ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Thanh TÁCH DÕNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KHOÁNG HÓA XƢƠNG CỦA CÁ MEDAKA CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Thanh TÁCH DÕNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ KHOÁNG HÓA XƢƠNG CỦA CÁ MEDAKA CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Tô Thanh Thúy TS Trần Đức Long Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Tô Thanh Thúy TS Trần Đức Long, thầy cô ngƣời hƣớng dẫn thực khóa luận tốt nghiệp Đại học luận văn cao học Thầy cô hết lòng giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình, truyền đạt kiến thức nhƣ kinh nghiệm làm việc động viên suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa học hoàn thành luận văn Trong trình làm việc, nhận đƣợc lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy cô để thực tốt nghiên cứu Không vậy, thầy cô giúp đỡ nhiều sống Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn GS Christoph Winkler cung cấp dòng cá, thiết bị hóa chất thí nghiệm để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Lai Thành, PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, chia sẻ kinh nghiệm nuôi cá, hỗ trợ thiết bị kính hiển vi cần thiết cho trình nghiên cứu học tập Tôi chân thành cảm ơn thầy cô cán nhân viên Phòng thí nghiệm Tế bào hết lòng bảo tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Hồng Thái, TS Đỗ Minh Hà cho bảo, góp ý quý báu, thầy cô cán nhân viên, sinh viên Phòng thí nghiệm Proteomic Sinh học cấu trúc giúp đỡ, tạo điều kiện để hoàn thành tốt nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô công tác môn Sinh lý học Sinh học ngƣời, TS Vũ Thị Thu, ThS Phạm Trọng Khá dẫn, giúp đỡ nhƣ thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức sở để thực đƣợc luận văn nhƣ vận dụng công việc sau Tôi xin cảm ơn tập thể sinh viên phòng thí nghiệm “Gia đình cá medaka”, đặc biệt CN Phạm Văn Cƣờng, sinh viên Nguyễn Thùy Linh bên cạnh giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, anh chị em, ngƣời cổ vũ động viên giúp đỡ Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ ngƣời thân gia đình giúp đỡ, tạo điều kiện cho đƣợc học tập nghiên cứu Nghiên cứu đƣợc thực dựa kinh phí hỗ trợ từ đề tài QG 14.21 Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Phạm Thị Thanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 RANKL VÀ BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.1.1 Cân nội mô xƣơng trình tái tạo xƣơng 1.1.2 Bệnh loãng xƣơng 1.1.3 RANKL kích thích hình thành, biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng 1.2 CÁC MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.3 CÁ MEDAKA LÀM MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.3.1 Giới thiệu chung cá medaka 1.3.2 Cá medaka làm mô hình cho nghiên cứu xƣơng 1.4 CÁ MEDAKA CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP LÀM MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH LOÃNG XƢƠNG 10 1.5 TÍNH CẤP THIẾT CỦA VIỆC TẠO CÁC DÕNG CÁ CHUYỂN GEN rankl:HSE:CFP ĐỒNG ĐỀU VỀ DI TRUYỀN VỚI GEN CHUYỂN 12 1.5.1 Các cá thể cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu có mức độ tổn thƣơng xƣơng không đồng có đặc điểm di truyền gen chuyển khác 12 1.5.2 Cá dị hợp tử đoạn chèn với gen chuyển rankl:HSE:CFP đƣợc dùng làm nguồn để tạo dòng cá đồng di truyền kiểu hình loãng xƣơng 14 1.6 CÁC PHƢƠNG PHÁP, KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ XƢƠNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA THUỐC VÀ HOẠT CHẤT CHỐNG LOÃNG XƢƠNG .16 1.7 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 19 Chƣơng – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .20 2.2 Thiết bị, dụng cụ dùng nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 20 2.2.2 Các phần mềm dùng nghiên cứu, viết luận văn 22 2.3 Hóa chất dùng nghiên cứu .22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Phƣơng pháp nuôi trì dòng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP 24 2.4.2 Phƣơng pháp lai phân tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu 27 2.4.3 Cách đặt tên cá cho phép lai 27 2.4.4 Phƣơng pháp sốc nhiệt .28 2.4.5 Phƣơng pháp nhuộm xƣơng ấu trùng cá 28 2.4.6 Phƣơng pháp chụp ảnh xử lý hình ảnh 30 2.4.7 Phân tích thống kê 31 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 LAI TÁCH TẠO ĐƢỢC BỐN DÕNG CÁ MEDAKA MANG MỘT ĐOẠN CHÈN VỚI GEN CHUYỂN rankl:HSE:CFP .32 3.1.1 Lai ngoại phối cá rankl:HSE:CFP hệ F0 32 3.1.2 Kết lai phân tích hệ F1, F2 hai cá c7F0 d1F0 khẳng định hai cá thể cá dị hợp tử với đoạn chèn gen chuyển .34 3.1.3 Lai phân tích hệ F1, F2 F3 cá c9F0 d4F0 tìm hai cá thể c9d1F1 d4d1F1 cá dị hợp tử đoạn chèn với gen chuyển 37 3.2 SỰ BIỂU HIỆN HUỲNH QUANG CFP VÀ KIỂU HÌNH GIỐNG LOÃNG XƢƠNG CỦA BỐN DÕNG CÁ c7, c9d1, d1, d4d1 41 3.2.1 Sự biểu huỳnh quang CFP 41 3.2.2 Kiểu hình giống loãng xƣơng bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1 43 3.2.3 Tổng kết kết lai tách dòng cá rankl:HSE:CFP 52 3.3 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ KHOÁNG HÓA VÀ MỨC ĐỘ TỔN THƢƠNG XƢƠNG CỦA ẤU TRÙNG CÁ 52 3.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khoáng hóa tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá bị tổn thƣơng cung xƣơng thần kinh – Phƣơng pháp Im cung thần kinh 53 3.3.2 Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khoáng hóa tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá bị tổn thƣơng thân đốt sống – Phƣơng pháp Im thân đốt sống 62 3.3.3 Tổng kết bàn luận kết xây dựng phƣơng pháp định lƣợng mức độ khoáng hóa mức độ tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá 68 KẾT LUẬN .70 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình số Tên hình Trang Quá trình tái tạo xƣơng với giai đoạn: hoạt hóa Hình 1.1 (activation), hủy xƣơng (resorption), trung gian (reversal), tạo xƣơng (bone formation) khoáng hóa (mineralization) Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 