Đang tải... (xem toàn văn)
Ðộng vật chuyển gen là động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào trong DNA genome của nó. Gen ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế bào mầm. Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật chỉ thành công khi các gen này di truyền lại cho thế hệ sau Gen chuyển: là gen ngoại lai được chuyển từ cơ thể này sang cơ thể khác bằng kỹ thuật di truyền Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gen therapy). Có trường hợp các tế bào mầm không mang DNA ngoại lai. Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gen therapy) cũng được sử dụng. Các tế bào mầm này mang DNA ngoại lai và được truyền lại cho thế hệ sau. Thuật ngữ GMO (Gentically modified organism) Sinh vật biến đổi gen, được sử dụng chủ yếu để chỉ các thực vật chuyển gen được gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm. Thành tựu: vào thập kỉ 1970 nghiên cứu TB ung thư biểu bì phôi và tế bào ung thư quái thai để tạo nên chuột thể khảm(1974: Brinster, 1984: Bradley). Trong các động vật thể khảm này các Tb nuôi cấy lấy từ một dòng chuột được đưa vào phôi của một dòng chuột khác bằng quần tụ phôi trực tiếp hoặc tiêm. + Mc Grath và Solter(1983): chuyển nhân nguyên từ một phôi vào TB trứng chưa được thụ tinh của một dòng nhận khác một cách trực tiếp . + Jeanish và Mintz(1974), Jeanish(1976)=> tiêm retrovirus (ẢRN) vào các phôi chuột + 1986( Grossler) sử dụng tế bào phôi gốc. + Phương pháp chuyển gen các đoạn NST nguyên 1988 + Chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp thụ tinh invitro 1989 Lavitrano
1 Câu 5: Kỹ thuật biến đổi gen động vật? - Ðộng vật chuyển gen động vật có gen ngoại lai (gen chuyển) xen vào DNA genome Gen ngoại lai phải truyền lại cho tất tế bào, kể tế bào mầm Việc chuyển gen ngoại lai vào động vật thành công gen di truyền lại cho hệ sau - Gen chuyển: gen ngoại lai chuyển từ thể sang thể khác kỹ thuật di truyền - Chuyển gen khác với liệu pháp gen (gen therapy) Có trường hợp tế bào mầm không mang DNA ngoại lai Thuật ngữ liệu pháp gen mầm (germinal gen therapy) sử dụng Các tế bào mầm mang DNA ngoại lai truyền lại cho hệ sau - Thuật ngữ GMO (Gentically modified organism) -Sinh vật biến đổi gen, sử dụng chủ yếu để thực vật chuyển gen gieo trồng để cung cấp lương thực, thực phẩm - Thành tựu: vào thập kỉ 1970 nghiên cứu TB ung thư biểu bì phôi tế bào ung thư quái thai để tạo nên chuột thể khảm(1974: Brinster, 1984: Bradley) Trong động vật thể khảm Tb nuôi cấy lấy từ dòng chuột đưa vào phôi dòng chuột khác quần tụ phôi trực tiếp tiêm + Mc Grath Solter(1983): chuyển nhân nguyên từ phôi vào TB trứng chưa thụ tinh dòng nhận khác cách trực tiếp + Jeanish Mintz(1974), Jeanish(1976)=> tiêm retrovirus (ẢRN) vào phôi chuột + 1986( Grossler) sử dụng tế bào phôi gốc + Phương pháp chuyển gen đoạn NST nguyên 1988 + Chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp thụ tinh invitro 1989- Lavitrano - Sự hợp đoạn DNA ngoại lai vào genome tế bào chủ thực với tham gia chế sửa sai DNA tế bào Sự hợp đoạn DNA ngoại lai vào genome diễn theo chế tái tổ hợp tương đồng không tương đồng Nói chung DNA ngoại lai hợp dạng đoạn trùng lặp có kích thước khoảng 100kb, thường chứa từ đến 10 DNA gốc Vecto chuyển gen Vector phân tử DNA có khả mang đoạn DNA ngoại lai xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp có khả tự tái không phụ thuộc vào chép hệ gen tế bào chủ Vector có ứng dụng chủ yếu sau đây: - Tạo dòng nhằm khuếch đại số lượng trình tự