BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TRẦN THỊ LUYẾN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE TÍCH HỢP HỆ VI LƯU Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 62520301 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC Hà Nội – 2017 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: Hướng dẫn 1: PGS.TS Mai Anh Tuấn Hướng dẫn 2: PGS TS Huỳnh Đăng Chính Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm …… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Hiện nay, các phương pháp phân tích sinh học phân tử truyề n thố ng (PCR, ELISA…) sử dụng phổ biến, cho kết tốt độ xác cao, nhiên bên cạnh ưu điểm thể nhược điểm Các phương pháp phức tạp, yêu cầu kỹ thuật viên có tay nghề cao, u cầu phịng thí nghiệm đại trung tâm nghiên cứu, phân tích trung ương thành phố lớn, trình thực cần phải sử dụng sinh phẩm hóa chất đặc hiệu Các phương pháp cần hàng đến hàng ngày để thực đặc biệt, thiết bị phân tích, chẩn đốn dịch chuyển khỏi nơi lắp đặt ban đầu Đây điểm tồn cần giải thực chiến dịch phân tích lưu động Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tích có khả bổ sung, chí thay phần kỹ thuật phân tích truyền thống thực cần thiết Cảm biến sinh học thiết bị kỳ vọng có khả thay phần kỹ thuật phân tích truyền thống nhờ khả ứng dụng rộng rãi phát virus gây bệnh, chẩn đốn lâm sàng, giám sát mơi trường, phân tích độc học thực phẩm… Vì lí trên, định thực luận án: “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu” Mục tiêu luận án: Mục tiêu luận án nghiên cứu chế tạo tích hợp cảm biến sinh học điện hóa vi bình phản ứng ứng dụng phát thành phần sinh học, bao gồm: 01) biến tính bề mặt cảm biến sử dụng vật liệu có cấu trúc nano nhằm nâng cao hiệu cố định phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến; 02) tích hợp hệ điện cực với vi bình phản ứng nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ 03) phát triển tùy biến qui trình đo lường điện hóa sử dụng cảm biến sinh học không đánh dấu nhằm phát thành phần sinh học Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nghiên cứu luận án nghiên cứu thực nghiệm Cách tiếp cận trình nghiên cứu từ kết thực nghiệm, kết hợp với lý thuyết tài liệu tham khảo, giải thích, so sánh, đánh giá tối ưu qui trình thực nghiệm Nội dung luận án: Để giải mục tiêu đề tài, luận án tập trung nghiên cứu nội dung: Nội dung nghiên cứu 1: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa sở dây nano polypyrrole Trong nội dung nghiên cứu 1, mục tiêu NCS làm quen với kỹ thuật điện hóa thực hệ đo mở, phép đo điện hóa khơng sử dụng điện cực thương mại mà sở điện cực tự thiết kế phát triển, vật liệu thể mềm cấu trúc dây nano chế tạo giữ vai trò làm lớp vật liệu trung gian bề mặt cảm biến chuyển đổi, giúp nâng cao hiệu cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA lựa chọn làm đối tượng đo DNA có độ bền, độ ổn định cao dễ đặt mua Nội dung nghiên cứu bao gồm: nghiên cứu tổng hợp dây nano polypyrrole điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa nhằm biến tính bề mặt cảm biến; nghiên cứu cố định DNA dò lên bề mặt cảm biến sở dây nano polypyrrole; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dị – DNA đích cảm biến DNA điện hóa chế tạo Nội dung nghiên cứu 2: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu Phát triển từ kết đạt nội dung nghiên cứu với phép đo điện hóa thực hệ đo mở, nội dung nghiên cứu 2, luận án tập trung nghiên cứu tính chất điện hóa diễn thu nhỏ bình điện hóa Việc thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng mẫu tiêu thụ có ý nghĩa quan trọng phân tích y sinh mẫu phân tích mẫu máu, vi khuẩn, virus… Nội dung nghiên cứu bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo gắn kết hệ ba điện cực tích hợp Pt vi kênh PDMS; nghiên cứu tổng hợp điện hóa dây nano polypyrrole bên vi bình phản ứng nhằm cố định DNA chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp với hệ vi lưu; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dị – DNA đích cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu chế tạo với phép đo điện hóa thực hệ đóng Nội dung nghiên cứu 3: Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng phát virus Newcastle Sau hoàn thành nội dung nghiên cứu với qui trình đo lường điện hóa thực bình điện hóa thu nhỏ, nội dung nghiên cứu luận án tiến gần thêm bước đến ứng dụng thực tiễn Các kết đạt luận án không dừng lại báo khoa học mà cịn có khả hướng đến hợp tác với công ty, nhà sản xuất Trong nội dung nghiên cứu 3, thay sử dụng DNA làm phần tử dị cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, địi hỏi chi phí cao thời gian dài, luận án sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà – sản phẩm bán thị trường công ty cổ phần công nghệ sinh học thú y BTV (Biotech-Vet) cung cấp, tương lai hướng đến việc đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt hàng từ phía cơng ty Nội dung nghiên cứu bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay Ag/AgCl bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể kháng virus Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà lên bề mặt cảm biến sinh học; nghiên cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini chế tạo phát virus Newcastle Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án: Nhận thấy phương pháp phân tích truyền thống áp dụng rộng rãi, có phổ kết rộng, độ xác cao đồng thời có nhiều bất cập triển khai sử dụng đòi hỏi đội ngũ kỹ thuật viên có tay nghề cao, thiết bị sinh phẩm, hóa chất đắt tiền, tập trung sở phân tích thành phố lớn, trung ương , luận án hướng tới việc phát triển kỹ thuật phân tích tập trung vào việc làm tăng độ nhạy, độ chọn lọc, làm giảm lượng mẫu phân tích, thời gian phân tích Luận án tập trung vào phát triển cảm biến sinh học dựa sở thông tin di truyền (DNA) kháng thể vật chủ, sử dụng kỹ thuật đo lường điện hóa Để phát triển cảm biến sinh học điện hóa, trước tiên, luận án tập trung nghiên cứu thiết kế chế tạo điện cực khác với điện cực truyền thống Bề mặt điện cực sau biến tính sở lớp vật liệu trung gian với cấu trúc nano Trên bề mặt phân cách dung dịch chứa mẫu phân tích màng sinh học có cấu trúc nano, tính chất hóa lý diễn có phần khác so với tính chất điện cực truyền thống Các kỹ thuật quét vòng, tĩnh, tổng trở kỹ thuật đo vi sai triển khai để nghiên cứu tính chất điện hóa Đối với việc phát triển cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phát thành phần sinh học, vấn đề giảm thể tích mẫu phân tích, thu nhỏ hệ thống phân tích có ý nghĩa quan trọng Luận án tập trung nghiên cứu kỹ thuật đo lường điện hóa vi bình phản ứng tích nhỏ thay thực phép đo hệ mở