RANKL đƣợc tạo từ tế bào tạo xƣơng kích thích biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng Cá medaka (Oryzias latipes) Cấu trúc gen chuyển rankl:HSE:CFP hệ gen cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP Kiểu hình loãng xƣơng ấu trùng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP Sự không đồng di truyền với gen chuyển cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu 10 11 13 Các kiểu gen với gen chuyển (kí hiệu đoạn màu xanh Hình 1.7 tím than) có hệ F1 lai ngoại phối cá 15 rankl:HSE:CFP ban đầu (F0) với cá chủng dại Tỉ lệ phân ly 1:1 gen chuyển theo Men đen cá F2 Hình 1.8 lai phân tích cá thể F1 dị hợp tử đoạn chèn gen 16 chuyển với cá chủng dại Hình 2.1 Khay nuôi cá medaka có thiết bị lọc nƣớc nhỏ, rong rêu, ốc 25 Hình 2.2 Bộ kit huỳnh quang 30 Hình 2.3 Lam kính dùng để làm tiêu ấu trùng cá nhuộm xƣơng để chụp ảnh 31 Hình 3.1 Các mức độ biểu CFP phôi từ bốn dòng cá c7, 42 c9d1, d1, d4d1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Sự khoáng hóa xƣơng ấu trùng cá đối chứng 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng c7 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng c9d1 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng d1 11 ngày tuổi Sự tổn thƣơng xƣơng ấu trùng cá dòng d4d1 11 ngày tuổi So sánh kiểu hình loãng xƣơng bốn dòng cá c7, c9d1, d1, d4d1 Hình ảnh đo chiều dài cung xƣơng thần kinh ấu trùng cá 11 ngày tuổi phần mềm ImageJ 44 45 46 48 49 51 54 Giao diện phần mềm ImageJ với tính “Segmented Hình 3.9 Line” (A), ROI Manager (B) bảng kết đo chiều dài 56 cung xƣơng thần kinh (C) Phần cột sống ấu trùng cá medaka 11dpf nhuộm với Hình 3.10 Alizarin Red đƣợc chụp hai tƣ mặt bên trái phải để 57 đo độ dài cung thần kinh bên Hình 3.11 Hình 3.12 Chỉ số khoáng hóa Im dòng cá đƣợc đo tính dựa theo phƣơng pháp Im ((*) p < 0,0001) Chỉ số tổn thƣơng xƣơng H ba dòng cá c7, c9d1 d1 60 61 Các diện tích xƣơng khoáng hóa thân đốt sống đƣợc đo Hình 3.13 phần mềm ImageJ hình ảnh chụp mặt bên với độ phóng đại 10x 15 đốt sống đầu cột sống ấu trùng cá 64 đối chứng cá dòng d4d1 đƣợc nhuộm với Alizarin Red Giao diện phần mềm ImageJ với tính “Polygon Hình 3.14 selection” (A), ROI Manager (B) bảng kết diện tích 66 khoáng hóa (C) Hình 3.15 Chỉ số khoáng hóa dòng cá d4d1 đƣợc đo tính dựa theo phƣơng pháp Im thân đốt sống ((*) p < 0,0001) 67 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng số Trang Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.3 Tỷ lệ dinh dƣỡng thức ăn cho giai đoạn phát triển 26 cá Bảng 2.4 Thể tích pha dung dịch nhuộm xƣơng 29 Bảng 2.5 Thể tích pha dung dịch làm 29 Bảng 3.1 Kết lai ngoại phối cá thể cá rankl:HSE:CFP 33 hệ F0 Bảng 3.2 Kết lai phân tích hệ F1, F2 cá c7F0 35 Bảng 3.3 Kết lai phân tích hệ F1, F2 cá d1F0 36 Bảng 3.4 Kết lai phân tích hệ F2, F3 cá c9d1F1 39 Bảng 3.5 Kết lai phân tích hệ F2, F3 cá d4d1F1 40 Bảng 3.6 Giá trị U Utc dòng cá