TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== NGÔ THỊ NGỌC OANH ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN DINH DƯỠNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG TẢO XOẮN SPIRULINA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2016 LỜI CẢM ƠN Bằng tất lòng kính trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy cô tổ vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giảng dạy khuyến khích em thời gian học tập Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân quan tâm giúp đỡ, động viên em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2016 Sinh viên Ngô Thị Ngọc Oanh LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan viết khóa luận thật Đây kết nghiên cứu riêng em Tất số liệu thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, số liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết công bố Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2016 Sinh viên Ngô Thị Ngọc Oanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Điểm đề tài NỘI DUNG Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tảo xoắn Spirulina 1.1.1 Lịch sử 1.1.2 Phân loại tảo Spirulina 1.1.3 Đặc điểm sinh học tảo Spirulina 1.2 Vị trí đặc điểm phân loại Gluconacetobacter sinh giới 1.2.1 Vị trí phân loại Gluconacetobacter sinh giới 1.2.2 Đặc điểm phân loại Gluconacetobacter 1.3 Đặc điểm chế hình thành màng Biocellulose 10 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc màng Biocellulose 10 1.3.2 Một số tính chất màng Biocellulose 11 1.3.3 Cơ chế tổng hợp Biocellulose 12 1.4 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn Gluconacetobacter 12 1.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 13 1.4.2 Nhu cầu nitơ vi sinh vật 13 1.4.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng 13 1.4.4 Các chất kích thích sinh trưởng 14 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất màng Biocellulose 14 1.5.1 Trên giới 14 1.5.2 Tại Việt Nam 15 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu hóa chất 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Thiết bị hóa chất 17 2.1.3 Môi trường 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp vi sinh 18 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 20 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả tạo màng Biocellulose 21 2.2.4 Thử nghiệm khả tạo màng Biocellulose môi trường chọn 23 2.2.5 Phương pháp xác định trọng lượng tươi màng Biocellulose 23 2.2.6 Phương pháp thống kê xử lý kết 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh màng Biocellulose môi trường có bổ sung dịch tảo xoắn Spirulina 25 3.1.1 Phân lập Gluconacetobacter có khả sinh màng Biocellulose 25 3.1.2 Nghiên cứu khả tạo màng Biocellulose số chủng Gluconacetobacter 29 3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tạo màng Biocellulose dai, mỏng 31 3.2 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng G xylinus T1 33 3.2.1 Hình thái tế bào học chủng vi khuẩn G xylinus T1 33 3.2.2 Sinh trưởng môi trường thạch đĩa 34 3.2.3 Sinh trưởng môi trường lỏng 34 3.2.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn G xylinus T1 35 3.