Đang tải... (xem toàn văn)
CLOSTRIDUM BOTULINUM và hội chứng ngộ độc thịt (botulism)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN CLOSTRIDUM BOTULINUM VÀ HỘI CHỨNG NGỘ ĐỘC THỊT (BOTULISM) GVHD:KS PHẠM MINH NHỰT NHÓM 5:(07DSH02) NGUYỄN ĐÔNG TRIỀU VÕ THANH TRUYỀN NGUYỄN HẢI YẾN LÊ VĂN TUÂN Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Mục lục Lời nói đầu trang Chương I: Tổng quan Clostridium Botulinum 1.1 Giới thiệu chung C.Botulinum Lịch sử phát triển 1.2 Kiểu hình 1.3 Phân loại 1.4 Đặc điểm chung C.Botulinum 1.2 Cấu trúc 1.2.1 Cấu trúc tế bào 1.2.2 Cấu trúc phân tử 1.3 Hội chứng ngộ độc thit (Botulism) 1.3.1 Các triệu chứng 1.3.2 Phát điều trị 10 1.3.3 Các biện pháp kiểm soát 11 1.4 Đặc điểm độc tố Botulinum 11 1.5 Cơ chế gây độc độc tố Botulinum 12 1.6 Những ứng dụng tuyệt vời C.Botulinum 13 1.6.1 Trong y học 13 1.6.2 Trong thẩm mỹ 16 1.7.3 Hạn chế 16 GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -2- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) 1.7 Các loại thực phẩm nhiễm C.Botulinum 16 1.8 Tình hình nhiễm C.Botulinum giới Việt Nam 18 Chương II: Các phương pháp xác định C.Botulinum 20 2.1 Phương pháp xác định C.Botulinum truyền thống 20 2.1.1 Môi trường hóa chất 20 2.1.2 Quy trình phân tích 20 2.2 Phương pháp xác định C.Botulinum đại 23 2.1 Phương pháp ELISA 23 2.2 Phương pháp PCR 25 Chương III: Kết luận đề nghị 29 Tài liệu tham khảo 30 GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -3- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Lời nói đầu Hiện sinh hoạt hàng ngày, loại thực phẩm đóng hộp có mặt phổ biến thị trường nhiều người tiêu dùng sử dụng Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại quan tâm đến vấn đề dự trữ loại thực phẩm nhà để đối phó với khó khăn xảy Một thực phẩm thường dự trữ loại thực phẩm đóng hộp Nếu mua sử dụng loại đồ hộp không cẩn thận, người bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có đồ hộp, gọi ngộ độc Botulism, gây tử vong Ngộ độc Botulism bệnh ngộ độc thực phẩm mang tính chất cấp tính xảy nặng, phá hủy hệ thần kinh trung ương gây tử vong cao Bệnh thường xảy sau ăn loại thực phẩm dự trữ đóng hộp thịt hộp, cá hộp, pa tê, xúc xích, rau Bệnh ngộ độc Botulism thường loại vi khuẩn Clostridium botulinum type A B gây nên, vi khuẩn tiết độc tố botulotoxin, ngoại độc tố có độc tính cao, cao hẳn độc tố vi khuẩn khác So với độc tố gây bệnh uốn ván, mạnh gấp lần (liều gây chết độc tố uốn ván 0,250 mg botulotoxin 0,035 mg) Mặc dù độc tố dễ bị phân hủy nhiệt độ cao, cần đun thực phẩm lên đến 100 oC 10-30 phút độc tố bị phá hủy hoàn toàn Nhưng độc tố bền vững với men tiêu hóa Bệnh ngộ độc Botulism bệnh nhiễm độc độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển sinh độc tố Người ǎn phải thức ǎn có độc tố bị nhiễm độc Còn vi khuẩn thường không gây nên bệnh không sinh sản thể người Gần đây, vai trò bào tử vi khuẩn có mặt thực phẩm có khả nǎng gây ngộ độc vấn đề nghiên cứu GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -4- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Chương I :Tổng quan Clostridium Botulinum 1.1 Giới thiệu chung C.Botulinum: Vực (domain) : Bacteria Ngành (phylum) : Firmicutes Lớp (class) : Clostridia Bộ (ordo) : Clostridiales Họ (familia) : Clostridiaceae Chi (genus) : Clostridium Hình : Clostridium botulinum Loài (species) : C Botulinum 1.1.1 Lịch sử phát