DNA xác định - Tạo sinh vật chuyển gen (chuyển gen vào tế bào hay thể) - Sản xuất ARN với số lượng lớn từ DNA tạo dòng - Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA tạo dòng Đặc tính cần có vector: - Vector có khả tự chép tích cực tế bào vật chủ Độc lập với chép gen vật chủ - Vector có kích thước nhỏ tốt - Vector phải phát rõ ràng vật chủ - Phải tồn tế bào chủ qua nhiều hệ - Vector tồn vị trí nhận biết cho enzyme giới hạn Vector cắt vị trí xác định enzyme giới hạn nối với đoạn DNA tương hợp khác nhờ enzyme ligase Vector sử dụng với mục đích tách dòng gen (vector tách dòng), sử dụng với mục đích biểu gen (Vector biểu hiện) mục đích chuyển gen (vector chuyển gen) Một số loại vector đặc biệt khác dùng kỹ thuật chuyển gen như: Ti plasmid; Re plasmid; YACs; BACs; Retrovirus; Baculovirus; Yeast micron plasmid Các bước tạo dòng phân tử: Nối vecto đoạn DNA ngoại lai cần tạo dòng ống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ E ligase Biến nạp DNA tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ Tách dòng DNA tái tổ hợp cách sử dụng mẫu dò Các phương pháp chuyển gen Chuyển gen qua liposome - Lipid với toàn lưới tích điện dương pH sinh lý thành phần lipid tổng hợp phổ biến liposome phát triển cho chuyển gen Thường lipid cation trộn với lipid trung tính L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine (DOPE) Phần cation phân tử lipid kết hợp với DNA tích điện âm kết chứa đầy DNA phức hợp liposome-DNA - Nhờ chế nhập bào phức hợp xuất endosome sau vào nhân, chưa rõ DNA phóng thích từ endosome Kỹ thuật calcium phosphate - - Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) phát triển để xác định lây nhiễm DNA virus (Graham,1973) sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp DNA virus DNA tách chiết từ tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980) Kỹ thuật yêu cầu ủ tế bào nhận với chất đồng kết tủa DNA calcium phosphat (Hình 2) Kết tủa bám vào tế bào sau hấp thụ vào tế bào qua trình ẩm bào (Loyter, 1982) Trong tế bào, phân tử DNA ngoại lai nằm không bào tạo thành ẩm bào lysosome thứ hai DNA đến nhân vả hợp vào genome chủ 4 Phương pháp vi tiêm - Sự thành công nghiên cứu tạo chuột chuyển gen phương pháp vi tiêm vào tiền nhân công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980) Mặc dầu cấu trúc tổ hợp gen chuyển chứng minh tích hợp vào genome chuột, xếp lại gen ngoại lai không biểu Các công bố (Brister, 1981; Costantini Lacy; 1981) chứng minh với phương pháp vi tiêm, gen chuyển tích hợp có khả biểu Vào năm 1982, lần thay đổi kiểu hình nhìn thấy chuột nhắt chuyển gen mô tả (Palmiter, 1982) Ðây kết biểu gen hormon sinh trưởng chuột cống chuột nhắt Từ đến có nhiều công trình chuyển gen, phần lớn nghiên cứu hiệu gen vi tiêm với sinh trưởng động vật có vú bệnh học - Nguyên tắc phương pháp vi tiêm lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần tế bào nguyên vẹn cách học kính hiển vi Phương pháp cho phép đưa gen vào vị trí mong muốn tế bào với hiệu tương đối cao.Tuy nhiên đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm làm tổn thương đến tế bào phôi tác nhân học gây tiến hành vi tiêm - Ðể biến nạp gen vào tế bào phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm kim giữ Kim tạo từ ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi wolfram mảnh nhờ hệ thống thiết bị làm kim Hệ thống gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim máy gia cố kim Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: + gen