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới khả tạo màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina 37 3.3.1 Ảnh hưởng hàm lượng glucose tới khả lên men tạo màng Biocellulose 37 3.3.2 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ tới khả lên men tạo màng Biocellulose 39 3.3.3 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 tới khả lên men tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus T1 41 3.3.4 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O tới khả lên men tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus T1 43 3.3.5 Thử nghiệm khả tạo màng Biocellulose môi trường chọn 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng tảo Spirulina kính hiển vi Hình 1.2 Sợi cellulose màng Biocellulose 11 Hình 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter 255 Hình 3.2 Vòng phân giải CaCO3 277 Hình 3.3 Chuyển hóa ethanol thành acid acetic vi khuẩn acetic 277 Hình 3.4 Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter 299 Hình 3.5 Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter nhuộm Gram × 1000 kính hiển vi quang học 299 Hình 3.6 Hình ảnh màng Biocellulose chủng vi khuẩn T1 T2 tạo môi trường lỏng 30 Hình 3.7 Khả tạo cellulose chủng G xylinus 30 Hình 3.8 Hoạt tính catalase 311 Hình 3.9 Màng Biocellulose sinh từ vi khuẩn Gluconacetobacter 322 Hình 3.10 Chủng vi khuẩn G xylinus T1 môi trường thạch nghiêng 333 Hình 3.11 Kết nhuộm Gram G xylinus × 1000 kính hiển vi quang học 333 Hình 3.12 Khuẩn lạc chủng vi khuẩn G xylinus môi trường thạch đĩa 344 Hình 3.13 Chủng vi khuẩn G xylinus môi trường lỏng 344 Hình 3.14 Hoạt tính catalase 355 Hình 3.15 Khả oxy hóa acetat vi khuẩn G xylinus 366 Hình 3.16 Kết nhuộm màng Biocellulose 366 Hình 3.17 Ảnh hưởng (NH4)2SO4 tới độ dày màng Biocellulose 40 Hình3.18 Ảnh hưởng MgSO4 H2O tới độ dày màng Biocellulose 455 Hình 3.19 Màng Biocellulose thu môi trường MT3 môi trường chọn 466 DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1 Thành phần hóa học Spirulina Bảng 1.2 Thành phần vitamin Spirulina Bảng 1.3 Thành phần khoáng Spirulina Bảng 1.4 Thành phần acid amin Spirulina Bảng 1.5 Các chất màu Spirulina Bảng 1.6 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur 10 Bảng 3.1 Một số đặc tính màng Biocellulose 311 Bảng 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 377 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 422 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 444 Biểu đồ 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 388 Biểu đồ 3.2.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 40 Biểu đồ 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 422 Biểu đồ 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 444 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP : adenozin diphosphate ATP : Adenosine triphosphate CS : Cellulose synthase G xylinus : Gluconacetobacter xylinus MT1 : Môi trường giữ giống MT2 : Môi trường nhân giống MT3 : Môi trường lên men MT4 : Môi trường chọn NADP : Nicotinamit adenozin đinucleotit phosphate 10 pABA : p-aminobenzoic acid 11 UGP :Glucose - - phosphate uridylytransferase MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Màng Biocellulose tổng hợp từ số loài vi khuẩn, có chất cellulose liên kết với tế bào vi khuẩn, màng vừa có cấu trúc đặc tính học giống với cellulose thực vật, lại có số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học khả thấm hút nước cao; đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả polymer hóa lớn Trên giới, màng Biocellulose ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng làm màng phân tách cho trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho pin lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt sản xuất sợi truyền quang, làm môi trường chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm Đặc biệt lĩnh vực y học, màng Biocellulose ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch: làm mặt