i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN MÔI TRƢỜNG NƢỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN MÔI TRƢỜNG NƢỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS.TS LƢƠNG THỊ HỒNG VÂN TS TRẦN ĐỨC HẠNH Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn đƣợc ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thùy Linh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu lớp Cao học công nghệ sinh học trường đại học Khoa Học, nhận giúp đỡ, giảng dạy nhiệt tình thầy giáo, cô giáo nhà trường Nhân dịp xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới tập thể thầy giáo, cô giáo; đặc biệt thầy, cô môn Khoa học sống, Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn khoa học PGS TS Lương Thị Hồng Vân TS Trần Đức Hạnh – CTHĐQT công ty cp thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ trình thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Cù Hữu Phú ThS Âu Xuân Tuấn cung cấp tài liệu ý kiến quý báu để hoàn thiện đề tài nghiên cứu Tôi chân thành cám ơn tới Giáo sư, Tiến sỹ trình đọc luận văn có nhận xét tinh tế, sắc sảo, giúp sửa chữa thiếu sót Xin cám ơn ban Giám Đốc, phòng ban đồng nghiệp công ty Cp thuốc thú y Đức Hạnh Marphavet tạo điều kiện thời gian cổ vũ, động viên suốt trình thực đề tài Xin trân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thùy Linh Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Vi khuẩn quang hợp : VKQH Bacteriochlorophyll : B chl BT : Bào tử KL : Khuẩn lạc TH : Thu hồi LM : Lên men CFU : Đơn vị khuẩn lạc CP : Chế phẩm CTV : Cộng tác viên 10.OD : Mật độ quang 11.DO : Oxi hòa tan 12.COD : Nhu cầu oxi hóa 13.BOD : Nhu cầu oxi sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i MỤC LỤC vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình phát triển nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam 1.1.1 Hiện trạng nuôi trồng dịch bệnh hoạt động nuôi trồng thủy sản 1.1.2 Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản 1.2 Giới thiệu chung Probiotic 1.2.1 Định nghĩa probiotic 1.2.2 Vai trò probiotic 1.2.3 Những nhóm vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng sản xuất probiotic 1.2.4 Vi khuẩn Bacillus 11 1.2.5 Vi khuẩn Lactobacillus 14 1.2.6 Vi khuẩn quang hợp tía 18 1.2.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh trƣởng phát triển vi khuẩn 20 1.3 Đặc điểm số đánh giá nƣớc nuôi trồng thủy sản 21 1.3.1 Đặc điểm nƣớc nuôi tôm cá 21 1.3.2 Những số đánh giá nƣớc nuôi tôm cá 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii 1.3.3 Yêu cầu nƣớc nuôi tôm cá 24 1.4 Các bệnh thƣờng xảy cho tôm ao nuôi bị nhiễm bẩn 25 1.5 Ứng dụng Chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản 27 1.6 Một số sản phẩm probiotic dùng chăn nuôi thủy sản thị trƣờng 29 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu lý chọn đối tƣợng nghiên cứu 31 2.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 32 2.2.1 Hóa chất 32 2.2.2 Thiết bị 32 2.3 Môi trƣờng nghiên cứu 33 2.3.1 Môi trƣờng MRS (g/l) 33 2.3.2 Môi trƣờng SA (g/l) 33 2.3.3 Môi trƣờng MPA (g/l) 33 2.3.4 Dung dịch vi lƣợng (g/l) 34 2.3.5 Hỗn hợp vitamin (mg/ml) 34 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu xác định tiêu nghiên cứu 34 2.4.1 Phƣơng pháp lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học 34 2.4.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình nhân giống 35 2.4.3.Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men 36 2.4.4 Phƣơng pháp định tính vi khuẩn nghiên cứu 37 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết nghiên cứu tuyển chọn giống sản xuất 39 3.1.1 Chọn chủng có hoạt tính sinh học ổn định, an toàn với vật nuôi 39 3.1.2 Xác định điều kiện nhân giống 42 3.2 Kết nghiên cứu quy trình lên men sản xuất chế phẩm 47 3.2.1 Lên men chìm 47 3.2.2 Kết nghiên men Bacillus, Lactobacillus môi trƣờng xốp 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix 3.3 Kết nghiên cứu kỹ thuật thu hồi sinh khối tạo chế phẩm bảo quản chế phẩm 55 3.3.1 Tạo chế phẩm dạng dịch dạng bột 55 3.3.2 Thử an toàn với động vật thí nghiệm 57 3.3.3 Kỹ thuật bảo quản chế phẩm 58 3.4 Xây dựng tiêu chuẩn sở quy trình kiểm nghiệm chế phẩm 59 3.5 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý môi trƣờng 11 Bảng 1.2: Sự xếp chi Lactobacillus 15 Bảng 1.3: Một số đặc điểm vi khuẩn tía 19 Bảng 1.4: Ảnh hƣởng pH đến sinh trƣởng phát triển tôm cá 23 Bảng 1.5: Một số tiêu nƣớc nuôi trồng thủy sản [5] 25 Bảng 1.6: Các thông số môi trƣờng thích hợp cho tôm sú thâm canh [2] 25 Bảng 3.1 Kiểm tra khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá 39 Bảng 3.2 Khả sinh enzym phân hủy hữu vi khuẩn 40 Bảng 3.3: Khả sinh trƣởng (theo tích lũy sinh khối OD660) chủng vi khuẩn tía Rhodopseudomonas palustris nguồn nƣớc thải 41 Bảng 3.4: Thành phần môi trƣờng nhân giống Bacillus thích hợp 42 Bảng 3.5: Nhiệt độ nhân giống Bacillus thích hợp 43 Bảng 3.6: Tỷ lệ giống thích hợp 43 Bảng 3.7: Thành phần môi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp 44 Bảng 3.8: Nhiệt độ nhân giống Lactobacillus acidophillus TN thích hợp 44 Bảng 3.9: pH môi trƣờng nhân giống L.acidophillus TN thích hợp 44 Bảng 3.10: Tỷ lệ giống L.acidophillus TN thích hợp 45 Bảng 3.11: Nhu cầu vitamin Rhodopseudomonas palustris RD 45 Bảng 3.12: Khả sinh trƣởng R.palustris RD khoảng pH 45 Bảng 3.13: Xác định độ thông khí bình lên men L.acidophillus TN R.palustris RD 48 Bảng 3.14: Xác định độ thông khí bình lên men Bacillus 48 Bảng 3.15: Khảo sát thời gian lên men Bacillus L.acidophillus TN 49 Bảng 3.16: Khảo sát thời gian lên men R.palustris RD 49 Bảng 3.17: Tỷ lệ giống thích hợp 50 Bảng 3.18: Nguồn cacbon thích hợp lên men Lactobacillus môi trƣờng xốp 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 60 Bảng 3.33: Định tính chế phẩm theo TCVN 2011 VK Đặc điểm B.subtilis DA L.acidophilus TN R.palustris RD Hình thái khuẩn To, mờ, mép có Nhỏ, đều, màu Nhỏ, màu đỏ tía lạc cƣa trắng nâu vàng Que, đơn, không Que, đơn, không BT BT Hình thái TB, BT Que, đơn, BT oval Catalase Sinh catalase LM đƣờng sinh LM mannose, LM axit sucrose LM sữa sinh axit Không sinh catalase LM sữa sinh axit KN khử sulfua Có khả khử sulfua Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm bao gồm: Pha chế môi trƣờng định tính ( môi trƣờng xác định hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử, xác định đặc điểm sinh hóa: catalase, lên men đƣờng, lên men sữa, khử sulfua) Cách xác định đặc điểm khuẩn lạc B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD; Cách xác định đặc điểm tế bào, bào tử Pha chế môi trƣờng định lƣợng; cách địnhlƣợng (xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD có 1g 1ml chế phẩm Pha chế môi trƣờng xác định độ tinh khiết; cách xác định độ tinh khiết Quy trình kiểm nghiệm đƣợc tóm tắt nhƣ hình 3.5 61 