chuyển xen vào vector plasmid tạo dòng E.coli + Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp phát môi trường nuôi cấy có thuốc kháng sinh plasmid mang gen kháng thuốc đặc hiệu + Các vi khuẩn sống sót sinh trưởng môi trường dinh dưỡng thích hợp plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển chép tế bào vi khuẩn phân chia + Sau đó, hàng triệu plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển tách chiết từ tế bào vi khuẩn đoạn gen chuyển tách từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế + Ðể tinh sạch, gen chuyển điện di gel agarose Hoà tan gen chuyển dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE ) tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế Nồng độ dung dịch DNA sử dụng cho vi tiêm thường 1-5 µg/ml Trước chuyển vào phôi, gen chuyển kiểm tra biểu tế bào nuôi cấy chuyển nhiễm (transfection) Các bước vi tiêm: + nạp gen vào kim tiêm phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) bơm trực tiếp dung dịch gen vào, + lắp kim tiêm kim giữ vào máy vi thao tác, + chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường đặt kính hiển vi, + giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ lực hút syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí trứng tiền nhân, + đẩy gen vào trứng tiền nhân cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân phồng to trở nên sáng dừng lại kéo nhanh kim tiêm + Trứng tiền nhân sau tiêm di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước tiêm trứng tiền nhân Mỗi nhóm trứng tiền nhân hoàn thành chuyển sang đĩa môi trường khác để ấp đánh giá mắt vài tiếng + Sau tất trứng tiền nhân nhìn thấy rõ ràng chuyển vào ống dẫn trứng nhận - - Cho đến nay, kỹ thuật chuyển gen vào động vật phương pháp vi tiêm dung dịch DNA vào hợp tử phương pháp có hiệu động vật có vú phương pháp chủ yếu sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi Ðối với thực vật phương pháp sử dụng tế bào tiền phôi hợp tử tế bào tiền phôi hạt phấn Phương pháp chuyển gen nhờ vector virus - Vào năm 1974, lần nhà khoa học phát thấy rằng, sau tiêm DNA retrovirus SV40 vào khoang phôi (blastocoel) túi phôi chuột, DNA tìm thấy sau tế bào chuột trưởng thành (Jaenisch,1974; Jaenisch Mintz,1974) - Phương pháp thao tác phức tạp có ưu điểm hiệu chuyển gen cao Hơn gen cấu trúc gắn vào vector virus sử dụng promoter virus, promoter thường có hoạt tính cao gen cấu trúc biểu mạnh tế bào chủ - Virus sử dụng làm vecto: + Về nguyên tắc, loại virus sử dụng làm vector để chuyển vật liệu di truyền vào tế bào + Nhiều nhóm số đó, papovavirus, adenovirus, retrovirus sử dụng vào mục đích chuyên biệt + Ðể sử dụng làm vector, phần khác genome virus thay gen cấu trúc quan tâm Virus sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm phôi trước chuyển ghép vào mẹ + Gen chuyển với vector retrovirus xâm nhập cách hiệu vào hệ gen vật chủ virus sử dụng phải virus an toàn, không gây bệnh - Đối với Đv chuyển gen: Các thể chuyển gen sinh từ phương pháp dạng khảm, có nghĩa tất tế bào thể mang retrovirus Gen chuyển di truyền retrovirus hợp vào số tế bào sinh dục Ðối với phương pháp tỉ lệ sống động vật chuyển gen sơ sinh thấp Nếu thao tác di truyền chuẩn xác, không gây sẩy thai, hệ động vật (F1) cần kiểm tra biểu gen chuyển Khi gen chuyển hợp tế bào sinh dục gọi thể khảm dòng mầm sau chúng lai dòng khoảng 10-20 hệ thu động vật chuyển gen đồng hợp tử gen chuyển có mặt tất tế bào Ở giai đoạn này, phôi mang gen chuyển đông lạnh bảo quản cho trình