nạ dưỡng da cho người [6] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng màng Biocellulose vấn đề mẻ, quan tâm gần Các nghiên cứu công bố vấn đề khiêm tốn Các nghiên cứu dừng nghiên cứu trình tạo màng Biocellulose ứng dụng sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn làm màng trị bỏng [11] Trong năm gần phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội phân lập, tuyển chọn chủng Gluconacetobacter xylinus (G xylinus) có khả tạo màng Biocellulose với suất chất lượng tốt nguồn nguyên liệu như: nước dừa, nước gạo Hiện nay, tiến hành lên men tạo màng Biocellulose môi trường tảo xoắn Spirulina để ứng dụng vào việc làm mặt nạ dưỡng da cho người Tuy nhiên, chưa có nguồn dinh dưỡng thích hợp cho trình tạo màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina Hình 3.15 Khả oxy hóa acetat vi khuẩn G xylinus T1 3.2.4.3 Kiểm tra khả tổng hợp cellulose Nhỏ dung dịch Lugol H2SO4 60% lên mặt lớp màng Biocellulose xuất màu lam Hình 3.16 Kết nhuộm màng Biocellulose Qua hình 3.16 chứng tỏ G xylinus T1 có khả hình thành màng cellulose Dựa theo khóa phân loại Bergey (1992) [9], tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic Frateur 1950, vào kết khảo sát điểm sinh học loài G xylinus T1 có khả tạo màng sinh học Biocellulose sử dụng trị bỏng, làm mặt nạ dưỡng da nhiều ứng dụng khác Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng vi khuẩn G xylinus T1 dựa hình thái tế bào học, sinh trưởng các môi trường thạch đĩa, môi trường lỏng một số đặc tính sinh hóa chứng tỏ chủng vi khuẩn G xylinus T1 có khả tạo màng Biocellulose mỏng, dai nhẵn 36 3.3 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới khả tạo màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina 3.3.1 Ảnh hưởng hàm lượng glucose tới khả lên men tạo màng Biocellulose Để thấy rõ ảnh hưởng hàm lượng cacbon tới trình lên màng Biocellulose, sử dụng môi trường MT3 để lên màng có thay đổi hàm lượng nguồn glucose từ – 25 (g/l), sau ngày nuôi cấy, tiến hành thu nhận màng Biocellulose Kết trình bày bảng 3.2: Bảng 3.2 Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 Hàm lượng Glucose (g/l) Đặc điểm màng Biocellulose Màng mỏng, dễ bị rách 0,5 1,0 ̅ ±m 𝑀 1,27 ± 0,01 1,72 ± 0,02 Màng mỏng, độ dai 2,23 ± 0,05 5,0 2,39 ± 0,04 10 2,70 ± 0,03 Màng mỏng, dai nhẵn (1-2mm) 15 3,21 ± 0,03 20 Màng dày, dai (3-4mm) 3,63 ± 0,03 25 Màng dày, dai, không nhẵn (5mm) 3,72 ± 0,02 37 M Khối lượng tươi màng Biocellulose (g) 3,63 3,5 3,21 2,69 2,5 2,23 1,5 3,72 2,39 1,72 1,27 0,5 0 0,5 10 15 20 25 HÀM LƯỢNG GLUOCSE (G/L) Biểu đồ 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 Từ kết bảng 3.2 biểu đồ 3.1 cho thấy tỷ lệ màng Biocellulose hình thành phụ thuộc nhiều vào hàm lượng đường glucose Nếu hàm lượng glucose nhỏ 10 (g/l) khối lượng Biocellulose thấp Bởi trình lên men có khoảng 50% hàm lượng glucose tham gia vào hình thành màng Biocellulose, phần lại cung cấp cho hoạt động sống tế bào Do đó, nguồn cacbon nhỏ 10 (g/l) dịch nuôi cấy không đủ cung cấp cho nhu cầu sống tế bào vi khuẩn, nên lượng cellulose sản sinh Ngược lại, hàm lượng glucose lớn 15 (g/l) vi khuẩn không sử dụng hết, lượng glucose chuyển hóa thành acid gluconic làm cho pH môi trường giảm, ức chế trình tổng hợp cellulose, tốc độ tạo màng Biocellulose giảm chất lượng màng không đảm bảo Dựa theo kết nghiên cứu đưa Thạc sĩ Đặng Thị Hồng xác định glucose tốt cho trình lên men tạo màng mỏng 18 (g/l) [7], tác giả Schramm Hestrin (1954) xác định 20 (g/l) [27] Để tạo màng mỏng phục vụ mục đích nghiên cứu môi trường MT3, định