c7, c9d1, d1 59 DANH MỤC VIẾT TẮT STT Kí hiệu Diễn giải PFA Paraformaldehyde PBS Phosphate-buffered saline RO Reverse osmosis dpf Day postfertilization df Degrees of freedom sb Scale bar BMD Bone mineral density DEXA Dual energy X-ray absorptiometry QCT 10 QUS Quantitative ultrasonometry 11 Micro-CT Micro computed tomography 12 Quantitative computed tomography Tên gen protein cá medaka, ngƣời chuột đƣợc viết dựa theo hƣớng dẫn cách viết cá zebrafish (http://zfin.org/zf_info/nomen.html) Ví dụ, tên gen protein RANKL medaka, ngƣời chuột đƣợc viết nhƣ sau: Loài/ gen/ protein Medaka/ rankl/ Rankl Ngƣời/ RANKL/ RANKL Chuột/ Rankl/ RANKL MỞ ĐẦU Loãng xƣơng bệnh xƣơng phổ biến, hậu rối loạn trình chuyển hóa xƣơng dẫn đến chất khoáng xƣơng, làm giảm mật độ xƣơng, suy thoái cấu trúc xƣơng, tăng nguy gãy xƣơng [5, 60] Có nhiều nguyên nhân gây loãng xƣơng nhƣ: lối sống vận động, hút thuốc [15], uống nhiều bia rƣợu [26], lạm dụng thuốc có chứa corticoid [25, 83]… Tuy nhiên, nguyên nhân hay gặp giảm estrogen phụ nữ sau mãn kinh [27, 60] Loãng xƣơng gây ảnh hƣởng nghiêm trọng bất lợi cho sống ngƣời bệnh, gia đình cộng đồng, chí gây tử vong [13, 76] Số ngƣời mắc bệnh loãng xƣơng ngày tăng dân số già hóa lối sống công nghiệp [61], bệnh loãng xƣơng vấn đề cho xã hội đại Bình thƣờng, mô xƣơng đƣợc thay đổi, làm trì phát triển cân nhờ trình tái tạo xƣơng (bone remodeling) gồm hai hoạt động tƣơng tác chặt chẽ với hoạt động tạo xƣơng tế bào tạo xƣơng thực hoạt động hủy xƣơng thực tế bào hủy xƣơng [31, 62] Hoạt động hủy xƣơng lấn át hoạt động tạo xƣơng gây cân nội mô xƣơng dẫn đến loãng xƣơng [68, 69] Nhiều nghiên cứu loãng xƣơng tập trung tìm hiểu yếu tố chế liên quan tới chuyển hóa xƣơng, nhằm tìm thuốc liệu pháp chữa trị bệnh hiệu [28] Các nghiên cứu chủ yếu dùng động vật có vú làm mô hình thí nghiệm nhƣng việc sử dụng chúng có số hạn chế [79] Gần đây, cá medaka (Oryzias latipes) đƣợc chứng tỏ mô hình tốt, bổ sung cho mô hình động vật có vú nghiên cứu xƣơng [63-65, 75, 77, 78] Hơn hết, có chế sinh học phân tử tế bào xƣơng tƣơng tự nhƣ ngƣời [19, 64, 65, 75, 78] ƣu điểm động vật mô hình mà động vật có vú [56, 86] Đặc biệt, mô hình cá medaka cho phép dễ dàng biến đổi gen ghi lại trình sinh học in vivo sinh động kĩ thuật hình ảnh [64, 75, 78] RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-β ligand) số yếu tố kích thích tạo thành hoạt động tế bào hủy xƣơng động vật có xƣơng sống [54, 89] Đại học Quốc gia Singapo tạo cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP mang cấu trúc gen chuyển bao gồm promoter cảm ứng nhiệt điều khiển hai chiều đồng thời gen rankl gen mã hóa cho protein thị huỳnh quang CFP làm mô hình nghiên cứu bệnh loãng xƣơng Ấu trùng cá bị sốc nhiệt biểu Rankl ngoại sinh làm tế bào hủy xƣơng hình thành hoạt động, gây phá hủy mô xƣơng đƣợc khoáng hóa tạo kiểu hình giống loãng xƣơng giai đoạn phát triển sớm [78] Nhóm nghiên cứu muốn sử dụng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP nhận từ Đại học Quốc gia Singapo làm mô hình để sàng lọc hoạt chất chống loãng xƣơng Tuy nhiên, hạn chế phƣơng pháp chuyển gen kĩ thuật meganuclease cách dòng cá đƣợc trì (bằng cách nội phối qua nhiều hệ) nên cá thể cá rankl:HSE:CFP ban đầu nhận đƣợc đồng di truyền với gen chuyển rankl, dẫn đến mức độ tổn thƣơng xƣơng khác nhau, gây khó khăn cho việc đánh giá tác dụng hoạt chất Vì thế, nghiên cứu này, lai phân tách dòng cá chuyển gen rankl:HSE:CFP ban đầu thành số dòng cá có đồng di truyền với gen chuyển đồng mức độ tổn thƣơng xƣơng cá thể dòng Hơn nữa, để sử dụng đƣợc dòng cá cho nghiên cứu, cần phải xây dựng đƣợc phƣơng pháp đánh giá mức độ khoáng hóa ấu trùng cá để qua đánh giá mức độ tổn thƣơng mô xƣơng ấu trùng tác dụng hoạt chất, phƣơng pháp xác định mật độ xƣơng ngƣời động vật có vú áp dụng ấu trùng cá với kích thƣớc nhỏ Do đó, thực đề tài “Tách dòng đánh giá mức độ khoáng hóa xƣơng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP” để hoàn thiện mô hình cá sử dụng cho nghiên cứu bệnh loãng xƣơng Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 RANKL VÀ BỆNH LOÃNG XƢƠNG 1.1.1 Cân nội mô xƣơng trình tái tạo xƣơng Xƣơng mô liên kết đƣợc chuyên hóa đặc biệt [20], gồm hai thành phần thành phần vô hữu [11] Trong đó, phần vô chủ yếu hydroxyapatit chiếm khoảng 70% khối lƣợng xƣơng, giúp xƣơng cứng rắn Phần hữu chiếm khoảng 30% khối lƣợng xƣơng, gồm tế bào xƣơng nhƣ: tế bào tạo xƣơng (osteoclasts), tế bào hủy xƣơng (osteoclasts), tế bào xƣơng (osteocytes) collagen (chiếm 90%) làm cho xƣơng có tính đàn hồi, mềm dẻo [11, 14] Do vậy, xƣơng vừa rắn chắc, vừa mềm dẻo, linh hoạt để đảm nhận nhiều vai trò quan trọng: làm khung cho thể, nâng đỡ bảo vệ quan bên trong; với hệ gân tạo chuyển động thể; dự trữ canxi [20] Xƣơng cứng thay đổi nhƣng thực tế lại liên tục đƣợc sửa chữa làm nhờ trình tái tạo xƣơng (bone remodeling) (Hình 1.1) [31, 62] Quá trình gồm hai hoạt động hủy xƣơng tạo xƣơng đƣợc thực tƣơng ứng tế bào hủy xƣơng tế bào tạo xƣơng phối hợp chặt chẽ, tƣơng tác điều khiển lẫn giúp mô xƣơng đƣợc phát triển cân [31, 62] Tế bào tạo xƣơng có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi trung bì [12], tổng hợp tiết thành phần hữu xƣơng (gọi osteoid) trƣớc khoáng hóa osteoid hydroxyapatit muối vô để hoàn tất trình tạo xƣơng [12, 48] Tế bào hủy xƣơng tế bào đa nhân, kích thƣớc lớn có nguồn gốc với đại thực bào; đƣợc biệt hóa từ tế bào gốc tạo máu (hemopoietic stem cell) tủy xƣơng Nó tạo môi trƣờng a-xít để hòa tan thành phần vô xƣơng, sau tiết enzyme phân giải osteoid [74, 82] Quá trình tái tạo xƣơng bắt đầu hoạt động hủy xƣơng tế bào hủy xƣơng phá hủy phần xƣơng già, hỏng hay cần đƣợc thay thế, tiếp sau hoạt động tế bào tạo xƣơng tạo xƣơng thay cho xƣơng bị phá hủy (Hình 1.1) [31, 62] Hình 1.1: Quá trình tái tạo xƣơng với giai đoạn: hoạt hóa (activation), hủy xƣơng (resorption), trung gian (reversal), tạo xƣơng (bone