hiện: Clostridium botulinum lần công nhận cô lập năm 1896 Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào ổ dịch botulism Các cô lập ban đầu đặt tên botulinus Bacillus Tuy nhiên, cô lập từ ổ dịch luôn tìm thấy bào tử dạng kỵ khí, đó, Bengston đề xuất sinh vật đặt vào chi Clostridium Từ năm 1953 tất loài sản xuất độc tố thần kinh botulinum (loại AG) xác định C botulinum Bằng chứng tồn số kiểu hình kiểu gen đáng kể chứng minh đa dạng loài Điều dẫn đến phân loại lại C botulinum loại G giống loài argentinense Clostridium Chủng Clostridium botulinum không sản xuất chất độc botulin gọi sporogenes Clostridium GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -5- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Năm 2003 gen Clostridium botulinum công bố với công trình viện Sanger với Tiến sĩ Roger Huston Tiến sĩ M Peck 1.1.2 Kiểu hình: Các danh pháp C.botulinum công nhận bốn nhóm sinh lý (I-IV) Điều chủ yếu dựa khả sinh vật tiêu hóa protein phức tạp Nghiên cứu ADN cấp rRNA hỗ trợ phân khu loài thành nhóm I-IV Hầu hết ổ dịch botulism người nhóm I (thủy phân protein) II (không thủy phân protein) C botulinum nhóm III chủ yếu sinh vật gây bệnh động vật Hiện có hồ sơ C.Botulinum nhóm IV người động vật gây bệnh 1.1.3 Phân loại C.Botulinum : Sản xuất chất độc thần kinh tính C.Botulinum Có loại độc tố xác định phân bố ( từ A đến F) Clostridium botulinum sản xuất độc tố loại B loại F phân lập từ trường hợp người bị ngộ độc thịt New Mexico California Chỉ có loại A, B, E F gây bệnh người, loại C D gây bệnh bò, chim, động vật khác không gây người 1.1.4 Đặc điểm chung C.Botulinum: Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, thủy phân đường protein hoạt động thu nhận lượng Hầu hết nhóm Clostridium ưa nhiệt vừa nhiên có số loài ưa nhiệt số loài thuộc nhóm ưa lạnh Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng C.botulinum C.perfringens C botulinum loài sống kỵ khí bắt buộc, tăng trưởng môi trường trung tính, cạnh tranh với vi sinh vật khác Các dòng loài có đặc điểm nuôi cấy khác có kiểu kháng nguyên ký hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên A, B F có hoạt tính thủy phân protein tạo nên GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -6- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc môi trường Willis Hobbs, kiểu C, D, E khả Kiểu A thường thấy mẫu thịt kiểu E phân lập mẫu cá Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate disodium sulphate, ủ 37oC – ngày Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt ủ thêm 50 oC Trên môi trường khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng ion sulphite (S2-) ion sắt (Fe2+) có môi trường Độc tố Botulin sản xuất Clostridium botulinum cho vũ khí sinh học tiềm năng, khoảng 75 nanogram để giết người (LD50 1ng/kg,giả định người trung bình nặng ~ 75kg); 500 gram đủ để giết nửa số dân số toàn người Clostridium botulinum loại vi khuẩn đất Các bào tử tồn hầu hết môi trường khó để giết Sự tăng trưởng vi khuẩn ngăn chặn axit cao, tỷ lệ đường hòa tan cao, nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp lưu trữ nhiệt độ 38 ° F (loại A) Ví dụ: Mật ong, xirô bắp chất khác chứa bào tử bào tử không phát triển nồng độ đường cao độ nhiên nồng độ đường bị pha loãng oxy thấp, acid thấp hệ thống tiêu hóa trẻ sơ sinh bào tử phát triển sản xuất chất độc Ngay sau trẻ bắt đầu ăn thức ăn rắn, loại