sử dụng hàm lượng glucose 10-15 (g/l) cho nghiên cứu 38 Hàm lượng glucose 10-15 (g/l) thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus T1 3.3.2 Ảnh hưởng hàm lượng nitơ tới khả lên men tạo màng Biocellulose Nguồn nitơ cung cấp cho thể vi sinh vật nguyên liệu để hình thành nhóm amin phân tử aminoacid, nucleotit, bazơ dị vòng hợp chất hóa học nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trưởng Do định chọn nguồn nitơ (NH4)2SO4 thay đổi nồng độ từ 05,0 (g/l) Kết thu thể qua bảng 3.3: Bảng 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 Hàm lượng (NH4)2SO4 (g/l) Đặc điểm màng Biocellulose 0,1 ̅ ±m 𝑀 0,53 ± 0,02 Màng mỏng, dễ rách 0,5 1,36 ± 0,03 1,83 ± 0,03 1,0 2,67 ± 0,03 Màng mỏng, dai, nhẵn (1-2 mm) 1,5 2,83 ± 0,03 2,0 3,12 ± 0,02 2,5 Màng dày, dai nhẵn (3-4 mm) 3,0 3,4 ± 0,03 2,87 ± 0,01 4,0 2,13 ± 0,04 Màng mỏng 5,0 1,87 ± 0,01 39 M: Khối lượng tươi m àng Biocellulose (g) 3,5 3,4 3,12 2,5 2,67 2,87 2,83 2,13 1,83 1,5 M 1,36 0,5 1,87 0,53 0 0,1 0,5 1,5 2,5 HÀM LƯỢNG (NH4)2SO4 (G/L) Biểu đồ 3.2.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 Hình 3.17 Ảnh hưởng (NH4)2SO4 tới độ dày màng Biocellulose Từ bảng 3.3, biểu đồ 3.2 hình 3.17 ta thấy (NH4)2SO4 hàm lượng 1,0-1,5 (g/l) vi khuẩn tạo màng Biocellulose có độ dày phù hợp Có thể giải thích kết thu sau: Kết kiểm tra cho thấy, hàm lượng 1,0-1,5 (g/l) môi trường cho hiệu suất màng Biocellulose cao Hàm lượng (NH4)2SO4 1,5 (g/l) cao yêu cầu G xylinus T1 môi trường MT3, 40 không hấp thụ hết lượng sulphate amone, lượng lại môi trường ức chế phát triển vi khuẩn Vì vậy, lượng Biocellulose tạo thấp so với môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l) Còn hàm lượng (NH4)2SO4 1,0 (g/l) thấp so với yêu cầu cho phát triển vi khuẩn, nên lượng Biocellulose tạo thấp Dựa theo kết nghiên cứu tác giả Schramm Hestrin (1954) [34], để có hàm lượng (NH4)2SO4 phù hợp môi trường MT3, định sử dụng nguồn (NH4)2SO4 với hàm lượng 1,0-1,5 (g/l) để tiến hành thí nghiệm Hàm lượng (NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l) thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus T1 3.3.3 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 tới khả lên men tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus T1 Phospho có ảnh hưởng lớn đến trình trao đổi chất vi khuẩn nên thay đổi nồng độ hợp chất phospho môi trường dẫn đến thay đổi trình tổng hợp hàng loạt chất hợp phần có chứa phospho, tế bào chất chất nhân Phospho việc tham gia cấu tạo nên thành phần tế bào có vai trò quan trọng tổng hợp cellulose vi khuẩn G xylinus T1 môi trường MT3 Tiến hành khảo sát ảnh hưởng KH2PO4 đến trình hình thành màng vi khuẩn G xylinus T1 nồng độ khác môi trường MT3 Sau ngày nuôi cấy điều kiện tĩnh thu kết bảng 3.4: 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 Hàm lượng KH2PO4 (g/l) Đặc điểm màng Biocellulose ̅ ±m 𝑀 Màng mỏng, dễ rách 0,56 ± 0,02 0,1 1,34 ± 0,03 0,5 Màng mỏng, nhẵn dai (1-2mm) 1,85 ± 0,01 1,0 2,63 ± 0,01 1,5 2,92 ± 0,03 Màng dày dai (3-4 mm) 2,0 3,27 ± 0,02 2,5 3,50 ± 0,03 3,0 3,85 ± 0,03 4,0 Màng mỏng, dai, không nhẵn 2,56 ± 0,02 5,0 2,43 ± 0,02 Khối lượng tươi m àng Biocellulose (g) 4,5 3,85 3,27 3,5 2,63 3,5 2,92 2,56 2,43 2,5 1,85 1,34 1,5 0,56 0,5 0 0,1 0,5 1,5 2,5 HÀM LƯỢNG KH2PO4 (G/L) Biểu đồ 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng KH2PO4 đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G.xylinus T1 42 Qua bảng 3.4, biểu đồ 3.3 cho thấy, hàm lượng 0,5-1,0 (g/l) môi trường cho hiệu suất màng Biocellulose