formation) khoáng hóa (mineralization) [21] Quá trình tái tạo xương bắt đầu tế bào hủy xương (osteoclasts) biệt hóa hoạt động, loại bỏ xương già, hỏng Sau đó, tế bào tạo xương tổng hợp thành phần hữu vô xương thay phần xương loại bỏ BRU (bone remodeling unit); CL (cement line); LC (lining cells); OB (osteoblast); OC (osteoclast); OS (osteoid) Quá trình tái tạo xƣơng kéo dài suốt đời, giúp làm sửa chữa xƣơng Để mô xƣơng phát triển ổn định, hoạt động hủy xƣơng tạo xƣơng phải cân nhau, phù hợp với yêu cầu hoạt động phát triển thể thời điểm Nếu cân bị dẫn đến rối loạn xƣơng, có hai trƣờng hợp phổ biến bệnh loãng xƣơng (osteoporosis) xƣơng đá (osteopetrosis) Loãng xƣơng thƣờng xảy trình hủy xƣơng lấn át trình tạo xƣơng [60, 84], ngƣợc lại, tạo xƣơng nhiều hủy xƣơng dẫn tới tƣợng xƣơng đá [72, 77] 1.1.2 Bệnh loãng xƣơng Loãng xƣơng bệnh xƣơng phổ biến trở thành mối quan tâm vấn đề sức khỏe giới, đặc biệt dân số toàn cầu già hóa Đặc trƣng bệnh giảm mật độ khối lƣợng xƣơng, chất khoáng xƣơng, vi cấu trúc xƣơng bị phá hủy, mô xƣơng bị tổn thƣơng dẫn tới tăng nguy gãy xƣơng [5, 60] Gãy xƣơng hậu nghiêm trọng bệnh loãng xƣơng, gây đau đớn kéo dài làm ảnh hƣởng tới sống sinh hoạt bình thƣờng bệnh nhân chí dẫn tới tử vong [13, 76] Theo số liệu thống kê tổ chức sức khỏe giới, năm 1994 có 75 triệu ngƣời Mỹ, Nhật, Châu Âu bị loãng xƣơng [58] Loãng xƣơng gây 1,5 triệu trƣờng hợp gãy xƣơng năm, đó, 300 nghìn ca gãy xƣơng hông, 700 nghìn ca gãy xƣơng cột sống, 250 nghìn ca gãy xƣơng tay 300 nghìn ca gãy xƣơng vị trí khác [52] Phụ nữ có nguy mắc loãng xƣơng cao nam giới, đặc biệt phụ nữ lớn tuổi [38] Ở Châu Âu, 40% phụ nữ mắc loãng xƣơng, nam giới 13%, tỉ lệ mắc loãng xƣơng phụ nữ 50 tuổi so với nam giới 2:1 [24] Loãng xƣơng bệnh có diễn biến âm thầm, không gây triệu chứng đặc hiệu xƣơng bị gãy, đó, nghiên cứu liệu pháp điều trị bệnh phức tạp nhiều thời gian [22, 45, 59] Hậu mà loãng xƣơng gây không dừng lại mức ảnh hƣởng tới sống sinh hoạt, đe dọa sức khỏe bệnh nhân, tạo gánh nặng cho gia đình bệnh nhân xã hội mà nữa, điều trị loãng xƣơng không dễ dàng tốn Theo thống kê, chi phí điều trị gãy xƣơng loãng xƣơng năm nƣớc Anh khoảng 1,7 tỉ ơ-rô [88]; nƣớc Mỹ chi khoảng 20 tỉ đô-la [53] Bệnh loãng xƣơng hậu nhiều yếu tố: sai hỏng di truyền, lối sống thiếu lành mạnh (dinh dƣỡng không cân bằng, vận động, hút thuốc lá, lạm dụng đồ uống có cồn…), lạm dụng thuốc corticoid hay suy giảm hormon Tuy nhiên, loãng xƣơng xảy phổ biến với phụ nữ sau mãn kinh, lƣợng hormon estrogen thể suy giảm rõ rệt [27, 66] 1.1.3 RANKL kích thích hình thành, biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng Ở ngƣời động vật có vú, RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor kappa-β ligand) protein đƣợc mã hóa gen RANKL Protein đƣợc sản xuất tế bào tạo xƣơng đóng vai trò nhƣ chất truyền tin tế bào với nhiều đích tác động khác Một tác động đƣợc biết đến rõ protein kích thích trình hủy xƣơng (Hình 