Chế phẩm Pha loãng 10 -5 MT định lƣợng: - Nuôi B.subtilis DA (370C/ 24h) - Nuôi L.acidophillus TN (340C/ 48h) - Nuôi R.palustris RD (300C/ 48h) - MPA3 agar - MRS agar - SA agar Đếm số Môi trƣờng định tính MPA3 + Succrose Nuôi cấy t 300C/ ngày - B.subtilis DA - L.acidophillus TN - R.palustris RD Xác định độ tinh khiết Xác định khả lên men đƣờng Môi trƣờng định tính Môi trƣờng sữa Xác định hình thái khuẩn lạc Xác định khả lên men sữa TN (35- 370C/ 24- 48h) Môi trƣờng định tính MRS, MPA3, SA - Nuôi B.subtilis DA (370C/ 24h) - Nuôi L.acidophillus TN (340C/ 48h) - Nuôi R.palustris RD (300C/ 48h) Xác định hình thái tế bào, bào tử Hình 3.5: Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm 62 3.5 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm Quy trình sản xuất chế phẩm bao gồm pha chế môi trƣờng nhân giống, nuôi cấy B.subtilis DA, L.acidophillus LA, R.palustris RD môi trƣờng tƣơng ứng Lên men sục khí B.subtilis, lên men chìm, nuôi cấy tĩnh L.acidophillus LA R.palustris RD vào bình nagel 20l Lên men B.subtilis DA, L.acidophillus LA môi trƣờng xốp thực túi PE Tạo chế phẩm, kiểm tra chất lƣợng, đóng túi thiếc chiết chai Quy trình đƣợc tóm tắt nhƣ hình 3.6 63 Giống R palustris RD Giống L.acidophillus TN Giống B subtilis DA Hoạt hóa 300C/ 48h tĩnh, Nhân giống cấp 1; 2; chiếu sáng Lên men chìm Lên men mt xốp Thu hồi sinh khối Làm khô Nghiền Kiểm tra chất lƣợng Trộn Kiểm tra chất lƣợng Chất bảo quản Trộn Chất bảo quản Kiểm tra pH Kiểm tra độ ẩm Ra chai Đóng túi Hình 3.6: Quy trình sản xuất chế phẩm 64  Nhân giống: Chủng B.subtilis DA từ ống giống giữ glycerol đƣợc hoạt hóa môi trƣờng thạch MPA 3, kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 150ml môi trƣờng MPA lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 370C, 24 Nhân giống cấp II vào bình trung tính 500ml chứa 250ml môi trƣờng MPA lỏng, bổ sung giống tỷ lệ 10%, lắc 200 v/p, 37 0C, 16-24 Giống cấp III đƣợc nhân bình nhỏ hệ thống lên men sục khí Bình dung tích 15 lít chứa 10 lít môi trƣờng MPA lỏng, sục khí nhẹ, khấy 500 v/p Không khí đƣợc cấp từ máy nén khí tự động, qua cột lọc vô trùng vào bình nhân giống Lên men sục khí 8-10 giờ, 370C Chủng L.acidophillus TN từ ống giống đông khô, hoạt hóa môi trƣờng thạch MRS, nuôi cấy 340C 48 Kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 200ml môi trƣờng MRS lỏng, nuôi tĩnh 340C, 24 Giống cấp II đƣợc nhân từ giống cấp I tỷ lệ 10% vào bình trung tính 500ml có 300ml môi trƣờng MRS lỏng, nuôi tĩnh 34 0C, 24 Giống cấp III đƣợc nhân từ giống cấp II tỷ lệ 10% vào bình trung tính lít chứa 600ml môi trƣờng MRS lỏng, nuôi tĩnh 340C, 24 Chủng R.palustris RD từ ống giống hoạt hóa ống nghiệm chứa môi trƣờng SA lỏng, nuôi cấy tĩnh, chiếu sáng 48 giờ, 300C Kiểm tra độ tinh khiết, hoạt tính sinh học Nhân giống cấp I vào bình trung tính 250ml chứa 200 ml môi trƣờng SA lỏng, chiếu sáng, nuôi cấy 300C, 48 Giống cấp II đƣợc nhân từ giống cấp I tỷ lệ 10% vào bình trung tính 500ml có 300ml môi trƣờng SA lỏng, nuôi tĩnh, chiếu sáng, 300C, 48 Giống cấp III đƣợc nhân từ giống cấp II tỷ lệ 10% vào bình trung tính lít chứa 600ml môi trƣờng SA lỏng, chiếu sáng, nuôi cấy 300C, 48  Lên men chìm B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD Lên men chìm đƣợc tiến hành hệ thống lên men sục khí tự động hãng Sartorius – Đức (hình 3.5) 65 Hình 3.7: Hệ thống lên men sục khí hãng Sartorius – Đức Giống