Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) bằng kỹ thuật chuyển gen (Đề tài NCKH)
i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG MỌT (Sitophilus zeamais Motsch.) BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Mã số: B2014-TN06-04 Chủ nhiệm đề tài: - PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - TS Nguyễn Thị Hải Yến Thái Nguyên, tháng năm 2017 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG NGÔ KHÁNG MỌT (Sitophilus zeamais Motsch.) BẰNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN Mã số: B2014-TN06-04 Xác nhận tổ chức chủ trì (ký, họ tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) - PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - TS Nguyễn Thị Hải Yến Thái Nguyên, tháng năm 2017 i DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Thành viên tham gia nghiên cứu đề tài đơn vị phối hợp TT Họ tên Đơn vị công tác lĩnh vực chuyên môn Trƣờng Đại học Sƣ phạm-ĐH Thái Nguyên GS.TS Chu Hoàng Mậu TS Hoàng Thị Thu Yến Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên Di truyền học ThS Vũ Thanh Sắc Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên Công nghệ tế bào thực vật ThS Nguyễn Phƣơng Thảo Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên Công nghệ sinh học CN Lê Đức Huấn Trƣờng Đại học Khoa học- ĐH Thái Nguyên Di truyền học NCS Vì Thị Xuân Thủy Học viên cao học Trƣờng Đại học Sƣ phạm-ĐH Thái Nguyên Trƣờng Đại học Khoa học-ĐH Thái Nguyên Di truyền học Đơn vị phối hợp Tên đơn vị nƣớc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Phòng công nghệ AND ứng dụng, Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Nội dung phối hợp nghiên cứu Họ tên ngƣời đại diện đơn vị - Xác định trình tự gen PGS.TS Chu Hoàng - Sử dụng thiết bị Phòng thí Hà nghiệm trọng điểm Phối hợp nghiên cứu số nội PGS.TS Lê Văn Sơn dung sau: - Thiết kế vector chuyển gen - Tạo dòng ngô chuyển gen mang gen kháng mọt ii MỤC LỤC Trang Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu đề tài đơn vị phối hợp i Mục lục………………………………………………………………………… ii Danh mục bảng………………………………………………………………… Danh mục hình………………………………………………………………… Danh mục ký hiệu, từ chữ viết tắt………………………………………… Thông tin kết nghiên cứu bằ ng tiếng Việt tiếng Anh………………… MỞ ĐẦU……………………………………………………………………… 1 Tính cấp thiết vấn đề nghiên cứu……………………………………… Những đóng góp khoa học đề tài……………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài ………………………………… Chƣơng MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………………………… 1.1 Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………………… 1.2 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu………………………………………… 1.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………… 1.2.2 Vật liệu thực vật………………………………………………………… 1.2.3 Các chủng vi khu n loại vector………………………………… 1.2.4 Thiết kế cặp mồi PCR trình tự nucleotide mồi……………… 1.2.5 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………………… 1.3 Phạm vi địa điểm nghiên cứu………………………………………… 1.3.1 Phạm vi nghiên cứu…………………………………………………… 1.3.2 Địa điểm nghiên cứu…………………………………………………… 1.4 Cách tiếp cận phƣơng pháp nghiên cứu……………………………… 1.4.1 Cách tiếp cận nghiên cứu……………………………………………… 1.4.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ……………………………………………… 1.4.2.1 Phƣơng pháp đánh giá khả kháng mọt………………………… 1.4.2.2 Phƣơng pháp nhân gen, tách dòng giải tự trình tự gen ……… 1.4.2.3 Thiết kế vector chuyển gen thực vật ………………………………… iii 1.4.2.4 Phƣơng pháp tạo chuyển gen thông qua vi khu n A tumefaciens 10 1.4.2.5 Phƣơng pháp phân tích chuyển gen……………………………… 14 1.4.2.6 Đánh giá khả ức chế α-amylase protein tái tổ hợp………… 16 Chƣơng NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……………………… 17 2.1 Tổng quan tính hình nghiên cứu………………………………………… 17 2.1.1 Giá trị ngô tác hại mọt ngô……………………………… 17 2.1.1.1 Giá trị ngô…………………………………………………… 17 2.