cấy chuyển sau Chuyển gen cách sử dụng tế bào gốc phôi Xuất phát từ lý tế bào gốc phôi (tế bào phôi giai đoạn 16-32 tế bào) tế bào đa (totipotent) nghĩa phân hoá thành loại mô từ tạo nên thể hoàn chỉnh Từ túi phôi nuôi cấy in vitro, người ta tiến hành tách chiết tế bào gốc phôi biến nạp gen ngoại lai vào tế bào Sau chọn tế bào biến nạp gen lạ người ta đưa vào phôi khác giai đoạn phôi nang để tạo động vật chuyển gen thể khảm Trên 30% động vật chuyển gen tạo thành động vật chuyển gen thể khảm dòng mầm mang kiểu gen dòng tế bào Ở tế bào gốc phôi sử dụng phương tiện để chuyển gen (Mintz, 1977) Ưu điểm phương pháp chuyển gen tỉ lệ phôi sống sót sau thao tác, tích hợp biểu tính trạng gen cao Ðiều quan trọng thực tế việc chuyển gen tiến hành thông qua thao tác với phôi dâu túi phôi Phôi giai đoạn thu nhận mà không cần phẫu thuật (đặc biệt bò), công việc chuyển gen tiến hành dễ dàng Phương pháp có ý nghĩa đặc biệt nghiên cứu kiểm tra di truyền trình phát triển Sự thuận lợi cho phép tạo cách xác đột biến gen xác định tái tổ hợp đồng dạng Trong tương lai phương pháp sử dụng tế bào gốc phôi sử dụng rộng rãi để tạo động vật chuyển gen Có ba cách tạo động vật chuyển gen từ tế bào gốc phôi mang gen chuyển: -Thứ nhất, phương pháp dùng trước mắt bơm số tế bào gốc phôi (khoảng 5-10 tế bào) vào xoang phôi nang tế bào động vật -Thứ hai, xen số tế bào gốc phôi vào bào thai thời kỳ tế bào -Thứ ba, nuôi cấy chung tế bào gốc phôi với phôi qua đêm Chuyển gen kỹ thuật xung điện Nguyên tắc: - Kỹ thuật xung điện (electroporation) phương pháp học sử dụng để đưa phân tử phân cực vào tế bào chủ qua màng tế bào - Trong phương pháp này, xung điện cao khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo lỗ thủng tạm thời cho phép phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên tế bào Chuyển gen súng bắn gen - Súng bắn gen (Gene gun) thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, thiết kế cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật phát triển vào đầu thập niên 1980 - Súng bắn gen bán thị trường vào năm 1990 - Ðạn sử dụng cho loại súng hạt kim loại nặng bao bọc DNA - Nguyên lý chung phương pháp sử dụng áp lực xung khí helium để gai tốc hạt Phương pháp có ưu điểm thao tác dễ dàng, chuyển gen vào nhiều loại tế bào mô, tế bào biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa gen vào tế bào vị trí mong muốn Do sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Các ứng dụng kỹ thuật bắn gen bao gồm - Tạo thực vật chuyển gen: phương pháp sử dụng rộng rãi lĩnh vực tạo ngũ cốc chuyển gen - Tiêm chủng vaccine di truyền: gen đưa vào thể súng bắn gen với mục đích gây phản ứng miễn dịch với protein biểu gen chuyển Phương pháp tiêm chủng vaccine an toàn phương pháp khác DNA ngoại lai đưa vào protein ngoại lai (Lin, 2000) 9 - Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp bắn gen sử dụng điều trị bệnh ung thư Một gen biểu protein gây độc có promoter đặc hiệu khối u đưa vào tế bào khối u Khi protein biểu tế bào khối u chết Protein gây độc tế bào khối u promoter đặc hiệu cần cho biểu tạo tế bào khối u (Lin, 2000) - Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp sử dụng để chống lại ung thư Sử dụng súng bắn gen, protein biểu tế bào khối u làm cho phản ứng miễn dịch tăng lên đưa vào tế bào Phản ứng miễn dịch tăng lên nhắm vào tế bào khối u hiển nhiên gây hiệu mong muốn (Lin,2000) - Dược lý di truyền: súng bắn gen sử dụng để đưa gen tổng hợp protein hữu ích hay protein liệu pháp