Những đóng góp luận án: Một đóng góp luận án tổng hợp vật liệu polime dẫn polypyrrole (PPy) với cấu trúc dây nano nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm biến, nâng cao hiệu cố định thành phần cảm nhận sinh học Dây nano PPy tổng hợp trực tiếp điện cực làm việc (WE), sử dụng kỹ thuật polime hóa điện hóa, khắc phục tình trạng vật liệu PPy tạo thành dạng đảo, có cấu trúc hoa súp lơ Đặc biệt, việc tổng hợp thành cơng vật liệu PPy có cấu trúc nano xác vị trí mong muốn bên vi bình phản ứng (thể tích µl) thách thức mà thời điểm tại, nhóm nghiên cứu giới làm Hiện nay, số lượng cơng trình cơng bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp cấu trúc nano bên hệ tích hợp cịn hạn chế Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch đóng góp luận án Luận án góp phần quan trọng việc thiết kế, chế tạo gắn kết bình phản ứng kích thước nhỏ tích hợp hệ điện cực có khả ghép nối với mạch đo, sở làm giảm lượng mẫu phân tích, làm tăng tỷ lệ tín hiệu/nhiễu đo lường Hiện tại, vấn đề nghiên cứu Việt Nam Thêm đóng góp luận án, việc phát triển tùy biến qui trình đo lường điện hóa thực bình điện hóa thu nhỏ sử dụng cảm biến sinh học không đánh dấu nhằm phát phần tử sinh học: DNA virus Newcastle Ngồi ra, việc làm chủ cơng nghệ chế tạo cảm biến điện hóa ba điện cực theo phương pháp planar với chất lượng tương đương sản phẩm thương mại đóng góp thuyết phục luận án Bố cục luận án: Luận án trình bày 103 trang (khơng kể phần mục lục danh mục tài liệu tham khảo) Cấu trúc luận án gồm: Mở đầu Tổng quan Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa sở dây nano polypyrrole Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng phát virus Newcastle Kết luận Các kết luận án cơng bố 09 cơng trình khoa học, có 02 báo đăng tạp chí chuyên ngành quốc tế ISI, 04 báo đăng tạp chí chuyên ngành nước 03 báo cáo hội nghị nước quốc tế TỔNG QUAN 1.1 Cảm biến sinh học điện hóa 1.1.2.2 Khái niệm cảm biến sinh học cảm biến sinh học điện hóa Hiệp hội quốc tế hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp có khả cung cấp thơng tin phân tích định lượng bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer) Chất gắn phận chuyển đổi gọi “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích mẫu gọi “phần tử đích” Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học dựa phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên- kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA (cảm biến DNA) enzym- chất (cảm biến enzym)… Trên sở phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trị dị tìm đối tượng đích mẫu phân tích phần tử chuyển đổi giữ vai trị chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đưa qua phận xử lý tín hiệu hiển thị kết đo, hình 1.3 Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi tinh thể áp điện chuyển đổi hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều khả ứng dụng phân tích đối tượng y sinh Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học điện hóa chuyển tín hiệu phản ứng sinh hóa phần tử nhận biết sinh học phần tử đích dung dịch điện ly thành tín hiệu nhận biết kỹ thuật điện hóa 1.1.2.4 Tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa Đối với việc tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa, vấn đề đặt là: Việc lựa chọn, thiết kế chế tạo điện cực cho cảm biến sinh học điện hóa có ý nghĩa định tới độ nhạy, chi phí phép phân tích khả tương thích với quy trình cố định Các điện cực sử dụng cho phát triển cảm biến sinh học điện hóa thường kim loại quý Pt, vàng vài dạng cacbon bao gồm sợi cacbon, graphit epoxi, graphene cacbon thủy tinh…Việc lựa chọn, thiết kế chế tạo điện cực phụ thuộc vào lực đội ngũ nghiên cứu điều kiện sở vật chất kỹ thuật phòng Vấn đề thứ hai quan tâm nghiên cứu nhằm mục đích tối ưu hóa quy trình cố định phần tử cảm nhận sinh học (DNA kháng nguyên/kháng thể…) bề mặt cảm biến Để nâng cao hiệu cố định phần tử cảm nhận sinh học, bề mặt cảm biến cần biến tính nhằm tạo nhóm chức có khả hình thành liên kết cộng hóa trị, liên kết hyđrơ, liên kết yếu Van der Waals Có nhiều phương pháp để biến tính bề mặt cảm biến, phương pháp sử dụng vật liệu polime dẫn Trong vật liệu polime dẫn, PPy thường lựa chọn làm lớp vật liệu trung gian bề mặt cảm biến chuyển đổi polime dẫn PPy đáp ứng yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với bề mặt chuyển đổi; 2) có độ tương thích sinh học cao, khơng làm thay đổi cấu trúc biến tính phần tử cảm nhận sinh học; 3) có khả truyền tải thông tin tốt từ tương tác sinh học xuống chuyển đổi Vấn đề thứ ba thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu thiết kế, chế tạo tích hợp hệ vi lưu, vi bình phản ứng với cảm biến sinh học điện hóa nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ, đồng thời nâng cao tỉ lệ tín hiệu/nhiễu phép đo Sự kết hợp cảm biến sinh học điện hóa hệ vi lưu coi bước đệm để tiến tới chế tạo vi phân tích điện hóa cầm tay, giữ vai trị quan trọng việc thực nhiệm vụ phân tích lưu động Tuy nhiên, tại, vấn đề tương đối Việt Nam Vấn đề thứ tư tập trung hướng đến nghiên cứu xây dựng qui trình đo lường điện hóa nhằm phát thành phần sinh học (phần tử đích) mẫu phân tích, sở phát triển thiết bị điện hóa phù hợp phục vụ cho việc đo lường, phân tích điện hóa sử dụng cảm biến sinh học Để giải vấn đề nêu trên, đòi hỏi yếu tố liên ngành nhóm nghiên cứu: hóa học, vật lý, điện tử, sinh học, khoa học vật liệu Trên giới, nhóm nghiên cứu liên ngành xu hướng ưu tiên nghiên cứu, phát triển chế tạo hệ đo điện hóa sử dụng cảm biến miễn dịch cảm biến DNA 1.2 Biến tính bề mặt cảm biến sinh học điện hóa sử dụng dây nano polypyrrole Cảm biến DNA điện hóa hoạt động dựa kết khảo sát thay đổi đặc tính điện hóa xuất lai hóa đặc hiệu chuỗi DNA dị DNA đích Khi nồng độ chuỗi DNA nhỏ, tương tác hai chuỗi DNA làm thay đổi phần nhỏ tín hiệu điện hóa bề mặt màng sinh học (nơi gắn kết DNA dị), hiệu truyền tải thơng tin điện hóa từ bề mặt cảm biến đến chuyển đổi định độ nhạy cảm biến DNA Trong đó, kỹ thuật cố định DNA dò lên bề mặt cảm biến yếu tố quan trọng góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu Hiện chưa có kỹ thuật ổn định để cố định trực tiếp chuỗi DNA dò lên bề mặt điện cực kim loại Nói cách khác, người ta thường phải biến tính bề mặt điện cực cách sử dụng lớp vật liệu trung gian bề mặt cảm biến chuỗi DNA Lớp vật liệu trung gian cần đáp ứng yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với bề mặt chuyển đổi sợi DNA; 2) có độ tương thích sinh học, khơng làm thay đổi cấu trúc biến tính sợi DNA; 3) làm tăng hiệu q trình truyền tải thơng tin từ tương tác sinh học xuống chuyển đổi Vật liệu polime