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh thái, chu kỳ sống lây nhiễm mọt ngô 18 2.1.1.3 Tổn thất mọt ngô…………………………………………………… 21 2.1.2 Proteinase chất ức chế proteinase …………………………………… 21 2.1.3 Defensin thực vật……………………………………………………… 24 2.1.4 Nghiên cứu chuyển gen vào phôi non ngô thông qua A tumefaciens… 26 2.2 Nội dung nghiên cứu……………………………………………………… 27 2.3 Kết nghiên cứu……………………………………………………… 29 2.3.1 Đánh giá khả kháng mọt mẫu giống ngô nghiên cứu…… 29 2.3.2 Phân lập gen liên quan đến khả kháng mọt từ ngô…………… 32 2.3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen liên quan đến khả 39 2.3.4 Phát triển hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ngô thông qua nghiên cứu chuyển gen gus vào phôi ngô giống LVN99 48 2.3.5 Kết chuyển chuyển cấu trúc mang gen ZmDEF1 vào phôi ngô nhờ A tumefaciens tạo ngô chuyển gen 54 2.3.6 Phân tích ngô chuyển gen…………………………………………… 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 Kết luận 63 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 THUYẾT MINH, HỢP ĐỒNG THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ VĂN BẢN ĐIỀU CHỈNH ĐÃ ĐƢỢC PHÊ DUYỆT………………………………………… 72 iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các giống ngô sử dụng nghiên cứu……………………… Bảng 1.2 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu……………… Bảng 1.3 Thành phần môi trƣờng tái sinh ngô chuyển gen……………… 11 Bảng 2.1 Khối lƣợng hao hụt (g) giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm mọt…………………………………………………………… 29 Bảng 2.2 Tỷ lệ bột ngô (%) tạo giống nghiên cứu thời điểm 30 nhiễm mọt……………………………………………………………………… Bảng 2.3 Tỷ lệ nhiễm mọt (%) giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm……………………………………………………………………………… 31 Bảng 2.4 Hệ số gia tăng quần thể mọt giống ngô nghiên cứu sau thời gian gây nhiễm…………………………………………………………… 31 Bảng 2.5 Chỉ số mẫn cảm mọt tƣơng đối (S) giống ngô nghiên cứu… 32 Bảng 2.6 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt thuốc chuyển gen T1 46 Bảng 2.7 Ảnh hƣởng mật độ A tumefaciens, nồng độ AS, thời gian nhiễm khu n đến hiệu chuyển gen gus 49 Bảng 2.8 Ảnh hƣởng tuổi phôi đến hiệu suất biểu gen gus tạo mô sẹo giống ngô LVN99 50 Bảng 2.9 Nồng độ kanamycin cho ngƣỡng chọn lọc phôi ngô LVN99 mang gen gus 50 Bảng 2.10 Kết tái sinh chuyển gen ZmDEF1 giống ngô LC1 LVN99 56 Bảng 2.11 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt ngô chuyển gen T1…………………………… 62 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái hạt giống ngô nghiên cứu…………………………… Hình 1.2 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen mang gen ZmDEF1 Hình 1.3 Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào phôi non ngô……………… 13 Hình 2.1 Hình ảnh Sitophilus zeamais Motsch ……………………………… 19 Hình 2.2 Hai lớp defensin thực vật ………………………………………… 25 Hình 2.3 Cấu trúc chuỗi polypeptide defensin thực vật………………… 25 Hình 2.4 Cấu trúc không gian defensin thực vật (VrD2) ………………… 26 Hình 2.5 A: Kết điện di kiểm tra sản ph m RT-PCR nhân gen ZmCysII mẫu giống ngô nghiên cứu B: Kết điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp cắt BamHI ………………………………………………………… 33 Hình 2.6 Trình tự gen ZmCysII mẫu ngô nghiên cứu D38130 Ngân hàng Gen Quốc tế……………………………………………………… 34 Hình 2.8 Trình tự gen ZmDEF1 giống ngô nghiên cứu JF797205 Ngân hàng gen Quốc tế…………………………………………………… 37 Hình 2.9 Trình tự amino acid suy diễn protein ZmDEF1 giống 37 nghiên cứu JF797205 Ngân hàng gen Quốc tế Hình 2.10 Trình tự gen ZmDEF1 giống ngô SL giống ngô lai LVN99 phân lập từ DNA……………………………………………………………… 38 Hình 2.11 Sơ đồ cấu trúc gen ZmDEF1 ngô………………………… 38 Hình 2.12 Kết điện di kiểm tra sản ph m PCR nhân gen ZmCysII từ dòng thuốc chuyển gen………………………………………………… 40 2.13 Hình ảnh điện di sản ph m cắt plasmid tái tổ hợp Hind III (A) hình ảnh điện di sản ph m colony-PCR cặp mồi ZmDEF1FSalI/ZmDEF1R-HindIII từ khu n lạc A tumefaciens CV58 (B)…………… 41 Hình 2.14 Sơ đồ cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 Phaso Pro: Promoter Phaseolin……………………………………………………………………… 41 Hình 2.15 Kết tái sinh chuyển cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 vào thuốc C9-1………………………………………………………………… 42 vi Hình 2.16 Kết điện di sản ph m PCR xác định có mặt gen ZmDEF1 thuốc chuyển gen………………………………… 43 Hình 2.17 Kết điện di kiểm tra sản ph m RT-PCR nhân gen ZmDEF1 dòng thuốc chuyển gen…………………………………………… 44 Hình 2.18 Biểu đồ biểu mức độ biểu gen ZmDEF1 từ dòng thuốc chuyển gen …………………………………………………………… 45 Hình 2.19 Kết lai Western thuốc chuyển gen ………………… 45 Hình 2.20 Hình ảnh định tính đánh giá khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt thuốc chuyển gen ……………… 47 Hình 2.21 Sơ đồ tái sinh chuyển gen gus vào giống ngô LVN99 thông qua A tumefaciens………………………………………………………………………… 52 