1.2) [23, 89] RANKL có thụ thể RANK (Receptor Activator of Nuclear Factor kappa-β) nằm tiền tế bào hủy xƣơng Khi RANKL gắn với thụ thể RANK màng tiền tế bào hủy xƣơng thúc đẩy: (1) trình dung hợp tiền tế bào đơn nhân thành tế bào đa nhân, (2) trình biệt hóa từ tiền tế bào hủy xƣơng thành tế bào hủy xƣơng trƣởng thành, (3) trình hoạt hóa tế bào hủy xƣơng để chúng hoạt động chức (4) trình kéo dài tồn tế bào hủy xƣơng cách ngăn cản tế bào chết theo chƣơng trình (apoptosis) [40] Hình 1.2: RANKL đƣợc tạo từ tế bào tạo xƣơng kích thích biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng [43] Mô xƣơng đƣợc trì ổn định nhờ tế bào hủy xƣơng tạo xƣơng tƣơng tác chặt chẽ thông qua đƣờng điều hòa lẫn nhau, có hệ thống RANKL/RANK/OPG (Hình 1.2) RANKL/RANK/OPG đƣợc biết tới đƣờng tƣơng tác trực tiếp tế bào tạo xƣơng tế bào hủy xƣơng [8, 9] Tƣơng tác RANKL/RANK không làm tăng số lƣợng mà tăng hoạt động tế bào hủy xƣơng dẫn tới tăng hoạt động phá hủy xƣơng [84] Để điều tiết ảnh hƣởng RANKL, tế bào tạo xƣơng sản xuất OPG (Osteoprotegerin) loại thụ thể cạnh tranh với RANK để gắn với RANKL, làm giảm gắn RANKL với RANK qua làm giảm hình thành tế bào hoạt động hủy xƣơng Do vậy, tỉ lệ RANKL/OPG đƣợc coi số quan trọng đánh giá đƣợc mật độ sức khỏe xƣơng [8, 30, 33] 1.2 CÁC MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH LOÃNG XƢƠNG Loãng xƣơng trình tiến triển chậm, nghiên cứu điều trị đáp ứng thuốc phải trì kéo dài nhiều năm [22, 59] Nghiên cứu chế bệnh sinh loãng xƣơng phải đƣợc tiến hành nhiều khía cạnh với nhiều yếu tố nguy khác mô hình động vật [39, 79] Động vật mô hình đóng vai trò quan trọng nhiều nghiên cứu loãng xƣơng giúp làm cho chế bệnh sinh loãng xƣơng ngày đƣợc sáng tỏ Hơn nữa, mô hình động vật cần thiết để đánh giá tiền lâm sàng hiệu an toàn thuốc quy trình trị liệu điều trị loãng xƣơng [79] Một mô hình động vật đƣợc đánh giá hiệu quả, có khả phát triển dự đoán kết xác ngƣời Tuy nhiên, để xem xét mô hình động vật đƣợc sử dụng nghiên cứu vấn đề nguồn cung chi phí để trì mô hình yếu tố quan trọng [57, 80] Để chọn đƣợc động vật mô hình phù hợp cho nghiên cứu cần có phối kết hợp yếu tố nhƣ: mức độ tƣơng đồng với ngƣời trình sinh học đƣợc nghiên cứu, khả áp dụng kĩ thuật nghiên cứu động vật đó, giá thành sử dụng động vật nghiên ... lai tách dòng cá rankl: HSE:CFP 52 3.3 PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ KHOÁNG HÓA VÀ MỨC ĐỘ TỔN THƢƠNG XƢƠNG CỦA ẤU TRÙNG CÁ 52 3.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng gián tiếp mức độ khoáng hóa. .. biệt hóa hoạt động tế bào hủy xƣơng Cá medaka (Oryzias latipes) Cấu trúc gen chuyển rankl: HSE:CFP hệ gen cá medaka chuyển gen rankl: HSE:CFP Kiểu hình loãng xƣơng ấu trùng cá medaka chuyển gen rankl: HSE:CFP... độ xƣơng ngƣời động vật có vú áp dụng ấu trùng cá với kích thƣớc nhỏ Do đó, thực đề tài Tách dòng đánh giá mức độ khoáng hóa xƣơng cá medaka chuyển gen rankl: HSE:CFP” để hoàn thiện mô hình cá