dẫn, polypyrrole (PPy), polythiophene polyanilin thường lựa chọn chế tạo cảm biến sinh học điện hóa, với vai trò làm lớp vật liệu trung gian cảm biến chuyển đổi vật liệu polime dẫn đáp ứng đủ ba yêu cầu kể trên, góp phần làm tăng độ nhạy, độ xác, độ ổn định cảm biến sinh học Trong vật liệu polime dẫn, PPy nhận định thích hợp ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa nhờ khả tạo cấu trúc nano với diện tích bề mặt lớn, khả tạo liên kết tốt với đối tượng sinh học, khả biến tính để điều khiển độ dẫn, góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định cảm biến sinh học Đối với việc phát phần tử sinh học môi trường pH tự nhiên thể động vật, PPy có ưu điểm so với polythiophene polyaniline vật liệu tổng hợp từ monome môi trường pH trung tính Bên cạnh đó, PPy thể đặc tính độ bền cao, dễ tổng hợp độ dẫn tốt Khả ứng dụng vật liệu polime dẫn nói chung PPy nói riêng chế tạo cảm biến sinh học điện hóa với vai trị làm lớp vật liệu trung gian bề mặt chuyển đổi thành phần cảm nhận sinh học chứng minh qua nhiều cơng trình cơng bố quốc tế Tuy nhiên, thời điểm tại, nhiều cơng trình cơng bố, vật liệu polime dẫn PPy chủ yếu tổng hợp với cấu trúc hoa súp lơ (màng PPy) Số lượng cơng trình cơng bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp ứng dụng vật liệu PPy cấu trúc dây nano chế tạo cảm biến sinh học điện hóa cịn hạn chế Trong luận án này, vật liệu polime dẫn PPy với cấu trúc dây nano tổng hợp xác vị trí mong muốn (WE) kỹ thuật điện hóa sử dụng gelatin làm “khn mềm” định hướng cho phát triển dây nano So sánh với vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu PPy cấu trúc dây nano với diện tích bề mặt riêng lớn giúp nâng cao hiệu cố định phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định cảm biến sinh học 1.4 Tích hợp cảm biến sinh học điện hóa bình phản ứng mini Việc tích hợp cảm biến điện hóa hệ vi lưu, vi bình phản ứng nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm thể tích mẫu tiêu thụ xu hướng thu hút quan tâm nhiều nhóm nghiên cứu giới Tuy nhiên, tại, vấn đề tương đối Việt Nam Bên cạnh đó, cơng trình cơng bố quốc tế, cảm biến điện hóa tích hợp hệ vi lưu ứng dụng để định lượng thuốc, thay đổi hình dạng tế bào, kim loại nặng, glucose dung dịch Tuy nhiên, nay, giới, số lượng cơng trình cơng bố liên quan đến việc tổng hợp vật liệu cấu trúc nano bên hệ tích hợp hạn chế Trong luận án này, việc tích hợp cảm biến sinh học điện hóa hệ vi lưu, tiếp sau qui trình tổng hợp vật liệu cấu trúc nano bên vi bình phản ứng nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm biến tập trung hướng đến Việc tích hợp cảm biến sinh học điện hóa với vi bình phản ứng phát phần tử sinh học (DNA kháng nguyên/kháng thể…) cho giúp thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ mà cịn góp phần nâng cao tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu, cải thiện độ xác hệ thống 1.5 Kỹ thuật điện hóa nhận biết thành phần sinh học Trong kỹ thuật điện hóa ứng dụng nhận biết phần tử sinh học (DNA, kháng nguyên/kháng thể), kỹ thuật có ưu điểm riêng Ưu điểm phương pháp EIS (phương pháp phổ tổng trở điện hóa) suốt q trình đo cần đưa điện áp kích thích nhỏ vào hệ nên hoạt tính thành phần sinh học không bị ảnh hưởng hệ giữ trạng thái cân Hơn phương pháp EIS có độ ổn định cao, cho phép phân tích khơng tồn q trình mà giai đoạn riêng rẽ, diễn đồng thời song song hệ nghiên cứu Ưu điểm phương pháp đo vi sai loa ̣i bỏ sự nhiễu của môi trường, đó cho kết đo xác tín hiệu đo nhỏ bị nhiễu nguồn nhiễu khác Ưu điểm phương pháp CV (phương pháp quét vòng) phương pháp sử dụng rộng rãi phân tích điện hóa nói chung nên thiết bị điện hóa sử dụng cho phép đo CV phổ biến Hơn nữa, mục tiêu xa hướng đến nghiên cứu thiết kế, chế tạo vi phân tích điện hóa ứng dụng y sinh (sự kết hợp đầu đo tích hợp, vi bình phản ứng thiết bị điện hóa cầm tay) phương pháp CV lựa chọn phù hợp, khả thi việc thiết kế, chế tạo mạch đo cho thiết bị điện hóa cầm tay Trên sở đó, luận án này, ba kỹ thuật điện hóa lựa chọn tùy thuộc vào nội dung nghiên cứu cụ thể điều kiện sở vật chất kỹ thuật giai đoạn nghiên cứu NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE 2.1 Mở đầu Trong nội dung nghiên cứu này, luận án hướng đến việc nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa sở dây nano polypyrrole Các kỹ thuật điện hóa thực hệ đo mở tập trung nghiên cứu, phép đo điện hóa khơng sử dụng điện cực thương mại mà sở điện cực tự thiết kế phát triển, vật liệu thể mềm PPy cấu trúc dây nano chế tạo nhằm biến tính bề mặt cảm biến, giúp nâng cao hiệu cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA lựa chọn làm đối tượng đo DNA có độ bền, độ ổn định cao dễ đặt mua 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Hóa chất Bảng 2.1 Trình tự chuỗi đơn DNA Chuỗi đầu dị (probe): Thiol-C6-5’-AGACCTCCAGTCTCCATGGTACGTC-3’ Chuỗi đích (target): 5’-GACGTACCATGGAGACTGGAGGTCT-3’ Chuỗi đích khơng kết cặp: 5’-ACGCTGAGTACGGGTGCAAGAGTCA-3’ 2.2.2 Điện cực tích hợp Hệ hai điện cực Pt tích hợp bao gồm điện cực làm việc với diện tích 0,8 mm2 điện cực diện tích mm2, hình 2.1 Hình 2.1: (A): quy trình chế tạo rút gọn; (B): điện cực dùng làm cảm biến 2.2.3 Tổng hợp dây nano PPy sử dụng kỹ thuật điện hóa Quá trình tổng hợp dây nano PPy thực hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan Bình điện hóa sử dụng điện cực Pt tích hợp (bao gồm điện cực làm việc điện cực đối) điện cực so sánh Ag/AgCl dung dịch KCl bão hịa Dây nano PPy tổng hợp mơi trường trung tính, pH = 7,4 với vai trị đệm muối phốt phát (PBS) Dung dịch điện li pha chế gồm: monome pyrrole, gelatin 0,08% khối lượng, LiClO4 0,1 M đệm PBS Dây nano PPy tổng hợp trực tiếp lên điện cực Pt (WE) nhờ kỹ thuật điện hóa: áp điện khơng đổi 0,75V lên điện cực làm việc đo dòng phản hồi I theo thời gian, gelatin sử dụng với vai trị làm khn mềm định hướng cho phát triển dây nano PPy 2.2.4 Cố định DNA dò điện cực Pt-PPy NWs Chuỗi đơn DNA dò cố định trực tiếp lên bề mặt màng cấu tạo dây nano PPy phương pháp hấp phụ 10 μl dung dịch DNA dò nồng độ 10 μM nhỏ đều, phủ lên điện cực Pt-PPy NWs Sau điện cực rửa nhiều lần nước khử ion nhằm loại bỏ sợi DNA dị khơng liên kết liên kết yếu với dây nano PPy Cuối cùng, cảm biến làm khô tự nhiên bảo quản oC 2.2.5 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò Đặc trưng phổ tổng trở điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò nồng độ DNA đích khác khảo sát sử dụng hệ điện hóa AutoLab PGSTAT12, Eco Chemie, Hà Lan Dịng xoay chiều đặt vào có biên độ Eac = 10 mV, tần số biến thiên f = 0,1 Hz đến 104 Hz, điện áp chiều không đổi Edc = 0,25 V so với Ag/AgCl dung dịch KCl