Hình 2.22 Hình ảnh tái sinh ngô từ phôi ngô non chuyển gen gus vào giống ngô LVN99 thông qua A tumefaciens 54 Hình 2.23 Hình ảnh tái sinh ngô chuyển gen ZmDEF1 từ phôi ngô non giống LVN99 vụ hè - thu năm 2016 55 Hình 2.24 Kết điện di sản ph m PCR xác định có mặt gen chuyển ZmDEF1 ngô chuyển gen……………………………………… 58 Hình 2.25 Kết lai Southern ngô chuyển gen ZmDEF1…………… 59 Hình 2.26 Kết lai Western ngô chuyển gen ZmDEF1 hệ T1… 60 vii DANH MỤC KÝ HIỆU, TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ABA AS bp cs Ct DAB Abscisic Acid Acetylseringone base pairs ETDA FAO GFP GM Gus gen Threshold of Cycle 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Food and Agriculture Organization Green Fluorescene Protein Germination Medium β-Glucuronidase gene IPTG LB IsoPropylThio-β-Galactoside Luria Bertami MS Murashige Skoog, 1962 OD PCR rZmDEF1 RM RT-PCR Optical Density Polymerase Chain Reaction Recombinant ZmDEF1 protein Rooting Medium Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Transfer DNA T-DNA Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid TMB 3,3’,5,5’-TetraMethyl Benzidine T0, T1 T0 T1 X-gal ZmDEF1 ZmCysII Cặp bazơ nitơ Cộng Chu kỳ ngƣỡng Tổ chức Nông - Lƣơng giới Protein huỳnh quang xanh Môi trƣờng n y mầm Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidace Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy vi khu n Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô thực vật Mật độ quang Phản ứng chuỗi polymerase Protein tái tổ hợp ZmDEF1 Môi trƣờng tạo rễ Phản ứng chuỗi polymerasephiên mã ngƣợc Đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật Plasmid gây khối u Các hệ chuyển gen Cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside Gen defensin1 ngô Gen cystatin II ngô viii THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tạo giống ngô kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) kỹ thuật chuyển gen - Mã số: B2014-TN06-04 - Chủ nhiệm đề tài: - PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - TS Nguyễn Thị Hải Yến - Tổ chức chủ trì: Đại học Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: 24 tháng Mục tiêu: Mục tiêu tổng quát Tạo đƣợc dòng ngô chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) làm nguyên liệu chọn giống Mục tiêu cụ thể (1) Đánh giá đƣợc khả kháng mọt giống ngô địa phƣơng khu vực trung du miền núi phía bắc Việt Nam; (2) Phân lập phân tích đƣợc đặc điểm gen liên quan đến khả kháng mọt ngô; (3) Tạo đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc gen liên quan đến khả kháng mọt dƣới điều khiển promoter hoạt động đặc hiệu cho nội nhũ hạt; (4) Tạo đƣợc dòng ngô chuyển gen kháng mọt (Sitophilus zeamais Motsch.) Tính sáng tạo: 1) Đánh giá khả kháng mọt giống ngô nghiên cứu xác định đƣợc giống ngô SL có khả kháng mọt ngô tốt hai giống LC1 LVN99 có khả kháng mọt ngô 2) Gen ZmCysII ZmDEF1 phân lập từ giống ngô nghiên cứu đƣợc sử dụng thiết kế cấu trúc vector chuyển gen biểu hạt thực vật đƣợc biểu thành công thuốc lá, ngô chuyển gen 3) Protein tái tổ hợp rZmDEF1 tách chiết từ thuốc ngô chuyển gen có khối lƣợng phân tử khoảng10 kDa biểu chức ức chế hoạt động αamylase ấu trùng mọt ngô Kết nghiên cứu: (1) Đã đánh giá mẫu giống ngô, có giống ngô địa phƣơng (SL, LC1, LC2, LC3) giống ngô lai LVN99 Giống SL có khả kháng mọt tốt hai giống LVN99, LC1 có khả kháng mọt 59 gen có gen ZmDEF1 nội sinh nên chọn gen kháng kháng sinh kanamycin (nptII) gen mà ngô không chuyển gen để phân tích lai Southern Đã nhân thành công đoạn gen nptII kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu phục vụ cho việc tổng hợp mẫu dò gắn Biotin Trên màng lai sau màng, băng tƣơng ứng với copy gen chuyển gắn vào hệ gen Các ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 dƣơng tính với phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF1F-SalI/ZmDEF1R-HindIII đƣợc tiến hành kiểm tra có mặt gen chuyển số copy genome phƣơng pháp lai Southern, kết thể hình 2.25 Kết hình 2.25 cho thấy, chuyển gen giống LC1 dƣơng tính với lai Southern, có số (T0-C1) có băng DNA tƣơng ứng với có copy gen chuyển ZmDEF1 hệ gen chuyển Các lại, có băng DNA, điều cho thấy gen chuyển ZmDEF1 có copy hệ gen chuyển Hiệu suất chuyển gen giống đến thời điểm phân tích lai Southern 158 3,16% Giống LVN99 có dƣơng tính với PCR (T0-L1, T0-L3, T0-L4) đƣợc