cao Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng khối lượng màng chủ yếu phospho kali có nhiều thành phần cấu tạo quan trọng tế bào như: acid nucleic, protein, phospholipid nhiều coenzyme quan trọng ADP, ATP, NADP, tham gia vào trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến CO2 H2O Khi hàm lượng KH2PO4 lớn 1,0 (g/l) trở lên dẫn tới dư thừa làm thay đổi đặc tính lý hóa môi trường, ức chế trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn môi trường MT3 dẫn tới ảnh hưởng đến hình thành màng Biocellulose Ngược lại, lượng phospho kali thấp (dưới 0,5 (g/l)) ảnh hưởng tới việc cấu thành coezim xúc tác cho phản ứng trình sinh trưởng Dựa theo tác giả Schramm Hestrin sử dụng KH2PO4 2,7 (g/l) [27] Với nghiên cứu môi trường MT3 nên định sử dụng hàm lượng KH2PO4 0,5- 1,0 (g/l) cho nghiên cứu Hàm lượng KH2PO4 0,5- 1,0 (g/l) thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus T1 3.3.4 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O tới khả lên men tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus T1 Chúng ta cần phải cung cấp lượng magie cao cho vi sinh vật Magie mang tính chất cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến trình phosphoryl hóa Ngoài magie giữ vai trò quan trọng việc làm liên kết tiểu phần riboxom với [10] Tiến hành khảo sát ảnh hưởng MgSO4 7H2O đến trình hình thành màng vi khuẩn G xylinus T1 môi trường MT3 nồng độ khác Sau ngày nuôi cấy điều kiện tĩnh thu kết bảng 3.5: 43 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 Hàm lượng Đặc điểm màng Biocellulose MgSO4 H2O (g/l) M±m 1,87 ± 0,01 0,1 Màng mỏng, dễ bị rách 2,56 ± 0,03 0,5 2,77 ± 0,03 1,0 Màng mỏng, dai nhẵn 2,91 ± 0,01 1,5 (1-2mm) 3,17 ± 0,02 2,0 3,27 ± 0,02 2,5 Màng mỏng, dai (2-3mm) 3,54 ± 0,02 3,0 3,17 ± 0,01 4,0 2,99 ± 0,03 Màng mỏng, không nhẵn 5,0 M Khối 2,76 ± 0,01 lượng tươi m àng Biocellulose (g) 3,54 3,5 3,14 2,56 2,77 3,27 3,17 2,91 2,99 2,76 2,5 1,87 1,5 0,5 0 0,1 0,5 1,5 2,5 HÀM LƯỢNG MGSO4 H2O (G/L) Biểu đồ 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 44 Hình 3.18 Ảnh hưởng MgSO4 H2O tới độ dày màng Biocellulose Từ bảng 3.5, biểu đồ 3.4 hình 3.18, ta thấy MgSO4 7H2O hàm lượng 1,0-1,5 (g/l) cho khối lượng màng tươi phù hợp để phục vụ cho nghiên cứu Theo PGS TS Đinh Thị Kim Nhung magie nhân tố tham gia vào việc tạo thành enzyme, enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa chất trình hình thành màng Biocellulose Nếu lượng magie không đủ cung cấp cho việc tạo thành enzyme ảnh hưởng tới trình hình thành cellulose nên khối lượng màng thấp Ngược lại lượng magie cao gây ức chế cho trình tạo màng Biocellulose Từ kết nghiên cứu, định sử dụng MgSO4 7H2O hàm lượng 1,0-1,5 (g/l) nghiên cứu Hàm lượng MgSO4 7H2O 1,0-1,5 (g/l) thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus T1 Tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose mỏng, dai nhẵn môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina gồm: Nguồn cacbon phù hợp glucose với hàm lượng 10-15 (g/l) Nguồn nitơ: (NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l) Nguồn khoáng thích hợp: KH2PO4 0-0,5 (g/l); MgSO4 7H2O 1-1,5 (g/l) 45 3.3.5 Thử nghiệm khả tạo màng Biocellulose môi trường chọn (MT4) Sau xác định ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới khả tạo màng Biocellulose vi khuẩn G xylinus T1 môi trường MT3, định tiến hành thí nghiệm đánh giá khả tạo màng môi trường chọn (MT4) có thành phần sau: Nguồn cacbon: Glucose 10-15 (g/l); Nguồn nitơ (NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l); Nguồn khoáng KH2PO4 0-0,5 (g/l); MgSO4 