vào thể Ví dụ yếu tố đông máu thể rối loạn đông máu tăng tổng hợp hồng cầu thể thiếu máu Sự biểu kéo dài gen đưa vào vấn đề, nhiều trường hợp thường đòi hỏi phân phối gen phức tạp (Lin, 2000) - Súng bắn gen công cụ nghiên cứu: súng bắn gen sử dụng để xen promoter mà dẫn đến biểu gen định Hiệu khuyếch đại protein định phương pháp có giá trị lớn nhà khoa học để nghiên cứu chức protein (Lin, 2000) Chuyển gen vào tinh trùng Nguyên lý: - Tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt khả tái DNA bao phủ protamine làm cho DNA ngoại lai khó vào genome tinh trùng Vì DNA ngoại lai hội để hợp vào DNA tinh trùng - Các thí nghiệm thực cách khoảng gần thập kỷ cho thấy tinh trùng ủ với DNA mang DNA đến trứng trình thụ tinh dẫn đến kết tạo chuột chuyển gen Các nghiên cứu hóa sinh học cho thấy DNA bám vào tinh trùng cách dễ dàng không chứng minh điều xảy xâm nhập DNA Vì tinh trùng đóng vai trò thể truyền DNA ngoại lai - Sau vài năm, phương pháp áp dụng rộng rãi với bò, lợn, cừu cá medaka (Hình 2.24) Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro Nguyên lý: 10 - Tinh trùng thành thục tạo từ tế bào gốc thông qua giai đoạn - khác biệt hóa Các tế bào gốc tinh trùng tách chiết, nuôi cấy in vitro thời gian ngắn cấy chuyển vào tinh hoàn nhận Các tế bào cấy chuyển hoạt động theo chương trình biệt hóa chúng làm cho tinh trùng hoạt động chức Tỉ lệ tinh trùng tạo thành từ tế bào gốc cấy chuyển tăng lên nhiều nhờ xử lý đực nhận với bisulfan Bisulfan loại thuốc ngăn cản biệt hóa tế bào gốc tinh hoàn Protocol sử dụng cách thành công để chuyển gen vào tế bào gốc trình nuôi cấy Ðiều đạt nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu Các tế bào gốc cấy chuyển vào đực nhận xử lý bisulfan dẫn đến kết Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vivo - DNA liên kết với thể chuyển nhiễm tiêm vào ống sinh tinh (Hình dưới) DNA bình thường DNA bám vào thể chuyển nhiễm tiêm trực tiếp vào ống sinh tinh Các tế bào hợp DNA ngoại lai tạo động vật chuyển gen sau thụ tinh bình thường Kỹ thuật viên gen (Gene pill) - Kỹ thuật viêm gen phương pháp điều trị bệnh liệu pháp gen thông qua đường uống thuốc - Một lượng DNA liệu pháp (dạng plasmid hay phức hợp DNA-peptid) bọc màng lipid hỗn hợp đặc hiệu màng bọc viên thuốc thông thường tạo viên gen Viên gen đưa vào thể theo đường miệng cách uống Sau được phóng thích, gen liệu pháp hấp thụ qua màng vào tế bào biểu mô ruột Ở gen liệu pháp phiên mã dịch mã thành protein dược phẩm Protein dược phẩm tiết vào máu, đến mô bệnh để ức chế hoạt động gen bệnh - Kỹ thuật viên gen phương pháp (được cấp phát minh vào ngày 3/5/2001) lần sử dụng để chữa bệnh tiểu đường cách sử dụng viên gen tạo thành từ DNA mã hóa inssulin Phương pháp khắc phục hạn chế phương pháp truyền thống vấn đề liều lượng phân phối thuốc Nó cách mạng hóa liệu pháp gen cho bệnh nhân chọn lựa để đưa insulin vào thể hàng ngày ... đích tách dòng gen (vector tách dòng), sử dụng với mục đích biểu gen (Vector biểu hiện) mục đích chuyển gen (vector chuyển gen) Một số loại vector đặc biệt khác dùng kỹ thuật chuyển gen như: Ti... trước chuyển ghép vào mẹ + Gen chuyển với vector retrovirus xâm nhập cách hiệu vào hệ gen vật chủ virus sử dụng phải virus an toàn, không gây bệnh - Đối với Đv chuyển gen: Các thể chuyển gen sinh... vật (F1) cần kiểm tra biểu gen chuyển Khi gen chuyển hợp tế bào sinh dục gọi thể khảm dòng mầm sau chúng lai dòng khoảng 10-20 hệ thu động vật chuyển gen đồng hợp tử gen chuyển có mặt tất tế bào