lai Southern kết cho thấy chuyển gen dƣơng tính với lai Southern, với có copy Hiệu suất chuyển gen giống LVN99 167 1,79% Hình 2.25 Kết lai Southern ngô chuyển gen ZmDEF1 M: Marker 1kb, (+): vector pBetaPhaso-ZmDEF1 mang gen nptII; (-): ngô LVN99 không chuyển gen; C1- C5: Các ngô chuyển gen giống LC1 hệ T0; L1, L3, L4: Các ngô chuyển gen giống LVN99 hệ T0 Nhƣ vậy, kết phân tích Southern blot chứng rằng, gen chuyển ZmDEF1 đƣợc gắn vào hệ gen chuyển gen 60 2.3.6.2 Phân tích biểu protein ZmDEF1 tái tổ hợp hệ chuyển gen T1 Các ngô chuyển gen sau xác định gen chuyển ZmDEF1 gắn vào hệ gen lai Southern, đƣợc chăm sóc bắp để lấy hạt phân tích biểu gen hệ T1 Cây ngô chuyển gen giống LC1 có không kết hạt số số 4, kết hạt (T1-C1, T1-C3, T1-C5) Giống LVN99 có chuyển gen số không kết hạt, kết hạt T1-L1 T1-L3 số không mang gen chuyển Hạt ngô chuyển gen đƣợc tách protein để thực lai Western kiểm tra hoạt động gen chuyển mức độ dịch mã Protein rZmDEF1 có đặc điểm phân biệt với protein ZmDEF1 nội có chứa đuôi c-myc phía đầu C chuỗi polypeptide Do thực lai Western cho phép phát protein màng lai nitrocellulose có mang đuôi c-myc gắn kháng thể phù hợp phản ứng màu với chất, kết lai Western ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 hình 2.26 Hình 2.26 Kết lai Western ngô chuyển gen ZmDEF1 hệ T1 M: thang chu n protein 10- 250 kDa; C1,C3,C5: Các ngô chuyển gen giống LC1ở hệ T1; L1, L3: Các ngô chuyển gen giống LVN99 hệ T1 ; (+): protein chứa đuôi c myc kích thƣớc khoảng 35 kDa; (-): protein ngô LVN99 không chuyển gen Kết lai Western hình 2.26 cho thấy, dòng ngô chuyển gen T1-C1, T1-C3, T1-C5) giống LC1 ngô chuyển gen (T1-L1, T1- L3) giống LVN99 màng lai nitrocellulose xuất băng màu vị trí kích thƣớc khoảng 10 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc protein ZmDEF1 tái tổ hợp biểu thuốc chuyển gen Điều chứng tỏ gen chuyển ZmDEF1 ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 biểu dịch mã cho protein ZmDEF1 tái tổ hợp Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã với giống LC1 158 1,89% giống LVN99 167 1,19% 61 2.3.6.4 Kiểm tra chức sinh học protein ZmDEF1 tái tổ hợp T1 Bằng thực lai Western kiểm tra đƣợc gen chuyển ZmDEF1 biểu mức độ dịch mã hệ T1 ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 Với đặc điểm cấu trúc chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 biểu đặc trƣng hạt, nên hạt chuyển gen (thế hệ T1) đƣợc sử dụng để kiểm tra chức sinh học protein ZmDEF1 tái tổ hợp Với số lƣợng hạt chuyển gen dao động từ 12 - 36 hạt, số lƣợng hạt không đủ để thực thí nghiệm nghiên cứu khả kháng mọt hạt ngô chuyển gen cách lây nhiễm mọt nhân tạo Vì vậy, kiểm tra chức sinh học protein rZmDEF1 ngô chuyển gen cách nghiên cứu khả ức chế hoạt độ αamylase ấu trùng mọt ngô Với cách tiến hành tƣơng tự nhƣ hạt thuốc chuyển gen, thu đƣợc kết đánh giá khả ức chế hoạt độ α amylase ấu trùng mọt hạt ngô chuyển gen hệ T1 bảng 2.11 Cây ngô không chuyển gen có gen ZmDEF1 nội tại, nên biểu protein ZmDEF1 nội tại, protein nội có khả ức chế α-amylase ấu trùng mọt ngô (Bảng 2.11) với hỗn hợp gồm α-amylase mọt protein ngô LVN99 không chuyển gen hoạt độ α-amylase 5,87 (ĐVHĐ) hỗn hợp gồm α-amylase mọt protein ngô LC1 không chuyển gen 5,12 (ĐVHĐ) mẫu có α-amylases mọt chất tinh bột đạt 7,98 (ĐVHĐ) Bảng 2.11 cho thấy, hỗn hợp gồm α-amylase ấu trùng mọt protein hạt ngô chuyển gen hệ T1 giống LC1, số (T1-C1) có hoạt độ αamylase 1,89 (ĐVHĐ) so với hoạt độ α-amylase hỗn hợp chứa protein ngô không chuyển gen LC1 36,91% Cây chuyển gen số (T1-C3) có hoạt độ α-amylase 2,23 (ĐVHĐ) 43,55% so với hoạt độ α-amylase gồm hỗn hợp protein ngô không chuyển gen LC1 Cây chuyển gen số (T1-C5) có hoạt độ α-amylase 2,11 (ĐVHĐ) 41,21% so với hoạt độ α-amylase hỗn hợp protein ngô không chuyển gen LC1 Cây chuyển gen số (T1-L1) giống LVN99 có hoạt độ α-amylase 2,67 (ĐVHĐ), so với hoạt độ α-amylase hỗn hợp gồm protein ngô LVN99 không chuyển gen 45,48% Cây chuyển gen số (T1-L3) có hoạt độ α-amylase 2,63 (ĐVHĐ) so với hoạt độ α-amylase hỗn hợp gồm protein ngô LVN99 không chuyển gen 44,80% So với không chuyển gen giống LC1, protein rZmDEF1 T1-C1 có hiệu suất ức chế α-amylase ấu trùng mọt ngô 63,09%, T1-C3 56,45% T1-C5 với 58,79% Ở giống LVN99 protein rZmDEF1 T1-L1 với hiệu suất ức chế α-amylase ấu trùng mọt ngô 