nước tiêu hóa trở nên chua cho vi khuẩn phát triển GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -7- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Hình : Clostridium quan sát qua kính hiển vi 1.2 Cấu trúc 1.2.1 Cấu trúc tế bào - Kích thước khoảng 0,3 – 0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, có hình que, có roi - C.botulinum vi khuẩn Gram (+) - Sinh bào tử, bào tử thường to chiều ngang tế bào 1.2.2 Cấu trúc phân tử Bộ gen Clostridium botulinum 3.886.916 bp, G + C khoảng 28,2%, Ngoài có plasmid 16.344 bp Toxin tổng hợp từ chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử gần 150.000 dalton Ở cấu trúc này, phân tử độc tố có hoạt lực tương đối thấp, bị số enzym vi khuẩn trypsin tách thành hai chuỗi nặng (100.000 GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -8- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) dalton) nhẹ (50.000 dalton) nối với cầu nối sulfur có gắn với phân tử Zn 1.3 Hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Botulism bệnh bại liệt nghiêm trọng botulin độc thần kinh sản phẩm vi khuẩn Clostridium botulinum Hình: Cấu trúc phân tử vi khuẩn Clostridium botulinum gây ngộ độc 1.3.1 Các triệu chứng Botulism: Các triệu chứng Botulism gồm : làm tổn thương hệ thần kinh trung ương (đặc biệt đến tín hiệu từ não đến bắp), gây liệt rõ liệt mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt vòm miệng, lưỡi hầu, gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử vong GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm -9- Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Hình : Vịt bị tê liệt mềm bệnh Trẻ sơ sinh với Botulism xuất nôn nửa, ăn, táo bón, khóc yếu không phát triển Nếu không chữa trị, triệu chứng phát triển gay tê liệt cánh tay, chân, thân bắp hô hấp Các triệu chứng thường 18 – 36h sau tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, xảy sớm 6g trễ 10 ngày sau tiêu thụ Botulism có nhiều loại A, B, C, D, E loại A, B, E cho độc tố mạnh Hình: trẻ em bị nhiễm botulism 1.3.2 Phát điều trị : GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 10 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) lực, giảm hoạt động mức cơ, coi liệu pháp giảm đau đa phương thức, có lợi cách trước làm hồi phục chiều dài bình thường cân sinh học -Chữa chứng đau nhức đầu: Có thể tiêm BoTX-A vào vùng mặt hay vào điểm đau cho trường hợp nhức đầu mà nguyên nhân chưa xác định rõ Nghiên cứu hồi cứu (Blumenfeld-2003): 271 người (bao gồm 29 nhức đầu Migraine, 19 nhức đầu căng thẳng, 74 bị nhức đầu hỗn hợp, 154 nhức đầu mạn tính xảy hàng ngày) dùng BoTX-A thấy làm giảm số ngày nhức đầu tính theo tháng từ 19 xuống ngày, giảm cường độ đau từ 2,4 điểm xuống 1,8 điểm Cũng với 263 người khác thấy có 85% số người dùng BoTX-A giảm số ngày nhức đầu tháng, giảm cường độ đau Trước Silberstein (2000) Foster (2001) thực thử nghiệm có đối chứng với giả dược cho biết BoTX-A thực có lợi ích chứng nhức đầu Tsui (1986) Brashear (1999) thấy BoTX-A, BoTX-B có làm giảm đau rối loạn trương lực cổ 1.6.2 Trong thẩm mỹ : Sự co gây nên vết nhăn gợn sóng trán, vết nhăn chân chim khoé mắt Trước ứng dụng vào y học, thầy thuốc thẩm mỹ táo bạo tiêm vào bắp mặt, làm liệt có mức độ này, xoá vết nhăn Mãi đến tháng 4/2002, FDA (Mỹ) thức cho lưu hành, từ năm 2001 có 1,6 triệu người Mỹ tự nguyện dùng thử, doanh số bán hàng năm lúc 301 triệu