bão hòa 2.3 Kết thảo luận 2.3.1 Tổng hợp dây nano PPy điện cực Pt 2.3.1.3 Ảnh hưởng gelatin – khuôn nano chế tạo dây polyme Khi không sử dụng gelatin, PPy hình thành bề mặt điện cực Pt với cấu trúc hoa súp lơ (cauliflower) Để khắc phục tượng này, gelatin sử dụng với vai trị khn mềm q trình polime hóa, kết PPy xuất bề mặt điện cực Pt với cấu trúc dây nano, đường kính dây khoảng 65 nm đến 105 nm, chiều dài dây cỡ micromet Kích thước dây nano PPy tổng hợp đồng đều, đường kính đồng dọc theo chiều dài dây dây nano phân bố tương đối bề mặt điện cực So sánh với vật liệu PPy Hình 2.7: Ảnh FE-SEM PPy tổng hợp cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu pyrrole 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và:(a) %wt gelatin; PPy cấu trúc dây nano với (b): 0,08 %wt gelatin Thời gian tổng hợp PPy 300 s đặc tính diện tích bề mặt riêng lớn cho thuận lợi cho trình cố định trực tiếp DNA dị lên cảm biến DNA nhờ tạo thành liên kết gốc amin dây nano PPy gốc phốt phát DNA Mối liên kết trực tiếp với khả truyền dẫn điện tử tốt dây nano PPy cho góp phần cải thiện độ nhạy cảm biến DNA 2.3.1.4 Ảnh hưởng nồng độ monome pyrrole tụ điện lý tưởng đặc tính khơng đồng độ gồ ghề vật liệu bề mặt điện cực Mối quan hệ trở kháng Z(ω) QCPE biểu diễn theo phương trình [15]: Z    (2.1) QCPE ( j ) n đó, ω = 2πf tần số góc, f tần số, n hệ số CPE, n có giá trị khoảng từ đến giá trị n đặc trưng cho tính khơng đồng độ gồ ghề bề mặt điện cực [64] Tương ứng với giá trị n = 1, 0,5, Q CPE đại diện cho tụ điện lý tưởng, điện trở hay thành phần Warburg [123] Bảng 2.2 Các thông số trở kháng mô theo mạch tương đương Randles Bề mặt điện cực Rs (Ω) Rct (KΩ) QCPE (μF) n χ2 (x 10-3) PPy NWs 317 23.63 1.19 0.82 2.84 pM 295.3 32.01 0.74 0.90 2.43 10 pM 282.1 32.25 0.78 0.90 1.75 100 pM 269.6 32.33 0.76 0.90 2.23 nM 256.4 32.40 0.85 0.89 1.71 10 nM 219.3 32.57 0.92 0.89 1.71 100 nM 214.4 34.66 0.92 0.89 1.63 300 nM 207.6 36.24 0.92 0.89 1.62 500 nM 202.6 36.39 0.93 0.89 2.13 PPy NWs/DNA dị/DNA đích Trong luận án này, n nhận giá trị từ 0,82 đến 0,90, chứng tỏ diện QCPE mơ hình mạch tương đương Randles cần thiết Kết phù hợp với kết có phân tích hình thái bề mặt cảm biến chức hóa dây nano PPy Giá trị nhỏ χ2 (chuẩn χ bình phương) cho thấy khoảng nồng độ DNA đích từ 10 pM đến 500 nM, việc sử dụng mơ hình Randles để mô tổng trở hệ hợp lý kết thu sau mô đáng tin cậy 2.4 Kết luận Một đóng góp luận án việc tổng hợp vật liệu polime dẫn PPy cấu trúc dây nano xác vị trí mong muốn (WE) sử dụng kỹ thuật điện hóa, khắc phục tình trạng tạo thành PPy cấu trúc hoa súp lơ Dây nano PPy tổng hợp trực tiếp điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực tĩnh, điện 0,75V giữ không đổi gelatin sử dụng với vai trị làm khn mềm định hướng cho phát triển dây nano PPy Khi nồng độ ban đầu monome Py 0,1 M thời gian thực phản ứng polime hóa 300 giây, dây nano PPy hình thành điện cực Pt với kích thước đồng phân bố đồng Chuỗi đơn DNA dò cố định trực tiếp bề mặt cảm biến sinh học sở dây nano PPy Hiện tượng lai hóa DNA khảo sát sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa Cảm biến DNA có giới hạn phát 10 pM 25 oC 12 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HĨA TÍCH HỢP HỆ VI LƯU 3.1 Mở đầu Phát triển từ kết đạt nội dung nghiên cứu với phép đo điện hóa thực hệ đo mở, nội dung nghiên cứu 2, mục đích tích hợp cảm biến DNA điện hóa với bình phản ứng kích thước nhỏ có khả ghép nối với mạch đo nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, đồng thời nâng cao tỷ lệ tín hiệu/nhiễu tập trung hướng đến Việc thu nhỏ bình phản ứng, giảm lượng mẫu tiêu thụ có ý nghĩa quan trọng phân tích y sinh mẫu phân tích mẫu máu, vi khuẩn, virus… Cũng nội dung nghiên cứu 2, dây nano PPy tổng hợp bên vi bình phản ứng nhằm biến tính bề mặt cảm biến (đã tích hợp với hệ vi lưu) thay tổng hợp hệ mở nội dung nghiên cứu Cấu trúc dây nano PPy hệ ba điện cực tích hợp với vi bình phản ứng hi vọng cải thiện đặc tính cảm biến sinh học điện hóa, đờ ng thời giúp thu nhỏ ̣ thố ng phân tích 3.2 Thực nghiệm 3.2.2 Hệ ba điện cực tích hợp kết nối với bình phản ứng mini Chế tạo hệ ba điện cực tích hợp: Hệ ba điện cực Pt tích hợp bao gồm WE với diện tích 0,8 mm2, CE với diện tích mm2 điện cực so sánh thay Hình 3.1: (a): mặt nạ cho chế tạo hệ ba điện cực tích hợp; (b): mặt nạ cho chế tạo khuôn SU-8 Chế tạo hệ vi lưu sở vật liệu PDMS: Khuôn SU-8 chế tạo sử dụng kỹ thuật quang khắc, hình 3.3 Phiến SU-8 dùng làm khuôn để chế ta ̣o các vi kênh PDMS (polydimethylsiloxane) Khuôn SU-8 đươ ̣c cố đinh ̣ vào mô ̣t điã nhựa petri Tiề n chấ t polime PDMS và chấ t đóng rắn (curing agent) (theo tỷ lê ̣ 10 : về thể tích) đươ ̣c trô ̣n đề u và rót vào điã Sau đó, hỗn hợp đươ ̣c xử lý biǹ h hút chân không để loa ̣i bỏ hoàn toàn các bo ̣t khí và sẽ đóng rắ n sau Hình 3.3: Quy trình chế tạo khn SU-8 gia nhiêṭ ta ̣i 70 oC Cuố i cùng, phiế n PDMS đươ ̣c lô ̣t khỏi khuôn, cắ t thành từng vi kênh riêng biêt,̣ khoan lỗ và luồ n dây để ta ̣o đầ u vào và đầ u cho mỗi vi kênh Gắ n kế t vi kênh điện cực: Phương pháp gắ n kế t plasma oxy: Điện cực sau đươ ̣c xử lý bề mă ̣t bằ ng phương pháp hoá sẽ gắn kết với vi kênh PDMS buồ ng plasma oxi (10 Pa, 20 W, 20 s) Sự gắ n kế t giữa vi kênh PDMS và điêṇ cực củng cố cách gia 13 nhiêṭ 15 phút 70 oC, sau đó giảm nhiê ̣t đô ̣ về nhiệt độ phòng 3.2.3 Tổng hợp dây nano PPy bin ̀ h vi phản ứng Dây nano PPy tổng hợp vi biǹ h phản ứng sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực tĩnh (PS-Potentiostatic): điện phân cực không đổi là 0,5 V thời gian phản ứng là 1200 giây và quét thế vòng tuầ n hoàn: điêṇ áp từ đế n 0,6 V, vòng, tố c đô ̣ quét 25 mV/s Các bước xử lý bề mặt điện cực pha chế dung dịch điện li thực tương tự trình bày phần 2.2.3 3.2.4 Cố định DNA dò điện cực Pt-PPy NWs Quy trình cố định DNA dị lên điện cực Pt-PPy NWs thực tương tự trình bày phần 2.2.4 Tuy nhiên, hệ điện cực Pt tích hợp gắn kết với vi kênh PDMS nên dung dịch DNA dị cần bơm vào vi bình phản ứng thay thực việc nhỏ phủ trực tiếp lên bề mặt điện cực làm việc (WE) 3.2.5 Phát hiêṇ tín hiêụ lai hoá DNA sử du ̣ng Lock-in Amplifier Tín hiệu dòng xoay chiề u với tần số 10 kHz biên độ 100 mV từ nguồ n phát điện thiế t bi ̣Lock-in Amplifier SR830 đặt vào hai điện cực giống tích hợp các bình vi phản ứng Trong đó, bề mặt của điện cực cố định DNA dò/PPy NWs (đóng vai trò điện cực làm việc) bề mặt điện cực lại biế n tin ́ h chỉ với PPy NWs (đóng vai trò điê ̣n cực so sánh) Hình 3.6: Hê ̣ đo vi sai sử dụng Lock-in Amplifier SR830 DSP Khi µl dung dich ̣ DNA đích (chuỗi bổ sung) bơm vào biǹ h vi phản ứng, hiêṇ tươ ̣ng lai hoá DNA sẽ diễn bề mă ̣t điện cực làm việc (đã đươ ̣c cố định DNA dò), dẫn đến thay đổi điêṇ tích của màng dẫn, đó làm chuyể n dich ̣ tín hiệu đầu Tín hiệu đầu từ điện cực làm việc điện cực so sánh cảm biến qua hai điện trở k, thu thập kênh A kênh B Lock-in, sau xử lý hiển thị kết máy tính 3.3 Kết và thảo luâ ̣n 3.3.1 Kế t quả chế ta ̣o ̣ vi kênh tích hơ ̣p với điêṇ cư ̣c Hình 3.7 mơ tả hệ vi kênh PDMS tích hợp với điện cực Kích thước chip 12 x 15 mm Thể tích vi bình phản ứng tính theo cơng thức: V = a b h Trong đó: a chiều rộng kênh, a = 3,5 mm = 3500 µm Hình 3.7: Cảm biến ba điện b chiều dài kênh, b = mm = 5000 µm cực tích hợp sử dụng PRE Pt h chiều cao kênh, h = 260 µm bình phản ứng mini 14 Như vậy, hệ ba điện cực tích hợp với vi kênh PDMS tích nhỏ: V = 3,5 0,26 = 4,55 mm3 = 4,55 µl 3.3.1.1 Kế t quả đo bề dày vi kênh PDMS Với tố c đô ̣ quay phủ SU-8 3050 thấ p nhấ t, 500 rpm, kế t quả đo bề dầy của vi kênh PDMS là cao nhấ t, 260 µm Khi tăng tố c đô ̣ quay phủ SU-8 3050, bề dày của vi kênh PDMS đo đươ ̣c sẽ giảm Trong nghiên cứu này, viê ̣c chế ta ̣o vi kênh PDMS là nhằ m mu ̣c đích tích hơ ̣p với cảm biế n sinh ho ̣c điêṇ hoá, sau đó sẽ thực hiêṇ quá triǹ h polime hoá điêṇ hóa bin ̀ h vi phản ứng nhằ m biế n tiń h bề mă ̣t cảm biế n sở dây nano PPy, đó, bề dày vi kênh PDMS khoảng 260 µm là phù hơ ̣p với mu ̣c đích nghiên cứu và tố c đô ̣ quay phủ SU-8 đươ ̣c lựa cho ̣n cho các thí nghiê ̣m tiế p sau là 500 rpm 3.3.1.2 Kế t quả gắ n kế t vi kênh PDMS và điê ̣n cực Quy trình gắ n kế t vi kênh PDMS với điêṇ cực bằ ng phương pháp plasma oxi và phương pháp sử du ̣ng chấ t đóng rắn cho kế t quả tố t, nhiên, phương pháp gắn kết plasma oxi lựa chọn cho thí nghiệm tiếp sau ưu điểm bật thời gian gắn kết nhanh chất lượng gắn kết tốt, ổn định qua nhiều thí nghiệm PDMS hợp chất polime với mắt xích -O-Si(CH3)2- Khi vi kênh PDMS xử lý buồng plasma oxy, nhóm -CH3 thay nhóm -OH [107] Sau đó, vi kênh PDMS ốp lên điện cực liên kết cộng hóa trị bền vững hình thành nhóm >Si(CH3)-OH nhóm ≡ Si-OH (đồng thời giải phóng phân tử H2O) ngun nhân dẫn đến gắn kết bền chặt ổn định vi kênh PDMS điện cực 3.3.3 Tổ ng hơ ̣p PPy NWs bin ̀ h vi phản ứng Ả nh FE-SEM của PPy NWs Hình 3.13 là ảnh FE-SEM dây nano PPy đươ ̣c tổng hợp sử dụng kỹ thuâ ̣t điêṇ hoá phân cực thế tiñ h, hình 3.13a, và quét thế vòng tuầ n hoàn, hiǹ h 3.13b Đố i với cả hai trường hơ ̣p, sản phẩ m polime dẫn PPy đề u hình thành bề mặt điện cực làm việc với cấu trúc dây nano, đường kính dây khoảng 80 nm đến 110 nm và chiề u dài dây cỡ vài micromet Kích thước dây nano PPy tổng hợp đồng dây nano phân bố tương đối bề mặt điện cực Việc tổng hợp vật liệu polime Hình 3.13: Ả nh FE-SEM dây nano PPy được tổng hợp vi bình phản ứng sử dụng kỹ thuật điê ̣n hoá: PPy cấu trúc dây nano (a) phân cực thế tiñ h (0,5 V, 1200 s);(b) quét thế vòng xác vị trí mong muốn (WE) tuầ n hoàn (0-0,6V, vòng, tố c đợ quét 25 mV/s) vi kênh tích nhỏ (4 µl) thách thức mà thời điểm tại, nhóm nghiên cứu giới làm Kết nghiên cứu đóng góp luận án Thơng thường, phản ứng tổng hợp điện hóa vật liệu cấu trúc nano thực vi kênh (hệ đo mở), sau đó, tiến hành bước gắn kết vi kênh hệ điện cực Tuy nhiên, lựa chọn sử dụng phương pháp gắn kết plasma oxi (với ưu điểm bật thời gian gắn kết nhanh, chất lượng gắn kết tốt, phù hợp với mục 15 đích chế tạo hệ thống phân tích thu nhỏ), sản phẩm PPy NWs điện cực làm việc bị phá hủy mơi trường plasma oxi, đó, cần thực qui trình gắn kết vi kênh hệ điện cực trước, sau thực phản ứng trùng hợp điện hóa nhằm tổng hợp PPy cấu trúc dây nano vi kênh Vai trò gelatin phát triển dây nano PPy bình vi phản ứng Để hiểu rõ vai trò gelatin phát triển dây nano PPy bình vi phản ứng, q trình tổng hợp điện hóa thực sử dụng kỹ thuật phân cực tĩnh (0,5 V, 150 s) với 0,08 %wt gelatin mà khơng có monome Py, hình 3.15a có 0,1 M monome Py, hình 3.15b Trên hình 3.15a, quan sát thấy khối gelatin hình viên nang hình thành với đường kính khoảng µm Trong đó, hình 3.15b, dây nano PPy với đường kính khoảng 100 nm bắt đầu phát triển xung quanh khối gelatin Hình 3.14: Ảnh FE-SEM sản phẩm tổng hợp điện hóa sử dụng kỹ thuật phân cực tĩnh (0,5 V, 150 s), dung dịch điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, gelatin 0,08 % wt và: (a) khơng có Py; (b) Py 0.1 M vi bình phản ứng Gelatin có cấu trúc chuỗi dài gồm nhiều axit amin khác với nhóm chức -NH2 -COOH Các nhóm -NH monome Py tạo thành liên kết hidro với nhóm -COOH gelatin, hình 3.16 Kết là, monome Py hấp phụ bề mặt Hình 3.15: Liên kết hidro chuỗi gelatin tiếp tục polime hóa để phát triển monome Py gelatin thành dây nano PPy Như vậy, gelatin đóng vai trị khn mềm định hướng cho hình thành vật liệu PPy cấu trúc dây nano [38] 3.3.4 Phát hiện tượng lai hóa DNA Khi µl DNA đích nM bơm vào vi bình phản ứng, tượng lai hóa DNA diễn nhanh, đặc trưng thay đổi tín hiệu đầu (sự chênh lệch thế, ΔE = 33 mV) thời gian đáp ứng vài giây, hình 3.18a Điều giải thích tượng lai hóa DNA diễn bề mặt điện cực làm Hình 3.18: Tín hiệu lai hóa DNA, CDNA dị = 10 μM, T = 298K: (a) Chuỗi DNA đích nM; (b) Chuỗi DNA đích khơng kết cặp nM 16 việc (đã đươ ̣c cố định DNA dò), dẫn đến thay đổi điêṇ tích của màng dẫn, đó làm chuyể n dich ̣ tín hiệu đầu Thí nghiệm lặp lại tương tự với chuỗi DNA đích khơng kết cặp, tín hiệu đầu gần không thay đổi (sự chênh lệch thế, ΔE = mV) ổn định sau phút, hình 3.18b Các mẫu DNA đích với nồng độ khác bơm vào vi bình phản ứng tích hợp với cảm biến DNA điện hóa Từ kết đo vi sai, tính giá trị chênh lệch thế, ΔE (mV), tương ứng với nồng độ DNA đích khác thêm vào bình điện hóa Trên sở đó, xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tín hiệu đáp ứng, ΔE, nồng độ DNA đích thêm vào vi bình phản ứng, hình 3.19 Kết thực nghiệm cho thấy giới hạn mà cảm biến phát 20 pM DNA đích Khi tăng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến µM, kế t quả đo vi sai, ∆E, tăng lên đạt bão hịa nồng độ 200 nM DNA đích chứng tỏ có tăng lên số lượng bắt cặp DNA đích - DNA dị bề mặt dây nano PPy Hình 3.19: Tín hiệu lai hóa DNA tương ứng với giá trị nồng độ DNA đích khác Hình 3.19 cho thấy, cảm biến DNA điện hóa đạt tuyến tính tốt khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 bình phương hệ số tương quan đạt 0,9932 3.4 Kết luận Vi kênh PDMS hệ ba điện cực tích hợp sử dụng PRE Pt thiết kế, chế tạo gắn kết Dây nano PPy tổng hợp vi bình phản ứng thay hệ mở Việc tổng hợp vật liệu PPy cấu trúc dây nano xác vị trí mong muốn (WE) vi kênh tích nhỏ (4 µl) thách thức mà thời điểm tại, nhóm nghiên cứu giới làm Kết đóng góp luận án Trong q trình polime hóa điện hóa, sử dụng PRE Pt, điện 0,5 V giữ không