54,52%, T1-L3 đạt 55,20% 62 Bảng 2.11 Kết phân tích khả ức chế α-amylase mọt ngô protein tái tổ hợp ZmDEF1 từ hạt ngô chuyển gen T1 Mẫu Chỉ có αamylases mọt Hỗn hợp gồm α -amylase mọt protein giống ngô LC1 Cây không chuyển Cây chuyển gen T1-C1 T1-C3 T1-C5 Hỗn hợp α -amylase mọt protein giống LVN99 Cây không chuyển T1-L1 T1-L3 5,87 2,67 2,63 gen gen 5,12 1,89 2,23 2,11 0,59 0,62 0,37 0,47 0,65 0,29 0,43 Hiệu suất hoạt động α- amylase (%) 100 36,91 43,55 41,21 100 45,48 44,80 Hiệu 63,09 56,45 58,79 54,52 55,20 Hoạt độ 7,98 α- amylase 0,67 (ĐVHĐ mg) suất Cây chuyển gen ức chế hoạt động α amylase rZmDEF1 (%) T1-C1, T1-C3, T1-C5: Các ngô chuyển gen hệ T1 giống LC1; T1-L1, T1L3:Các ngô chuyển gen hệ T1 giống LVN99) Nhƣ vậy, khẳng định protein rZmDEF1 biểu chức sinh học ức chế hoạt độ α-amylase ấu trùng mọt ngô Đây sở quan trọng để thực chiến lƣợc nâng cao khả kháng mọt ngô nhờ công nghệ chuyển gen Từ phân tích trên, kết hệ T1 tạo đƣợc dòng ngô chuyển gen ZmDEF1 từ hai giống ngô LC1 LVN99 Các dòng ngô chuyển gen T1 tiếp tục đƣợc theo dõi, phân tích, đánh giá tạo nguyên liệu phục vụ chọn giống ngô chuyển gen kháng mọt 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Đã đánh giá mẫu giống ngô, có giống ngô địa phƣơng (SL, LC1, LC2, LC3) giống ngô lai LVN99 Giống SL có khả kháng mọt tốt với số mẫn cảm mọt 1754,19; giống LVN99, LC1 có khả kháng mọt có số mẫn cảm với mọt lần lƣợt 6088,71 3515,75 1.2 Gen ZmCysII ZmDEF1 giống ngô nghiên cứu đƣợc tách dòng thành công xác định trình tự nucleotide Gen ZmCysII (cDNA) có kích thƣớc 405bp, mã hóa 134 amino acid Gen ZmDEF1 có hai exon có kích thƣớc 243 nucleotide, mã hóa cho 80 amino acid intron chứa 102 nucleotide 1.3 Hai cấu trúc vector biểu đặc trƣng hạt pBetaPhaso-ZmCysII pBetaPhaso-ZmDEF1 đƣợc thiết kế thành công biến nạp tạo dòng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector pBetaPhaso-ZmCysII pBetaPhasoZmDEF1 Hai cấu trúc vector đƣợc đánh giá hoạt động thuốc N tabacum C9-1 Trong protein tái tổ hợp rZmDEF1 đƣợc biểu dòng thuốc chuyển gen (T1-1, T1-3, T1- 10, T1-17) có khả ức chế hoạt động αamylase từ ấu trùng mọt ngô 1.4 Đã xác định đƣợc hệ thống tái sinh từ phôi ngô non có kích thƣớc 0,9 – 1,3 mm tối ƣu cho chuyển gen vào ngô thông qua A.tumefaciens Quy trình chuyển gen gus qua phôi non ngô nhờ A tumefaciens chủng C58 với mật độ thích hợp giá trị OD660nm 0,8 thời gian nhiễm khu n tối ƣu 30 phút, AS bổ sung 150M tuổi phôi từ 10-12 ngày tuổi tối ƣu cho khả tiếp nhận gen tái sinh Ngƣỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin phôi chuyển gen 50mg l 1.5 Cấu trúc pBetaPhaso-ZmDEF1 đƣợc chuyển thành công vào hai giống ngô LC1, LVN99 tạo đƣợc dòng ngô chuyển gen hệ T1, với hiệu suất chuyển gen lần lƣợt 1,89% 1,19% 1.6 Đã phân tích dòng ngô chuyển gen hệ T1 Protein rZmDEF1 có kích thƣớc gần 10 kDa đƣợc biểu dòng chuyển gen từ giống ngô địa phƣơng LC1 (T1-C1, T1-C3, T1-C5) dòng chuyển gen từ giống ngô lai LVN99 (T1-L1, T1-L3) Protein rZmDEF1 biểu ức chế hoạt động αamylase ấu trùng mọt ngô So với protein không chuyển gen, protein rZmDEF1 dòng chuyển gen có hiệu suất ức chế α-amylase cao từ 54,52% đến 63,09% 64 Kiến nghị Tiếp tục phân tích ngô chuyển gen hai giống LC1 LVN99 chuyển gen qua hệ T2, T3, nhằm chọn, tạo đƣợc dòng ổn định khả ức chế hoạt độ α-amylase mọt ngô Tiếp tục đánh giá, bồi dƣỡng chọn lọc nhằm tạo dòng ngô chuyển gen kháng mọt làm vật liệu chọn giống ngô 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Quý Dƣơng (2010), Nghiên cứu thành phần mọt hại đậu bảo quản, đặc điểm hình thái, sinh vật học, sinh thái học loài mọt đậu cô ve (mọt đậu nành) (Acanthoscelides obtectus Say) biện pháp phòng trừ chúng Việt Nam, Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Lê Thị Mai Hƣơng, Lê Thị Lan, Nguyễn Chiến Hữu, Lê Huy Hàm (2013), “Nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn công nghệ gen”, Hội thảo Quốc gia Khoa học Cây trồng lần thứ nhất, tr 405411 Nguyễn Kim Hoa, Nguyễn Văn Liêm, Trần Thị Hƣờng, Nguyễn Thị Hiền (2008), "Đặc điểm sinh học chủ yếu mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch (Col.: Curculionidae) mọt bột sừng Gnathocerus cornutus Fabr (Col.: Tenebrionidae)", Hội nghị Côn trùng học lần thứ 6, tr 560–569 Nguyễn Đức Lƣơng, Dƣơng Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2000), Giáo