USD đến năm 2006 vượt qua ngưỡng tỷ USD Đối với việc dùng BoTX-A, y học bước thăm dò, dè dặt thẩm mỹ lại sớm ưa chuộng dùng phổ biến GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 16 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Hình: Tiêm BoTX-A điều trị vết nhăn 1.7.2 Hạn chế BoTX-A xoá nếp nhăn co (ví dụ co vui, buồn) xoá vết nhăn lão hoá (do giãn trùng cơ) Vì làm cho người già tươi tắn lại nhiều người nhầm tưởng Khi vui, buồn có co tương thích tạo nên nét rạng rỡ hay ủ dột Làm liệt xoá nếp nhăn, song lại co để biểu lộ tình cảm Nói cách khác, xoá vết nhăn tạo nên người đẹp nhìn bên dường "người đẹp vô hồn" Mỗi lần xoá nếp nhăn kéo dài 5-6 tháng, sau nhăn trở lại, muốn tiếp tục lại phải đến điều trị trở lại dường vô cảm bên rõ Dùng BoTX-A cần có hai thủ thuật quan trọng phải tiêm bị bệnh, tiêm vào đầu thần kinh Trong thẩm mĩ, tiêm không làm liệt chỗ khác, sinh nếp nhăn khác, kéo lệch hay biến dạng mặt Trong y khoa, tiêm không không chữa bệnh nơi cần lại gây giảm trương lực nơi khác Dùng BoTX-A có điều quan trọng thứ hai phải thăm dò, chọn liều thích hợp Cả thẩm mỹ y học, việc dùng liều gây phản tác dụng, tức gây tác dụng ý muốn, làm GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 17 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) liệt hay ức chế đau mức Kể từ BoTX-A dùng tới có nhiều vụ kiện tai biến gây Hiện hầu hết nghiên cứu phần lớn BoTX-A, thấy có hiệu quả, độc, chưa nhiều BoTX-B, thấy có hiệu tương đương có độc 1.8 Các loại thực phẩm nhiễm C.Botulinum Botulin độc tố chứng minh có nhiều loại thực phẩm đồ hộp ngô đóng hộp, ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà gan gà pate gan, loại thịt , xúc xích, tôm hùm , thịt hun khói cá muối Hình: Đồ hôp nhiễm C.Botulinum 1.9 Tình hình nhiễm C.Botulinum giới Việt Nam - Ở Hoa Kỳ nhiễm C.Botulinum chủ yếu đồ hộp rau ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà Gần Hoa Kỳ sản phẩm tương ớt đóng hộp thuộc nhiều nhãn hiệu thu hồi sau có người nhập viện bệnh botulism phát sinh từ độc tố có sản phẩm công ty Castleberry"s -Ở Nga, ngộ độc chủ yếu cá GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 18 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) -Ở Đức ăn thức ăn làm thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc xích - Nhật Bản - 36 người bị bệnh 11 người thiệt mạng sau ăn chiên nhồi rễ sen Rễ sen chân không đóng gói bán unrefrigerated Các điều kiện cho phép cho phát triển sản xuất độc tố C botulinum - Canada - Ít 37 người bị ảnh hưởng sau ăn nhà hàng mà sử dụng nhiệt độ lạm dụng unacidified tỏi dầu vốn bảo quản nhiệt độ phòng - USA - Các trường hợp ngộ độc xảy việc tiêu thụ khoai tây salad Ba ổ dịch xảy ra, kết 50 người bị bệnh tử vong Người ta cho botulinum diện khoai tây nướng sử dụng cho salad Những lưu trữ nhiệt độ môi trường xung quanh nhiều ngày trước sử dụng - Mỹ - xào hành tây liên quan đến ổ dịch nhà hàng Mỹ 28 người bị ảnh hưởng, với tử vong - Anh - bị ô nhiễm sữa chua hazelnut chịu trách nhiệm ổ dịch dẫn đến 27 người bệnh tử vong botulinum nghiền hazelnut sử dụng da ua -Vào ngày 23/3, 17 bệnh nhân nặng vụ ngộ độc ăn măng tre tỉnh Nan (Thái Lan) đưa lên Bangkok điều trị -Năm 1991, 90 người Ai Cập phát bệnh sau ăn thức ăn chứa vi khuẩn Clostridium botulinum.Theo Christopher Braden, chuyên gia Trung tâm Atlanta Trung tâm Kiểm soát Phòng bệnh Mỹ (CDC) GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 19 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Chương II :Các phương pháp xác định Clostridium Botulinum 2.1 Phương pháp truyền thống để xác định Clostridium Botulinum: 2.1.1 Môi trường hóa chất Pepton đệm bufer pepton water (BPW) Iron suphide Agar (ISA) Perfringns selective Agar ( shahidi ferguson ferfringens, SFP) 2.1.2 Quy trình phân tích Cân 10g (hoặc 25g) mẫu túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml) nước pepton đệm đồng mẫu máy dập mẫu mẫu tiếp tục pha loãng thập phân tùy mật độ diện C.botulinum máu Trước cấy,mẫu xữ lý nhiệt 70 – 800C 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng vi sinh vật khác Cấy vào đĩa 1ml dịch mẫu dược pha loãng thích hợp vào đĩa petri vô trùng Đỗ 15ml môi trường ISA SFP Agar ủ ấm 45 0C vào đĩa, lắc sau môi trường đông, đỗ lên thêm bề mặt khoảng 10ml ISA SFP Agar Một phương pháp khác cho thêm ống nghiệm vô trùng 1ml dịch mẫu nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA SFP Agar ủ ấm 45 0C vào ống trộn mẫu sau môi trường đông, đỗ thêm lên thêm bề mặt 2-3 ISA SFP Agar Đĩa hoăc ống nghiệm cấy mẫu ủ 37 0C 24 – 48h bình kỵ khí Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt thực ủ song song 37 0C 500C thông thường đọc kết đĩa dễ ống nghiệm ISA môi trường không chọn lọc nên loài sinh H2S khác Clostridium botulinum tăng trưởng tạo khuẩn lạc màu đen môi trường Để khẳng định khuẩn lạc Clostridium botulinum cần thực quy trình tiêu GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 20 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) chuẩn để giúp khẳng định kết Phương pháp phân lập Clostridium với vi sinh vật khác, không phân biệt loài Clostridium với như: C acetobutylicum,C aerotolerans,C beijerinckii,C, bifermentans, C butyricum, C cadaveris, C chauvoei, C clostridioforme, C colicanis, C difficile, C fallax C formicaceticum, C histolyticum, C innocuum, C ljungdahlii,C laramie C lavalense, C novyi, C oedematiens, C paraputrificum, C perfringens, C phytofermentans, C piliforme, C ramosum, C scatologenes, C septicum, C sordellii, C sporogenes, C tertium, C tetani, C tyrobutyricum GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 21 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Đồng pha loãng mẫu theo dãy phân xử lý mẫu 800C 15-20 phút Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đĩa petri, đổ 10-15ml môi trường ISA 450C lắc Đổ lớp ISA thứ hai lớp thứ đông đặc ủ bình kín, 370C 24-48 Đếm tất khuẩn lạc màu đen đường kính ≥0,5mm Tính kết Cấy 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm, đổ 10-15ml môi trường ISA 450C lắc Đổ lớp ISA thứ hai cao 1-2cm lớp thứ đông đặc ủ 370C, 24-48 Đếm tất khuẩn lạc màu đen xuất ống Tính kết Công thúc tính: A(CFU/ml)=( NxR)/(n1vf1+… +nivfi) N tổng số khuẩn lạc đếm R tỷ lệ xác xuất v thể tích cấy vào đĩa/ống nghiệm ni số đĩa/ống nghiệm có số khuẩn lạc chọn fi độ pha loãng tương ứng GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 22 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Cần phải thực hiên kiểm tra hóa sinh khác khẳng định Tính chất chủng: Nhóm I II II IV Dạng độc tố A,B,F B,E,F C,D G Làm tan Gelatin + + + + Lên men Glucose + + + - Lên men Fructose ± + ± - Lên men Mannose - + + _ Lên men Maltose ± + ± - Lên men Sucroe - + - - Lên men Trehalose - + - - Lên men Lactose - - - - Lipase + + + - Lecithinase - - - - Sinh H2S + + + + Dựa vào đặc sinh hoá Clostridium botulinum mà ta kiểm tra phản ứng sinh hoá nhằm khẳng định Clostridium botulinum 2.2 Phương pháp đại xác định C.Botulinum : 1.2.1 Phương pháp ELISA: Mẫu thu thập từ môi trường nuôi cấy C botulinum canh trường TPY-C sử dụng để định lượng sản xuất hoạt tính sinh học BoNT-B phương pháp ELISA với kháng thể đa dòng, cụ thể cho loại BoNT-B từ thỏ Lấy ml môi trường nuôi cấy tế bào C botulinum, ly tâm 4°C 14.000 vòng GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 23 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) / phút 10 phút để tách C botulinum từ dịch Dịch pha loãng dung dịch đệm casein Thêm 100 µL kháng thể phát pha loãng với ống Sự thay đổi màu sắc đo multiscanner ELISA 492 nm , kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với ezyme alkaline Phosphatase Đo BoNT-B ống nồng độ sau đây: 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0,4 ng / ml Bằng cách theo dõi đổi màu, phát định lượng kháng nguyên GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 24 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) 1.2.2 Phương pháp PCR: Tất chủng clostridium nuôi cấy 10 ml tryptose-peptoneglucose- yeast extract (TPGY) ủ điều kiện kỵ khí 37°C 24-48 h, nuôi qua đêm(20 nhiệt độ tương ứng) B1 Chuẩn bị khuôn mẫu: Lấy ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường , rửa với ml đệm TE (0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) 37°C ngâm ml nước cất Ngoài tế bào riêng rẻ phân lập chủng vi khuẩn, ba hỗn hợp phân lập chứa C.botulinum thủy phân protein loại A, B F, C.botulinum không thủy phân protein loại B, E , F tất bốn huyết chuẩn bị cách trộn riêng rẻ tế bào phân lập Mọi tế bào phân lập đun nóng 99 o C 10 phút để chia tế bào phát hành DNA vi khuẩn ly tâm phút 10.000 × g Một khối lượng μL nổ i mă ̣t sử dụng mẫu hỗn hợp PCR Tất đun nóng 990C 10 phút nhằm phá vỡ tế bào tách chiết DNA C.botulinum Ly tâm phút 10.000 vòng/phút Khoảng μL dịch nổ i mă ̣t sử dụng mẫu hỗn hợp PCR B2 Mồi: Dựa công bố trình tự DNA gen BoNT , bốn cặp mồi với cụ thể cho hai loại C botulinum A, B, E, F thiết kế ( Bảng 2) GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 25 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) TABLE Mồi cho multiplex PCR C botulinum loại A, B, E F Product Loại Mồi Chuỗi (5'-3') size (bp) Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC 782 Vị trí gen Nhiệt độ GC content (mã vùng) (°C) (%) 1788-1808 63.9 52 2569-2548 63.4 41 434-453 64.3 50 638-619 64.5 45 156-175 63.7 45 544-525 63.6 43 185-194 64.1 50 727-708 63.3 55 AGC TAT GTT Ar BMLA2 CGT ATT TGG AAA GCT GAA AAG G Bf CBMLB1 CAG GAG AAG TGG 205 AGC GAA AA Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA 389 TCC GCC TA Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG 543 AGA ACG GA Fr CBMLF2 TAA CTC CCC TAG CCC CGT AT GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 26 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) B3.PCR: PCR thực với 50 μL hỗn hợp phản ứng có chứa μL mẫu, 0,3 μM mồi, 220 nM triphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KCl, 4,8 mM MgCl, DNA polymerase Các sản phẩm PCR khuyếch đại xác định agarose gel 2% nhuộm màu với ethydium bromide B4 Đọc kết quả: Multiplex PCR tế bào C botulinum loại A, B, E, F mang lại sản phẩm khuếch