B.subtilis DA đƣợc nhân theo cấp để đạt đƣợc lƣợng giống cần cho mẻ lên men (50 lít/ mẻ) Giống đƣợc chuyển từ bình lên men nhỏ sang bình lên men lớn qua đƣờng dẫn tiệt trùng khép kín Lên men sục khí tiến hành bình lên men lớn, sục khí 130%, khuấy 500 v/p, 370C, 24 Lên men chìm L.acidophillus TN thực bình nagel tiệt trùng có dung tích 20 lít chứa 16 lít môi trƣờng MRS Hỗn dịch vi khuẩn sau nhân giống cấp III đƣợc chuyển sang bình lên men tỷ lệ 10% Lên men 24 34 0C điều kiện tĩnh Canh trùng R.palustris RD sau nhân giống cấp III đƣợc chuyển sang bình trung tính dung tích 20 lít có chứa 16 lít môi trƣờng SA lỏng, nuôi cấy tĩnh 300C, chiếu sáng liên tục ngày  Lên men chìm B.subtilis DA L.acidophillus TN Lên men B.subtilis DA môi trƣờng xốp đƣợc thực túi PE kích thƣớc 40×60 cm Giống B.subtilis DA đƣợc trộn với bột gạo, bột 66 cám đƣợc loại bỏ trấu, bổ sung giống với tỷ lệ 30% để đảm bảo độ ẩm thích hợp cho trình lên men Đóng hỗn hợp lên men vào túi PE độ thông khí 1/3 ( thể tích môi trƣờng/ thể tích túi), lên men 48 Lên men L.acidophillus TN môi trƣờng xốp đƣợc thực túi PE, 48 Trộn bột đậu tƣơng, bột gạo, bổ sung đƣờng glucoza sucrose, bổ sung giống tỷ lệ 30%, trộn Đóng vào túi PE với độ thông khí 1/2 ( thể tích môi trƣờng/ thể tích túi)  Sản xuất chế phẩm Chế phẩm lên men B.subtilis DA đƣợc làm khô Đồng thời chế phẩm lên men L.acidophillus TN đƣợc làm khô Sau nghiền thành bột trộn với cho tổng số tế bào vi khuẩn gam chế phẩm đạt 108 loài B.subtilis DA L.acidophillus TN Đóng túi tráng kẽm 1kg/1 túi Chế phẩm dạng dịch đƣợc sản xuất từ dịch lên men L.acidophillus TN đƣợc bổ sung chất bảo quản, sau trộn với dịch lên men B.subtilis DA R.palustris RD tỷ lệ (L.acidophilus TN: R.palustris RD : B.subtilis DA – 4:2:4) chiết chai lít/1 chai  Kiểm tra chất lượng chế phẩm Kiểm tra độ tinh khiết chế phẩm môi trƣờng thạch tƣơng ứng chủng B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD Cân 1g chế phẩm, pha loãng với nƣớc muối sinh lý cho trải mặt đĩa thạch , vi khuẩn mọc riêng rẽ Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm tế bào quan sát dƣới kính hiển vi Chế phẩm bao gồm B.subtilis DA, L.acidophillus TN, R.palustris RD mà loại khác Kiểm tra số lƣợng tế bào 1g ml chế phẩm Cân 1g hút 1ml chế phẩm, pha loãng theo bậc đến 10 -8 với nƣớc muối sinh lý Nhỏ 0,1 ml dung dịch chế phẩm pha loãng nồng độ pha loãng sang đĩa thạch môi trƣờng tƣơng ứng chủng vi khuẩn Nuôi cấy 48 L.acidophillus TN R.palustris RD, 24 B.subtilis DA Đếm số khuẩn lạc có đĩa petri 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn có đặc tính tính chất phù hợp để sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học: Chủng B.subtilis DA có hoạt lực enzyme phân hủy hữu mạnh; Chủng L.acidophillus TN có hoạt tính đối kháng với vi khuẩn; Chủng R.palustris RD có khả sử dụng nguồn hữu nguồn nƣớc thải, cải thiện màu nƣớc Các chủng lựa chọn có đặc tính chịu mặn cao an toàn động vật thí nghiệm Xác định đƣợc điều kiện tối ƣu lên men sản xuất chế phẩm - Môi trƣờng điều kiện thích hợp để nhân giống B.subtilis DA MPA3, nhiệt độ 28-370C, tỷ lệ giống từ 7,5% Độ thông khí 130% oxy - Điều kiện nuôi cấy thích hợp với L.acidophillus TN môi trƣờng MRS, nhiệt độ 340C, tỷ lệ giống 5-10%, độ thông khí 12-16/20 (lít) - Điều kiện nuôi cấy tối ƣu để nhân giống R.palustris RD môi trƣờng SA bổ sung biotin, p-aminobenzoix acid, pH môi trƣờng 6-8,5 Nhiệt độ nuôi cấy 25-300, độ thông khí 12-16/20 (lít) Tạo đƣợc chế phẩm probiotic từ sinh khối bảo quản chế phẩm - Lên men chìm tạo chế phẩm dạng dịch: L.acidophillus TN, B.subtilis DA, R.palustris RD đạt chất lƣợng 109 CFU/ml - Lên men môi trƣờng xốp tạo chế phẩm dạng bột: L.acidophillus TN, B.subtilis DA đạt chất lƣợng 109 CFU/ml - Đã xây dựng đƣợc công thức bảo quản chế phẩm thời gian 12 tháng Xây dựng đƣợc tiêu chuẩn sở quy trình kiểm nghiệm chế phẩm probiotic Xây dựng đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm probiotic từ chủng nghiên cứu Kiến nghị - Nghiên cứu thêm thành phần bổ sung vào chế phẩm nhằm đa dạng hóa nâng cao hiệu sử dụng sản phẩm - Thử nghiệm đánh giá chất lƣợng chế phẩm thực địa 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Chính (2004), “Một số suy nghĩ vấn đề nuôi tôm sú (P.monodon) bền vững Việt Nam”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản Vũng Tàu, tr.75-78 Nguyễn Tử Cƣơng (2005), Sổ tay hướng dẫn thực hành nuôi tốt tôm sú (GAP) thâm canh Việt Nam, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr.15-20 Nguyễn Văn Hảo (2004), Một số bệnh thường gặp tôm sú (Pemacus monodon), phương pháp chuẩn đoán biện pháp phòng trị, Nxb Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Giáo trình thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Huế Lê Thành Lựu (2004), “Thành tựu, thách thức, định hƣớng kiến nghị công tác Khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.25-39 Lƣơng Đức Phẩm (2002), Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học, Nxb Giáo dục, tr.322-328 Lƣơng Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Lê Xuân Sinh, Nguyễn Thị Phƣơng Nga (2004) “Những nhận xét liên quan đến việc cung cấp sử dụng hóa chất, thuốc nuôi trồng thủy sản Đồng Bằng sông Cửu Long”, Tuyển tập hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.229-256 Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Bùi Quang Mạnh (2004), “Nghiên cứu xây dựng giải pháp kỹ thuật nuôi tôm sú, cá basa cá tra đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.117-132 10 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tôm biện pháp phòng trị, Nxb Nông Nghiệp 69 11 Nguyễn Văn Thành (2000), “Đánh giá trình độ công nghệ nuôi tôm bán thâm canh Việt Nam”, Các công trình nghiên cứu khoa học ngành thủy sản 1996-2000, tr.151-166 12 Võ Thị Thứ (2003), “Đặc điểm sinh học số chủng Bacillus Lactobacillus có khả ứng dụng để xử lý môi trƣờng nuôi tôm cá”, Báo cáo khoa học, hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr.388-391 13 Võ Thị Thứ , Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng, La Thị Nga, Lệ Thị Thu Hiền, Phạm Thị Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn Trƣờng Sơn, Đào Thị Thanh Xuân, Nguyễn Liêu Ba (2004), “Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifomis, Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nƣớc nuôi thủy sản”, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu, tr.815-821 Tiếng Anh 14 Aralampalam P.(1998), “Water quality and Bacterial populations in a Tropical marine eage culture farm”, In Aquaculture Reseach 29, pp.617-624 15 Austin F., Stuckey L S (1995), A probiotic strains of Vibrio alginolyticus effective in reducing diseases cáued by Aeromonas salnimonicisa, Vibrio anguillarum and Vibrio ordallii, Journal of Fish Disease 18, pp.93-96 16 Ian L B., Kenneth J., Robert N G (2000), Probiotic compositions, US patent No: 6, 060, 050 17 Fekelharing G., Van L (2003), “Method of preparing a probiotic preparation”, Patent Cooperation Treaty (PCT): WO 03/085097 18 Imhoff J.F., Truper H.G., and Pfennig N.