trình ngô, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Trần Thị Lƣơng, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thùy Ninh, Nguyễn Đức Thành (2014), “Chuyển gen Shrunken (Sh2) mã hóa enzyme ADP-glucose pyr ophosphorylase vào số dòng ngô phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Sinh học, 36(1), tr 99-109 Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non xác định phương pháp chuyển gen thích hợp ngô, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tiếng Anh Aaron J C (2005), “Factors that affect the nutritional value of maize for broilers”, Animal Feed Science and Technology 119, pp 293–305 Abe M., Arai S., 1991, "Some propeties of a cystein proteinase inhibitor from corn endosperm", Agricultural and biological chemistry 55(9), pp 2417-2418 Adedire C O., Akinkurolere R O., Ajayi O O (2011), “Susceptibility of some maize cultivars in Nigeria to infestation and damage by aize weevil, Sitophilus zeamais (Motsch.) (Coleoptera: Curculionidae)”, Nigerian Journal of Entomology 28, pp 55-63 66 10 Ali Q., Ali A., Tariq M., Abbas M A., Sarwar B., Ahmad M., Awaan M F., Ahmad S., Nazar Z A., Akram F., Shahzad A (2014), “Gene action for various grain and fodder quality traits in Zea mays”, Journal of Food and Nutrition Research 2(10), pp 704-717 11 Baosheng W., Jingjuan Y., Dengyun Z., Qian Z (2011), “Maize defensin ZmDEF1 is involved in plant response to fungal phytopathogens”, African Journal of Biotechnology 10 (72), pp 16128-16137 12 Bergvinson D J., García-Lara S (2004), “Genetic approaches to reducing losses of stored grain to insects and diseases”, Curr Opin Plant Biol 7, pp 480–485 13 Bernfeld P (1955), “Amylase α and β”, Methods Enzymol 1, pp 149–154 14 Binott J.J., Songa J., Ininda J., Njagi E.N., Machuka J (2005),“Plant regeneration from immature embryos of Kenyan maize inbred lines and their respective single cross hybrids though somatic embryogenesis”, Afri Crop Sci Conf Prod 7, pp 1305 – 1310 15 Carvalho A O., Gomes V M (2011), “Plant defensins and defensin-like peptides - biological activities and biotechnological applications”, Curr Pharm Des 17(38), pp 4270–4293 16 Casaretto JA, Corcuera LJ., 1995, “Plant proteinase inhibitors: a defensive response against insects”, Biol Res 28(4), pp 239-249 17 Chen K C., Lin C Y., Kuan C C., Sung H Y., Chen C S (2002), “Anovel defensin encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid”, J Agric Food Chem 50, pp 7258–7263 18 Chuong Tran Van, Thuy Nguyen Kim (2003), “Demonstration for corn- corb storage at Farm scale in Vietnam”, Proceeding of the Scientific Meeting of the ACIAR project PHT 1998/137, pp 07-08 19 Edgertom M D (2009), “Increasing crop productivity to meet Global needs for feed, food and fuel”, Plant Physiol 149, pp 7-13 20 Emma W G., Jose C., Ade´.P.K´., Lamine.M., Simeon O K (2012), “Structural characterization of plant defensin protein superfamily”, Mol Biol Rep 39, pp 4461–4469 21 Filho J.X, 1992, “The biology roles of serine and cystein proteinase inhibitors in plant”, R Bras Fisiol Veg 4(1), pp 1-6 67 22 Frame B R., Shou H., Chikwamba R., Zhang Z., Xiang C., Fonger T., Pegg SE., Li B., Nettleton D., Pei P., Wang K (2002), “Agrobacterium-mediated ransformation of maize embryos using a standard binary vector system”, Plant Physiol., 129: 13-22 23 Frame B., Main M., Schick R., Wang K (2011), “Genetic transformation using maize immature zygotic embryos”, Plant Embryo Culture: Methods and Protocol, Methods in Moleculer Biology 710 (22), pp 327-341 24 Feng Lin K., Tian R L., Ping H T., Ming P H., Ching S C., Ping C L (2007), “Structure-based protein engineering for α-amylase inhibitory activity of plant defensin”, PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics 68, pp 530–540 25 French B W., Hammack L., Tallamy D W (2015), “Mating success, longevity, and fertility of diabrotica virgifera leconte (Chrysomelidae: Coleoptera) in relation to body size and Cry3Bb1-resistant and Cry3Bb1-susceptible genotypes”, Insects 6(4), pp 943-960 26 Jefferson R A., Kavanagh T A., Bevan M W (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants” EMBO 6, pp 3901-3907 27 Garciaolmedo S.F., Sanchez M.G.; Gomez R.L.; Roya and Carbonero P (1987), “Plant proteinaceous inhibitors of