7H2O 1,0-1,5 (g/l) Kết thu sau: Sau ngày nuôi cấy tiến hành thu màng kiểm tra chất lượng màng Biocellulose thu so sánh với màng thu môi trường MT3 thấy : chất lượng màng tốt, phù hợp với việc làm mặt nạ dưỡng da Hình 3.19 Màng Biocellulose thu môi trường MT3 và môi trường chọn MT4 Thử nghiệm lên men tạo màng môi trường chọn MT4 cho thấy màng Biocellulose lên men đạt tiêu chuẩn mỏng, dai nhẵn so với môi trường ban đầu MT3 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập chủng vi khuẩn giấm, tuyển chọn chủng vi khuẩn G xylinus T1 G xylinus T2, chủng vi khuẩn G xylinus T1 có khả sinh màng Biocellulose có khả hình thành màng mỏng, dai nhẵn môi trường có bổ sung dịch tảo xoắn Spirulina 1.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủng vi khuẩn G xylinus T1 dựa hình thái tế bào học, sinh trưởng môi trường thạch đĩa, môi trường lỏng số đặc tính sinh hóa chứng tỏ chủng vi khuẩn G xylinus T1 có khả tạo màng Biocellulose mỏng, dai nhẵn 1.3 Tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina gồm: Nguồn cacbon phù hợp glucose với hàm lượng 10-15 (g/l) Nguồn nitơ: (NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l) Nguồn khoáng thích hợp: KH2PO4 0-0,5 (g/l); MgSO4 7H2O 1,0-1,5 (g/l) Sau ngày nuôi cấy thử nghiệm môi trường MT4 tĩnh ta thu màng mỏng, dai, nhẵn đạt tiêu chuẩn Kiến nghị Do thời gian có hạn nên nghiên cứu ảnh hưởng tất yếu tố môi trường tới trình hình thành màng Biocellulose chủng vi khuẩn G xylinus T1 môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina Để màng Biocellulose có chất lượng tốt, mang lại hiệu kinh tế cao, mặt khoa học thẩm mĩ, xin đề nghị số ý kiến sau: Ngoài việc, nghiên cứu dịch tảo xoắn Spirulina nên nghiên cứu thêm môi trường sử dụng bột tảo Tiến hành thí nghiệm quy mô lớn hơn, lặp lại thí nghiệm nhiều lần để kiểm chứng kết thu Tiến hành nghiên cứu để tìm kiếm nguồn dinh dưỡng thích hợp quy trình xử lí phù hợp cho việc nghiên cứu làm mặt nạ dưỡng da 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Trần Thị Linh Châm Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xử lý, bảo quản màng Bacterial cellulose từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 _ 21 ứng dụng điều trị bỏng Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2012 [2] Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1- 2- 3, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội [3] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2009) Vi sinh vật học Nxb Giáo dục [4] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 [5] Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông nghiệp, 1999 [6] Trương Thị Ngọc Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương (2005) Đa dạng hóa môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum Số 2, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp [7] Đặng Thị Hồng Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (BC) Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2007 [8] Nguyễn Thúy Hương (2006) Chọn lọc dòng A xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn Số 3, Tạp chí di truyền ứng dụng [9] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006) Ngiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Số 361, Tạp chí dược học [10] Lê Văn Lăng, Spirulina – Nuôi trồng, Sử dụng y dược dinh dưỡng, NXB Y học, 1999 48 [11] Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ Vi sinh vật tập 1-2-3, Nhà Xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM [12] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội [13] Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án tiến sĩ sinh học Trường Đại Sư phạm Hà Nội [14] Đinh Thị Kim Nhung (2012), Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng, Đề tài trọng điểm cấp Bộ (20102012) [15] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011) Nghiên cứu vi khuẩn Acetorbacter xylinum sinh tổng hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng Tạp chí y học thảm họa & bỏng Viện bỏng Quốc Gia, Hội bỏng Việt Nam, trang 122 - 127 [16] Lương Đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật Nxb Nông nghiệp [17] Trần Linh Thước (2006) Phương pháp phân tích vi sinh vật Nxb Giáo dục [18] Nguyễn Thị Thùy Vân (2009) Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng Bacterial cellulose vi khuẩn Acetobacter xylinum phân lập từ số nguồn nguyên liệu Việt Nam, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, trường ĐHSP Hà Nội Tài liệu nước [19] Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) Polysaccharides and polyamides in the food industry, www.wiley vch pp 31-85 [20] Ben- Hayyim G, Ohad I, Ph.D Synthesis of cellulose by Acetobacterxylinum : VIII On the formation and oriention of bacterial cellulose fibril in the presence of acidic polysaccharides.(1965) Vol 25, The Journal of Cell Biology 49 [21] Bergey H, John G Holt (1992) Bergey’s manual of dererminative bacteriology , Wolters kluwer health, p.71- 84 [22] Dillon, J.C., Phuc, A.P., Dubacq, J.P., 1995 Nutritional value of the alga Spirulina, World Rev.Nutr.Diet, Vol 77, 32 – 46 [23] Hai-Peng Cheng, Pei-Ming Wang, Jech-Wei Chen, Wen-Teng Wu Cultivation of Acetobacterxylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reator.(2002).Vol 35, Biotechnol Appl, Biochem [24] Henrickson, R 1989 Earth Food Spirulina Laguna Beach, California: Ronore Enterpriese Inc, 23-42 [25] Neelobon S., Jiraporn B, Suwanncee T.,.(2007) “Effect of culture conditions on bacterial cellulosee (BC) production from Acetobacter xylinum TISTR976 and physical properties of BC parchment paper”, Vol 14, N o 4, Suranaree J.Sci Technol, 2007, p 357- 365 [26] Pikul Wanichapichart, SanaeKaewnopparat, KhemmaratBuaking, WaravutPuthai Characterization of cellulose membranes produced by Acetobacterxylinum (2002) Vol 24, Songklanakarin J Sci technol, pp 855 -862 [27] Schramm M., Hestrin S (1954) “Factor affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum”, J.gen Microbiol, Vol 11, pp 123-129 [28] Sievers, M & Swings, J (2005) “Family Acetobacteraceae”, In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edn, vol 2, pp 41– 95 Edited by G M Garrity New York: Springer Tài liệu mạng [29] https://taospirulina.wordpress.com/2013/04/03/thanh-phan-gia-tri-dinhduong-cua-tao-spirulina [30] https://taospirulina.wordpress.com/2013/03/27/tao-spirulina-tong-quanve-tao-xoan-spirulina/ 50 ... xylinus môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina, định tiến hành thực đề tài: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng tới trình lên men tạo màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina Mục đích... cứu ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng đến trình hình thành màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina Từ đó, tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp cho trình lên men tạo màng Biocellulose môi. .. có nguồn dinh dưỡng thích hợp cho trình tạo màng Biocellulose môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina Nhằm tìm nguồn dinh dưỡng phù hợp cho trình tạo màng Biocellulose vi khuẩn G xylinus môi trường