(1984), “Rearrangement of the species and genera of the phototrophic purplr non – sunfur bacteria”., Int J.Syst Bacteriol 34., pp.340-343 19 Keeton J A., Williams D P (2003), Probiotic formulation and Method for reduction of Pathogenic bacteria US Pattent No: US 200310491 20 Gordon R E., Hayner W C., Pang N H (1973), The genus Bacillus, United states Deparment of Agriculture Washington DC 70 21 Gordon R E (1981), One hundred and seven years of the genus Bacillus, The aerobic endospore forming bacteria, Clasification and identification: 115 London Academic Press 22 Molin G., Jeppsson B., Johansson L M, Ahrne S., Noback S., Stahl M and Bengmark S (1993), Numerial Taxonomy of Lactobacillus sp, Associated with healthy and diseased of the human intestines 23 Logan Walter T, Barlett Stephen L (1998), Water treatment with larger numbers of nonpathogenic bacteria to improve yield of aquatic animals, US patent No: US 5746155 24 Mark O., Genadi B (2001), Bacterial strain, prrocessed plant extracts, composition containing sam, processed for their preparation and their therapeutic and industrial application, US patent No: 2001/0001711A1 25 Sirirat Dengripat et al (1998), Effects of probiotic bacterium on black tiger shimp penaeus monodon survival and growth, in Aquaculture167,pp.301-313 26 Watson Brenda F., Watson T S (2002), Probiotic formulation, US patent No: US 6468525 27 Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals” J Appl Bacteriol, 66, pp 65–78 28 Fuller R (1992), “History and development of probiotics”, In: R Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis pp 1−8 29 Schillinger U (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science and Technology, 64, pp 158-164 30 Pfenning N (1969), “Rhodopseudomonas acidophila sp.n., a new species of budding nonsulffua bacteria”, J.bacteria 99, pp.507-602 Website 31 http://www.fistenet.gov.vn/e-nuoi-trong-thuy-san/b-nuoi-thuy-san/tinh-hinhsan-xuat-nuoi-trong-thuy-san-6-thang-111au-nam-2013/ 71 PHỤ LỤC Hình 1: Hình thái khuẩn lạc Bacillus subtillis thạch máu Hình 2: Hình thái vi khuẩn Bacillus dƣới kính hiển vi ( phóng đại 1000 lần) 72 Hình 3: Hình thái khuẩn lạc L.acidophillus thạch MRS Hình 4: Hình thái vi khuẩn L.acidophillus dƣới kính hiển vi ( phóng đại 1000 lần) 73 Hình 5: Khả sinh Cellulase B.lichenifomis (5), B.subtillis (6), L.acidophillus (7), B.megaterium (8) Hình 6: Khả sinh Protease B.subtilis DA, B.lichenifomis G1, B.megaterium PA 74 Hình 7: Khả sinh Amylase B.lichenifomis (5), B.subtillis (6), L.acidophillus (7), Đối chứng dương (8) ... tài: Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Lactobacillus, Bacillus Rhodospirillaceae dùng để sản xuất chế phẩm sinh học cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản ” Mục tiêu nghiên cứu - Tuyển chọn. .. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS, BACILLUS VÀ RHODOSPIRILLACEAE DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI THIỆN MÔI... chủng vi khuẩn chủng có hoạt tính sinh enzym phân giải hữu cơ, sinh chất kháng khuẩn khử H2S dùng để sản xuất chế phẩm sinh học - Tạo chế phẩm sinh học có chất lƣợng tốt để cải thiện, xử lý môi