proteinases and -amylases”, Oxford Survey Plant Molecular and Cell Biology 4, pp 275-334 28 Gordon-Kamm W J., Spencer T M., Mangano M L., Adams T R., Daines R J., Start W G., Lemaux P G (1990), “Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants”, The Plant Cell Online, 2(7), pp 603618 29 Grudkowska M, Zagdanska B (2004), "Multifuntional role of plant cystein proteinase", Acta Biochimica Polonica 51(3), pp 609-624 30 Guy R (1987), Maize, Tropical Agriculturist, C.T.A., Macmillan, London, pp 22- 36 31 Guedes R N C., Oliveira E., EGuedes N M P, Ribeiro B., Serra J E (2006), “Cost and mitigation of insecticide resistance in the maize weevil, Sitophilus zeamais”, Physiological Entomology 31, pp.30–38 32 Gwinner J., Harnisch R., Muck O (1996), “Manual on theprevention of post harvest seed losses, post harvest project, GTZ, D-2000”, Hamburg, FRG, pp 294 68 33 Hannah L C., Futch B., Bing J., Shaw J R., Boehlein S., Stewart J.D., Beiriger R., Georgelis N., Greene T (2012), “A shrunken-2 transgene increases maize yield by acting in maternal tissues to increase the frequency of seed development”, Plant Cell 24(6), pp 2352-2363 34 Horikoshi R J., Bernardi O., Bernardi D., Okuma D M., Farias J R., Miraldo L L., Amaral F.S., Omoto C (2015), “Near-Isogenic Cry1F-Resistant strain of spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) to investigate fitness cost associated with resistance in Brazil”, Econ Entomol 30, pp 382 - 387 35 Huma Habib and Khalid Majid Fazili, 2007, “Plant protease inhibitors: a defense strategy in plants”, Biotechnology and Molecular Biology (3), pp 68-85 36 Irie K, Hosoyama H, Takeuchi T, Iwabuchi K, Watanabe H, Abe M, Abe K, Arai S (1996), “Transgenic rice established to express corn cystatin exhibits strong inhibitory activity against insect gut proteinases”, Plant Mol Biol 30(1), pp.149-157 37 James A O., Adebayo A O (2012), "Rearing the Maize Weevil, Sitophilus zeamais, on an Artificial Maize - Cassava Diet", J Insect Sci 12, pp 69- 72 38 Karina van der Linde, Christoph Hemetsberger, Christine Kastner, Farnusch Kaschani, Renier A.L van der Hoorn, Jochen Kumlehn, and Gunther Doehlemann, 2012, “A Maize Cystatin Suppresses Host Immunity by Inhibiting Apoplastic Cysteine Proteases”, Plant Cell 24(3), pp 1285–1300 39 Lay F T., Anderson M A (2005), “Defensins – components of the innate immune system in plants”, Current Protein and Peptide Science 6, pp 85-101 40 Lay F T., Schirra H J., Scanlon M J., Anderson M A., Craik D J (2003), “The three-dimensional solution structure of NaD1, a new floral defensin from Nicotiana alata and its application to a homology model of the crop defense protein alfafp”, J Mol Biol 325, pp 175–188 41 Livak K J., Schmittgen T D (2001), “Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the (-Delta Delta C (T)) Method”, Methods 25, pp 402 – 40882 Maceljski M., Korunic Z (1973), “Contribution to the morphology andecology of Sitophilus zeamais Motsch in Yugoslavia”, J Stored Prod Res, 9, pp 225- 234 42 Makanjuola W A., Isong I U., Omoloye A A., Kemabonta K A., Ogunyadeka A O (2009), “Inherent susceptibility of elite rice varieties to post harvest 69 damage by Sitophilus zeamais Motsch, (Coleoptera: Curculiondae) ”, Nigerian Journal of Ecology 10, pp 11-15 43 Machleidt W., Thiele U., Laber B., Arsfald, Machleidt I., Ester L., Wiegand G., Kos J., Turk V., Bode W., 1989, "Mechanism of inhibition of papain by chicken egg white cystatin: Inhibition constants of N-terminally truncated forms and cyano gen bromid fragments of the inhibitor.", Bio Chem 243(2), pp.234-238 44 Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I., 2005, "Comparative phylogenetic analysis of cystatin gen families from arabidopsis, rice and barley", Mol genet genomic 273(5), pp 423-432 45 Massonneau A, Condamine P, Wisniewski JP, Zivy M, Rogowsky PM., 2005, “Maize cystatins respond to developmental cues, cold stress and drought”, Biochim Biophys Acta 1729(3), pp 186-199 46 Misaka T., Kuroda M.,Iwabuchi K., Abe K., Arai S., 1996, "Soyacystatin, A novel cystein proteinase inhibitor in soybean, is distinct in protein structure and gene organization from other cystatins of animal and plant origin", European Journal of biochemistry 240, pp.609-615 47 Mikami A Y., Carpentieri