đổi thay vì giá tri ̣ 0,75 V áp du ̣ng cho ̣ mở sử du ̣ng điê ̣n cực so sánh Ag/AgCl (KCl baõ hòa) Vai trò gelatin phát triển dây nano PPy giải thích Dây nano PPy hiǹ h thành vi bình phản ứng có tính đồng nhấ t cao sự phân bố đồ ng đề u khắ p bề mă ̣t điê ̣n cực, thuận lợi cho q trình cố định DNA dị lên cảm biến DNA 17 Sợi đơn DNA dò cố định trực tiếp lên cảm biến sinh học sở dây nano PPy Hiện tượng lai hóa DNA diễn vi bình phản ứng khảo sát sử dụng phương pháp đo vi sai Giới hạn phát cảm biến 20 pM nhiệt độ 25 oC Cảm biến đạt tuyến tính tốt khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 bình phương hệ số tương quan đạt 0,9932 Bên cạnh đó, việc tích hợp cảm biến DNA điện hóa vi bình phản ứng giúp thu nhỏ hệ thống phân tích giảm đáng kể lượng mẫu tiêu thụ so với thực phép đo hệ mở Kết đóng góp luận án NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HĨA TÍCH HỢP BÌNH PHẢN ỨNG MINI ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN VIRUS NEWCASTLE 4.1 Mở đầu Sau hoàn thành nội dung nghiên cứu với qui trình đo lường điện hóa thực bình điện hóa thu nhỏ, nội dung nghiên cứu 3, luận án tiến gần thêm bước đến ứng dụng thực tiễn Các kết đạt luận án không dừng lại báo khoa học mà cịn có khả hướng đến hợp tác với công ty, nhà sản xuất Trong nội dung nghiên cứu 3, thay sử dụng DNA làm phần tử dị cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, địi hỏi chi phí cao thời gian dài, luận án sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà – sản phẩm bán thị trường công ty cổ phần công nghệ sinh học thú y BTV (BiotechVet) cung cấp, tương lai hướng đến việc đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt hàng từ phía cơng ty Cũng nội dung nghiên cứu 3, cảm biến miễn dịch điện hóa Hình 4.1: Mơ sơ lược hệ điện hóa tích hợp bình phản ứng mini phát mini kèm bình phản ứng mini đầu đo tích hợp triển phù hợp với định hướng ứng dụng phát triển vi phân tích điện hóa phát virus gây bệnh Bộ vi phân tích điện hóa, hệ thống hồn chỉnh bao gồm: 01) đầu đo cố định kháng nguyên/kháng thể; 02) bình phản ứng kích thước nhỏ đảm bảo nâng cao tỷ số tín hiệu/nhiễu, tăng độ xác giảm thể tích mẫu phân tích; 03) thu thập xử lý tín hiệu tích hợp hệ thống; có khả mở rộng phát triển tảng (platform) cho việc phân tích đối tượng y sinh khác nhau, hình 4.1 Cảm biến sinh học điện hóa tích hợp bình phản ứng mini phát triển theo định hướng ứng dụng chế tạo vi phân tích điện hóa cho phép phát nhanh dấu hiệu virus gây bệnh giải nhược điểm phương pháp phân tích y sinh truyền thống giữ vai trò quan trọng việc thực nhiệm vụ phân tích lưu động Nội dung nghiên cứu bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay Ag/AgCl 18 bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà lên bề mặt cảm biến miễn dịch; nghiên cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini chế tạo phát virus Newcastle 4.2 Thực nghiệm 4.2.2 Thiết kế chế tạo hệ điện cực tích hợp bình phản ứng mini Hệ cảm biến bao gồm ba điện cực: WE/cảm biến miễn dịch (cố định kháng thể), CE RE Hai điện cực vàng WE CE tích hợp lên chip Kích thước chíp 12 x 3,6 mm, đường kính WE mm, diện tích WE πR2 = π0,52 =0,785 mm2 Điện cực so sánh thay Ag/AgCl chế tạo với kích thước nhỏ gọn (đường kính mm, chiều dài 10 mm) Thiết kế cho phép ghép nối với bình phản ứng mini tích nhỏ dao động từ 100 µL tới ml, cho phép thực phép đo với lượng mẫu nhỏ, đảm bảo độ xác cao, hình 4.3 Hình 4.3: Bình phản ứng mini kết nối với hệ điện cực Bình phản ứng mini thiết kế chế tạo sở kỹ thuật vi khí nhằm mục đích sử dụng lặp lại nhiều lần (chỉ cần thực thao tác đóng, mở thay điện cực tương ứng với phép đo khác nhau) 4.2.3 Cố định kháng thể bề mặt cảm biến Điện cực vàng sau làm bề mặt, ủ với 20 µl dung dịch PrA (1 mg/ml) nhiệt độ phịng giờ, sau tiếp tục ủ với 20 µl dung dịch GA % (30 phút, nhiệt độ phòng), cuối cùng, điện cực ủ với 20 µl kháng thể (60 µg/ml) ᵒC Sau kháng thể cố định lên bề mặt điện cực, 20 µl BSA 1% sử dụng để khóa phủ vị trí khơng đặc hiệu (30 phút, nhiệt độ phịng) Sau bước cố định, điện cực rửa nước khử ion sấy khơ khí N2 nhằm loại bỏ phần tử không tương tác tương tác yếu 4.2.4 Phát virus (bất hoạt) sử dụng cảm biến miễn dịch điện hóa 20 µl virus bất hoạt Newcastle nhỏ lên điện cực nhiệt độ phịng Sau đó, điện cực rửa với nước khử ion để loại bỏ phần tử đích khơng tương tác tương tác yếu Quá trình đo CV (Cyclic Voltammetry) thực hệ điện hóa EC301 từ Stanford Research Systems Bình điện hóa sử dụng ba điện cực: điện cực làm việc (WE) điện cực cảm biến miễn dịch/virus, điện cực đối (CE) điện cực Au tích hợp điện cực so sánh (RE) điện cực so sánh thay Ag/AgCl Dung dịch điện li gồm Fe(CN)63-/4- 0,03 M, KCl 0,1 M, khoảng quét từ -0,2 đến 0,5 V tốc độ quét 25 mV/s 4.2.5 Thống kê xử lý số liệu Để xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tín hiệu đầu cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml), mẫu virus 19 Newcastle (bất hoạt) có hàm lượng thay đổi từ 102 đến 106 EID50/ml (EID50: 50% Empryo Infective Dose – Liều nhiễm trùng phôi gà) sử dụng Từ đường CV thực nghiệm xác định giá trị dịng cực đại Ipeak ∆Ipeak theo công thức sau [67]: 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 = 𝐼𝑝,𝑎 − 𝐼𝑝,𝑐 (4.1) ∆𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 = 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 (0)− 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 (𝑖) 𝐼𝑝𝑒𝑎𝑘 (0) (4.2) Trong đó: Ipeak(0) dòng cực đại điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch); Ipeak(i) dòng cực đại điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA/Ag (cảm biến miễn dịch/virus Newcastle) 4.3 Kết và thảo luâ ̣n 4.3.2 Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể Dòng cực đại Ipeak điện cực Au/PrA (Ipeak, Au/PrA = 118,43 µA) giảm so với điện cực Au (Ipeak, Au = 123,25 µA) Giá trị Ipeak điện cực Au/PrA/GA/Ab (Ipeak, Au/PrA/GA/Ab = 114,51 µA) giảm so với điện cực Au/PrA (Ipeak, Au/PrA = 118,43 µA) Cuối cùng, sau khóa phủ vị trị tương tác khơng đặc hiệu sử dụng BSA, giá trị Ipeak điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (Ipeak, cảm biến miễn dịch = 112,01 µA) giảm so với điện cực Au (Ipeak, Au = 123,25 µA) Kết giải thích việc hấp phụ lớp PrA, Hình 4.10: Đường CV điện cực: (a): Au; (b): Au/PrA; (c): Au/PrA/GA/Ab (d): PrA/GA/Ab cuối Au/PrA/GA/Ab/BSA dung dịch PrA/GA/Ab/BSA dẫn đến sụt giảm K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M điện bề mặt lớp này, làm tăng giá trị điện trở chuyển điện tích cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào điện cực Au làm giảm cường độ dòng cảm biến Trong nội dung nghiên cứu 3, thay sử kháng thể IgG tinh chế làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch phần lớn công bố khác [21,30,106], luận án tập trung nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà lên bề mặt cảm biến Kháng thể IgG (đơn dòng đa dòng) phải sản xuất tinh chế phịng thí nghiệm tiêu chuẩn, sử dụng sinh phẩm thương mại kỹ thuật đại, vậy, địi hỏi chi phí cao thời gian dài [84,97] Tuy nhiên, theo Jones cộng [71], dịch bệnh truyền nhiễm thường diễn bất ngờ, khó dự đoán diễn dịch bệnh, dẫn đến khó khăn việc chủ động nguồn kháng thể IgG tinh chế cần thiết cho xét nghiệm thời gian ngắn Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng kháng thể IgY thu thập từ trứng gà, không cần phải qua qui trình tinh chế phức tạp, yêu cầu kỹ thuật đại, chi phí cao thời gian dài làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch khơng giúp giảm chi phí mà giải pháp hiệu nhằm phát kịp 20 thời virus gây bệnh vụ dịch bệnh truyền nhiễm khơng cịn phụ thuộc nhiều vào nguồn kháng thể IgG tinh chế 4.3.3 Đặc trưng tín hiệu tương tác virus – kháng thể Giá trị Ipeak điện cực cảm biến miễn dịch/virus Newcastle (Ipeak, cảm biến miễn dịch/virus Newcastle = 97,90 µA) giảm so với Ipeak cảm biến đo chưa có tương tác sinh học với virus Newcastle (Ipeak, cảm biến miễn dịch = 112,57 µA) Kết giải thích virus Newcastle gắn kết bề mặt cảm biến miễn dịch sở tương tác đặc hiệu virus - kháng thể, dẫn đến cản trở trình chuyển điện tích cặp oxi hóa khử [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- vào điện cực Au, kết mật độ dòng điện giảm Hình 4.13: Đường CV điện cực: (a): cảm biến miễn dịch; (b): cảm biến miễn dịch/virus VNNB dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s Hình 4.12: Đường CV của: (a): cảm biến miễn dịch (b): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s Khi tương tác không đặc hiệu kháng nguyên (virus viêm não Nhật Bản) - kháng thể (kháng virus Newcastle) diễn bề mặt cảm biến miễn dịch, giá trị Ipeak (Ipeak, cảm biến/virus VNNB = 113,10 µA) gần khơng thay đổi so với Ipeak cảm biến đo chưa có tương tác sinh học với virus viêm não Nhật Bản (I peak, cảm biến = 112,57 µA) Kết cho thấy cảm biến miễn dịch điện hóa chế tạo có độ chọn lọc tốt 4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu cảm biến miễn dịch 4.3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng thể Khi nồng độ kháng thể tăng từ 20 µg/ml đến 60 µg/ml, tín hiệu đầu cảm biến (∆Ipeak) tăng lên Kết giải thích nồng độ kháng thể tăng, số lượng kháng thể cố định hiệu bề mặt cảm biến tăng lên, nhờ đó, làm tăng xác suất bắt cặp với kháng nguyên đặc hiệu Trong nghiên cứu này, kháng thể sử dụng làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch kháng thể IgY kháng virus Hình 4.15: Ảnh hưởng nồng độ kháng thể Newcastle thu thập trực tiếp từ trứng gà đến giá trị ∆Ipeak cảm biến miễn dịch 21 nồng độ 60 µg/ml giá trị nồng độ kháng thể cao (dung dịch kháng thể cung cấp nhà sản xuất) Do đó, giá trị nồng độ kháng thể 60 µg/ml lựa chọn cho thí nghiệm tiếp sau 4.3.4.2 Ảnh hưởng thời gian bắt cặp kháng thể - virus Hình 4.16 biểu diễn đường CV điện cực: (a): cảm biến miễn dịch (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, 4.16: Đường CV điện cực: (a): cảm KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s thay đổi Hình biến miễn dịch (b-f): cảm biến miễn thời gian bắt cặp kháng thể - virus: (b): 15 dịch/virus Newcastle thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus phút, (c): 30 phút, (d): 45 phút, (e): 90 phút (f): 60 phút Từ đường CV thực nghiệm, tính tốn để thu giá trị Ipeak ∆Ipeak theo công thức (4.1) (4.2) Hình 4.17 cho thấy thời gian bắt cặp kháng thể - virus từ đến 15 phút, tín hiệu đầu cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) thấp gần hông thay đổi Khi tăng thời gian bắt cặp kháng thể - virus từ 15 đến 60 phút, Hình 4.17: Ảnh hưởng thời gian bắt tín hiệu đầu cảm biến tăng lên đạt cặp kháng thể - virus đến giá trị ∆Ipeak giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602) tương ứng với cảm biến miễn dịch thời gian bắt cặp kháng thể - virus 60 phút Tuy nhiên, tiếp tục tăng thời gian bắt cặp kháng thể - virus lên 90 phút tín hiệu đầu cảm biến miễn dịch không tăng lên Như vậy, khoảng thời gian 60 phút đủ để liên kết đặc hiệu kháng nguyên kháng thể thiết lập Do đó, thời gian bắt cặp kháng thể - virus 60 phút lựa chọn cho thí nghiệm tiếp sau 4.3.5 Độ nhạy cảm biến miễn dịch Hình 4.18 biểu diễn đường CV điện cực: (a): cảm biến miễn dịch (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle Hình 4.18: Đường CV điện cực: (a): dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl cảm biến miễn dịch (b-f): cảm biến miễn dịch/virus Newcastle thay đổi hàm 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s thay đổi hàm lượng virus Newcastle lượng virus Newcastle: (b):10 EID50/ml, (c): 103 EID50/ml, (d): 104 EID50/ml, (e): 105 EID50/ml (f): 106 EID50/ml Từ đường CV thực nghiệm tính giá trị Ipeak ∆Ipeak theo công thức (4.1) (4.2) tương ứng với hàm lượng virus Newcastle khác 22 Hình 4.19 đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tín hiệu đầu cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) hàm lượng virus Newcastle (log EID50/ml) Hình 4.19 cho thấy, giới hạn phát cảm biến miễn dịch 102 EID50/ml virus Newcastle Cảm biến miễn dịch điện hóa đạt tuyến tính tốt khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ là: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 bình phương hệ số tương quan (R2) đạt Hình 4.19: Sự thay đổi tín hiệu đầu cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) phụ thuộc vào hàm 0,9969 lượng virus Newcastle (log EID50/ml) 4.4 Kết luận Hệ ba điện cực sử dụng PRE Ag/AgCl thiết kế, chế tạo ghép nối với bình phản ứng mini Việc sử dụng PRE Ag/AgCl thay RE thương mại, sau tích hợp hệ điện cực với bình phản ứng mini (có khả sử dụng lặp lại nhiều lần, cần đóng, mở thay điện cực tương ứng với phép đo), giúp thu nhỏ hệ thống phân tích giảm lượng mẫu tiêu thụ, đóng góp luận án Kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà cố định làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch thay sử dụng kháng thể IgG tinh chế với qui trình tách chiết phức tạp địi hỏi chi phí cao thời gian dài Kết đóng góp luận án Cảm biến miễn dịch tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng phát virus Newcastle sử dụng phương pháp CV Khi nồng độ kháng thể cố định 60 µg/ml, thời gian bắt cặp kháng thể - virus giờ, tín hiệu đầu cảm biến đạt giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602) Giới hạn phát cảm biến 102 EID50/ml 25 oC Cảm biến đạt tuyến tính tốt khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 bình phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,9969 Như vậy, cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini phát triển phù hợp với định hướng ứng dụng phát triển vi phân tích điện hóa Bộ vi phân tích điện hóa, hệ thống hoàn chỉnh bao gồm: 01) đầu đo cố định kháng ngun/kháng thể; 02) bình phản ứng kích thước nhỏ đảm bảo nâng cao tỷ số tín hiệu/nhiễu, tăng độ xác giảm thể tích mẫu phân tích; 03) thu thập xử lý tín hiệu tích hợp hệ thống; có khả mở rộng phát triển tảng (platform) cho việc phân tích đối tượng y sinh khác Việc phát triển vi phân tích điện hóa nói giúp khắc phục nhược điểm phương pháp phân tích y sinh truyền thống có ý nghĩa quan trọng việc thực nhiệm vụ phân tích lưu động KẾT LUẬN CHUNG Các kết luận án tóm tắt sau: Đã phát triển cảm biến DNA điện hóa sở dây nano PPy: 23 Dây nano PPy tổng hợp điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực tĩnh, điện khơng đổi 0,75V gelatin sử dụng với vai trò khuôn mềm định hướng cho phát triển dây nano PPy Việc tổng hợp vật liệu polime dẫn PPy cấu trúc dây nano xác vị trí mong muốn (WE) sử dụng kỹ thuật điện hóa, khắc phục tình trạng tạo thành PPy cấu trúc hoa súp lơ đóng góp luận án Chuỗi đơn DNA dò cố định trực tiếp bề mặt cảm biến sinh học sở dây nano PPy Hiện tượng lai hóa DNA khảo sát sử dụng phương pháp phổ tổng trở điện hóa Cảm biến DNA có giới hạn phát 10 pM nhiệt độ 25 oC Đã phát triển cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu: Vi kênh PDMS hệ ba điện cực tích hợp sử dụng điện cực so sánh thay Pt thiết kế, chế tạo gắn kết Dây nano PPy tổng hợp xác vị trí mong muốn (WE) vi bình phản ứng tích nhỏ (4 µl) thay hệ mở Đây thách thức mà thời điểm tại, nhóm nghiên cứu giới làm Kết đóng góp luận án Sợi đơn DNA dò cố định trực tiếp lên cảm biến sinh học sở dây nano PPy Hiện tượng lai hóa DNA diễn vi bình phản ứng khảo sát sử dụng phương pháp đo vi sai Giới hạn phát cảm biến 20 pM nhiệt độ 25 oC Cảm biến đạt tuyến tính tốt khoảng nồng độ DNA đích từ 20 pM đến 20 nM tương ứng với phương trình liên hệ: ΔE = 14,03Log C – 16,26 R2 = 0,9932 Bên cạnh đó, việc tích hợp cảm biến DNA điện hóa vi bình phản ứng giúp thu nhỏ hệ thống phân tích giảm đáng kể lượng mẫu tiêu thụ so với thực phép đo hệ mở Kết đóng góp luận án Đã phát triển cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng phát virus Newcastle: Hệ ba điện cực sử dụng PRE Ag/AgCl thiết kế, chế tạo ghép nối với bình phản ứng mini Việc tích hợp hệ điện cực bình phản ứng mini, giúp thu nhỏ hệ thống phân tích giảm lượng mẫu tiêu thụ, đóng góp luận án Kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà (do BiotechVet cung cấp) cố định lên bề mặt cảm biến thay cho loại kháng thể IgG tinh chế làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch Đây đóng góp luận án Cảm biến miễn dịch tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng phát virus Newcastle sử dụng phương pháp CV Khi nồng độ kháng thể cố định 60 µg/ml, thời gian bắt cặp kháng thể - virus giờ, tín hiệu đầu cảm biến đạt giá trị cực đại (∆Ipeak = 0,1602) Giới hạn phát cảm biến 102 EID50/ml 25 oC Cảm biến đạt tuyến tính tốt khoảng hàm lượng virus Newcastle từ 102 đến 106 EID50/ml với phương trình liên hệ: ∆Ipeak = 0,0279LogN – 0,00306 R2 = 0,9969 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Thi Luyen Tran, Thi Xuan Chu, Dang Chinh Huynh, Duc Thanh Pham, Thi Hoai Thuong Luu, Anh Tuan Mai (2014), Effective immobilization of DNA for development of polypyrrole nanowires based biosensor, Applied Surface Science 314, p 260-265 (*IF 2016: 3.15*) Trần Thị Luyến, Huỳnh Đăng Chính, Phan Trung Nghĩa, Đỗ Phúc Quân, Chu Thị Xuân, Mai Anh Tuấn (2014), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật điện hóa tổng hợp dây nano polypyrrole định hướng ứng dụng cảm biến sinh học, Tạp chí Hóa học, 52(5A), p 61-65 Trần Thị Luyến, Chu Thị Xuân, Phạm Đức Thành, Huỳnh Đăng Chính, Mai Anh Tuấn (2014), Cố định trực tiếp DNA lên cảm biến sinh học sở dây nano polypyrrole, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 52(3B), p 166-173 Tran Thi Luyen, Huynh Dang Chinh, Pham Duc Thanh, Chu Thi Xuan, Mai Anh Tuan (2014), Label-free electrochemical biosensor based on polypyrrole nanowires, The 7th International Workshop on Advanced Materials Science and Nanotechnology (IWAMSN), Ha Long 2-6/11/2014, Vietnam, p 377 Luu Thi Hoai Thuong, Tran Thi Luyen, Do Phuc Quan, Pham Duc Thanh, Pham Thi Kim Thanh, Chu Thi Xuan, Mai Anh Tuan (2014), Design and fabrication of microfluidic biosensor composed of a PDMS microchannel and three electrode platform for electrochemical measurement, The 2nd International Conference on Advanced Materials and Nanotechnology (ICAMN), Hanoi, Vietnam, p 254-260 Thi Luyen Tran, Thi Xuan Chu, Phuc Quan Do, Duc Thanh Pham, Van Vu Quan Trieu, Dang Chinh Huynh and Anh Tuan Mai (2015), In-Channel-Grown Polypyrrole Nanowire for the Detection of DNA Hybridization in an Electrochemical Microfluidic Biosensor, Journal of Nanomaterials, vol 2015, Article ID 458629, pages (*IF 2016: 1.758*) Tran Thi Luyen, Chu Thi Xuan, Huynh Dang Chinh, Mai Anh Tuan (2015), Development of electrochemical biosensors integrated with microchambers for DNA detection, Tạp chí Hóa học, 53(6e4), p 169-173 Luu Thi Hoai Thuong, Tran Thi Luyen, Pham Duc Thanh, Trieu Van Vu Quan, Pham Van Tong, Ta Thi Nhat Anh, Chu Thi Xuan, Mai Anh Tuan (2015), Fabrication of PDMS-based Microfluidic Devices Toward Biomedical Applications, Ta ̣p chí Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ các Trường Đa ̣i ho ̣c Kỹ thuâ ̣t, 105A, p 38-42 Trần Thị Luyến, Chu Thị Xuân, Đỗ Phúc Quân, Phạm Đức Thành, Nguyễn Hải Nam, Nguyễn Quang Long, Huỳnh Đăng Chính, Mai Anh Tuấn (2015), Thiết kế chế tạo cảm biến điện hóa vi dịng chảy tích hợp điện cực giả so sánh để chế tạo dây nano polypyrrole nhằm cố định DNA, Hội nghị Vật lý chất rắn Khoa học vật liệu toàn quốc lần thứ (SPMS2015), Hồ Chí Minh 8-10/11/2015, Viet Nam, p 460-463 ... Tổng quan Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa sở dây nano polypyrrole Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình... cảm biến sinh học điện hóa sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu? ?? Mục tiêu luận án: Mục tiêu luận án nghiên cứu chế tạo tích hợp cảm biến sinh học điện hóa vi bình phản ứng ứng dụng phát. .. chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp với hệ vi lưu; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dị – DNA đích cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu chế tạo với phép đo điện hóa thực hệ đóng