đại dự kiến (Bảng 1): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389 bp; loại F 543 bp (hình) Hỗn hợp bị đìnhcác tế bào mang đoạn ADN tương ứng (hình 1) Các sản phẩm PCR hình dung rõ ràng gel agarose; từ 150bp đến 200bp khác biệt kích thước sản phẩm khuếch đại kích hoạt phân biệt mảnh vỡ dễ dàng mà không cần sử dụng độ phân giải cao agarose (hình) GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 27 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Multiplex PCR phát C botulinum Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: C botulinum loại A; 3: C botulinum loại B; 4: C botulinum loại E; 5: C botulinum loại F; 6: C botulinum thủy phân protein loại A, B F; 7: C botulinum không thủy phân protein loại B, E F; 8: C botulinum loại A, B, E, F; 9: tiêu cực kiểm soát GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 28 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Chương III :Kết luận đề nghị Botulism bệnh nguy hiểm xảy Mấy năm gần đây, quan FDA Hoa Kỳ CFIA Canada cảnh báo bệnh botulism cho lệnh thu hồi vài loại sản phẩm nhiễm khuẩn bày bán thị trường chẳng hạn Hot Dog Chili Sauce Castleberry’s Ford Cpy USA, Austex Hot Dog Chili Sauce, Kroger Hot Dog Chili Sauce, Chili French Style Green Beans Lakeside Foods, Bolthouse Farm 100% Carrot Juice (Canada), Hot Great Value Original Chili with Beans Tuy nhiên độc tố botulism có vài ứng dụng ích lợi y khoa trị liệu Độc tố A (BTXA) sử dụng để trị xáo trộn thần kinh gây co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa da (prurit cutané), đau vùng mặt (douleur myofaciale), tiết nhiều mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine) Gần đây, tình cờ lý thú lúc dùng toxine để trị chứng mí mắt co thắt bất thường (blépharospasme) bệnh nhân, bác sĩ khám phá thêm tác dụng khác độc tố làm tan biến xóa bớt nếp nhăn mặt cách tạm thời Thế độc tố botulism nhảy vào lĩnh vực thẩm mỹ với xuất thuốc Botox® Cosmetic (toxinA), Myobloc (toxinB), Dysport Vistabel Tất bào chế từ độc tố botulism Botox giúp xoá bỏ nếp nhăn trán, hai bên khóe mắt gọi vết chân chim (patte d’oie, crows feet), khóe miệng, hai chân mày… GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 29 - Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Tài liệu tham khảo: Clostridium botulinum: ecology and control in foods by Andreas H W Hauschild,Karen L Dodds http://www.cdc.gov/ http://www.cfsan.fda.gov/mow/chap2.html www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1489423/ http://www.ebook.edu.vn/?page=1.15&view=5339 http://d.violet.vn/uploads/resources/49/78892/preview.swf http://elearning.hueuni.edu.vn/ http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriologic alAnalyticalManualBAM/UCM070879 http://en.wikipedia.org/wiki/Botulism GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm - 30 - ... Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) 1.4 Đặc điểm độc tố Botulin -Độc tố Botulin vi khuẩn Clostridium Botulinum sinh (độc tố gây chết làm suy hô hấp) Vi khuẩn C Botulinum có... Clostridium Botulinum hội chứng ngộ độc thịt (Botulism) Multiplex PCR phát C botulinum Đường 1: trọng lượng phân tử đánh dấu; 2: C botulinum loại A; 3: C botulinum loại B; 4: C botulinum loại E; 5: C botulinum. .. bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có đồ hộp, gọi ngộ độc Botulism, gây tử vong Ngộ độc Botulism bệnh ngộ