P V., Ventura M U (2012), “Resistance of maize landraces to the maize weevil Sitophilus zeamais Motsch,(Coleoptera: Curculionidae) ”, Neotrop Entomol 41 (5), pp 404-408 48 Murray M G., Thompson W F (1980), "Rapid isolation of high molecular weight plant DNA", Nucleic Acids Res 8(19), pp 4321 - 4325 49 Nicole L V W., Marilyn A A (2013), “Plant defensins: Common fold, multiple functions”, Fungal biology reviews, 26, pp.121-131 50 Nguyen Q D., Dang T D (2009), “Some research result on alien invasive species Bean weevil Acanthosscelides obtectus Say (Coleoptera, Bruchidae) in Vietnam”, Sience Journal, (37), pp 105- 114 51 Nwosu L.C., Nwosu U I (2012), “Assessment of maize cob powder for the control of weevils in stored maize grain in Nigeria”, Journal of tomological Research 36 (3), pp 21-24 52 Nwosu L.C (2015), Integrating host resistance with plant materials in the management of Sitophilus zeamaisinfestation in stored maize, Ph.D Thesis, ederal University of Technology Akure, Ondo State, Nigeria 70 53 Ombori O., Muoma J V O., Machuka J (2013), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of selected tropical inbred and hybrid maize (Zea mays L.) lines”, Plant Cell Tiss, 113 (1), pp 11-23 54 Paulraj K Lawrence, Kripa Ram Koundal, 2002, Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects, Electronic Journal of Biotechnology (1): 93109 55 Proctor D.L (1971), “An additional aedeagal character for distinguishing Sitophilus zeamais Motsch from Sitophilus oryzae (L.) (Coleoptera: Curculionidae) ”, Journal of Stored Products Research, 6, pp 351-352 56 Qiudeng Q., Sivamani E., Xianggan L., Heng Z., Samson N., Michael S., Xiaoyin F., Michael N., Timothy K., Weining G., Zhongying C., Mary-Dell M C (2014), “Maize transformation technology development for commercial event generation”, Plant Sience, 5, pp 379- 398 57 Rawlings N.D, Barrett A.J., 1994, "Families of cysteine peptidases", Methods enzymol, 244, pp 461-486 58 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, NY 59 Shohael A.M., Akanda M A L., Parves S., Mahfuja S., Alam M F., Islam R., Joarder N (2003), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature embryo derived callus of inbred maize (Zea mays L.) ”, Biotechnol, 2(2), pp 154 – 161 60 Shu-Guo FAN and Guo-Jiang WU, 2005, Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects, Bot Bull Acad Sin 46, pp 273-292 61 Silverio G L., David J B (2015), “Phytochemical and Nutraceutical Changes during Recurrent Selection for Storage Pest Resistance in Tropical Maize”, Crop science 54, pp 2423- 2432 62 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol 98, pp.503-517 63 Topping J F (1998), “Tobacco transformation”, Methods of Mol Biol 81, pp 365 – 372 64 Tongjura J D C., Amuga G A., Mafuyai H B (2010), “Laboratory assessment 71 of the susceptibility of some varieties of Zea mays infested with Sitophilus zeamais, Motsch, (Coleoptera: Curculionidae) in Jos, Platue State, Nigeria”, Science World Journal, (2), pp 55-57 65 Turk B., Turk V., Turk D., 1997, "Structural and functional aspects of papainlike cysteine proteinase and their protein inhibitor", Biol Chem Hopp seyler 378, pp 141-150 66 Valueva J.A., Morsolov V.V, 2004, "Role of inhibitors of proteolytic enzyme in plant defense against phytopathogenic microorganisms", Biochemistry (Moscow), 69(11), pp 1305-1309 67 Zhao Z U., Cai1 T., Tagliani L., Miller M., Wang N., Pang H., Rudert M., Schroeder S., Hondred D., Seltzer J., Pierce D (2000), “Agrobacteriummediated sorghum transformation”, Plant Mol Biol, 44, pp 789–798 72 THUYẾT MINH, HỢP ĐỒNG THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ VĂN BẢN ĐIỀU CHỈNH ĐÃ ĐƢỢC PHÊ DUYỆT 73 ... ngụ chuyn gen khỏng mt (Sitophilus zeamais Motsch.) 1.2 I TNG V VT LIU NGHIấN CU 1.2.1 i tng nghiờn cu - Nghiờn cu gen mó húa liờn quan n kh nng khỏng mt cõy ngụ; - ng dng k thut chuyn gen nh vi... cu phõn lp hai gen cystatin v defensin1 liờn quan n kh nng khỏng mt cõy ngụ; - Thit k vector mang gen khỏng mt (Sitophilus zeamais Motsch.); - Nghiờn cu h thng tỏi sinh v chuyn gen cõy ngụ;... Cỏc th h cõy chuyn gen Cõy chuyn gen tỏi sinh t chi ng nghim Ht ca cõy chuyn gen T0 ny mm thnh cõy T1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside Gen defensin1 ngụ Gen cystatin II ngụ