek and R Schuh(2003), “ Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC–DAD for detection”, Food Chemistry,83(4), pp.601-608 30 Xiaojia Huang, Dongxing Yuan, Benli Huang (2007) ,“Simple and rapid determination of sulfonamides in milk using Ether- type column liquid chromatography”, Talanta ,72 ,pp.1298 -1301 31 Wang P, Li J, Zheng H.(2007), ắ Simultaneous determination of seven sulfonamides and metronidazole and chloramphenicol in cosmetics by high performance liquid chromatography’’, Chineses journal of chromatography, 25(5), pp.743-746 Wikipedia, “the free encyclopedia (2005), sulfonamide (medicine)” 32 Http://en.wikipedia.org/wiki/Sulfonamide (medicin) 33 Http://www.uptodate.com/contents/metronidazole-an-overview Footer Page 71 of 148 71 ... hoá điều kiện xử lý mẫu phân tích:  Chọn phương pháp xử lý mẫu xác định hiệu suất thu hồi Xây dựng quy trình phân tích ng dụng quy trình nghiên c u để phân tích số mẫu tôm 2.6 Ph ng pháp nghiên. .. phương pháp phân tích (nồng độ 0,08ppm) 45 B ng 3.11: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích (nồng độ 0,4ppm) 46 B ng 3.12: Kh o sát độ đúng, độ lặp l i c a phương pháp phân tích. .. tôm sú phân tích thêm chuẩn 55 Hình 3.26: Sắc đồ pic sắc ký thêm chuẩn SGU, SMP tôm sú……… 56 Hình 3.27: Đư ng chuẩn SGU mẫu tôm lớt phân tích thêm chuẩn… 57 Hình 3.28: Sắc đồ pic sắc ký thêm