Đang tải... (xem toàn văn)
PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20. Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến. PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), và kéo dài chuỗi (extending). ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một mạch đối nghĩa (antisense). Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.
Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 1) Nguồn: http://ibsgacademic.com/ Nguồn Ảnh: httpwww.yourgenome.orgfactswhat-is-pcr-polymerase-chain-reaction PCR phát minh quan trọng kỉ 20 Phản ứng nhằm chép tạo lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, phát mầm bệnh lây nhiễm HIV, viêm gan phát thay đổi mặt di truyền đột biến PCR thực thông qua bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), kéo dài chuỗi (extending) ADN sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, bị biến tính nhiệt tách thành mạch đơn, mạch mang nghĩa (sense) mạch đối nghĩa (antisense) Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, mồi gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa mồi khác gắn vào mạch đối nghĩa Trong đó, mồi trình tự oligonucleotide ngắn bám đặc hiệu vào vùng trình tự định Mồi điểm khởi đầu để polymerase thực hiển tổng hợp mạch bổ sung xác định đoạn ADN khuếch đại Do đó, việc thiết kế mồi định mức độ đặc hiệu suất phản ứng Nguyên tắc thiết kế mồi Độ dài mồi: Nên nằm khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu khoảng từ 1822base Điều phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu đủ ngắn để gắn dễ dàng vào khuôn nhiệt độ gắn mồi Đầu 3’ 5’ mồi: Cần thiết kế cho đầu 3’ mồi xuôi mở rộng phía mồi ngược đầu 3’ mồi ngược mở rộng phía mồi xuôi gắn vào mạch bổ sung Nếu ngược lại sản phẩm PCR tạo Nguồn Ảnh: Antisense Science Nhiệt độ nóng chảy mồi Tm: Điểm nhiệt độ định nghĩa điểm nhiệt mà 50% sợi đôi ADN phân tách tạo sợi đơn Điểm nhiệt quan trọng pha gắn mồi, Tm nên nằm khoảng 50-65oC Nhiệt độ nóng mồi 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không xác Nhiệt độ Tm hai mồi không chênh lệch 2oC, nhiệt độ chênh lệch 5oC tạo sản phẩm Công thức tính Tm sau: Công thức đơn giản: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T) Công thức chứa nồng độ muối: Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%(G+C)) – 675/n Trong đó: [Na+] nồng độ phân tử muối, n số base mồi 4 Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy mồi Nhiệt độ gắn mồi thấp dẫn đến lượng sản phẩm PCR tạo thấp, không đủ số lượng phức hợp lai mồi khuôn Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu tạo nhiều nhiệt độ gắn mồi thấp Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công thức sau: Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9 Mật độ GC: Ảnh hưởng đến Tm, mật độ GC nên nằm khoảng 50 - 60% Kẹp GC: Nên có G C đầu 3’ mồi để giúp cho đầu 3’ mồi liên kết mạnh Tuy nhiên nên tránh việc base đầu 3’ có nhiều G C gây liên kết đầu 3’ mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu Lưu ý cấu trúc bậc thiết kế mồi a) Hình thành tượng kết cặp (dimer): Là hiên tương mồi thay gắn vào khuôn gắn vào mồi ngược với với nó, tạo sản phẩm PCR có kích thước nhỏ làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn Do cần tránh tạo tượng kết cặp Hình thành dimer hai mồi Nguồn ảnh: PREMIER Biosoft b) Cấu trúc kẹp tóc: hình thành tương tác bên đoạn mồi Cần tránh điều làm giảm hiệu phản ứng PCR Lặp: tượng lặp lại nhiều lần trình tự mồi trình tự đôi (VD: ATATATATAT) đơn (VD: GGGGG) Điều gây bắt cặp nhầm số lần lặp tối đa mồi lần lặp cho hai trường hợp 9 Tương đồng chéo: Là tượng mà cặp mồi khuếch đại gene khác có hỗn hợp ban đầu Để tránh tượng này, mồi sau thiết kế cần đưa lên BLAST để so sánh kiểm tra độ đặc hiệu Thiết Kế Mồi Cho Phản Ứng PCR (Phần 2) Nguồn ảnh: wikimedia Bài thiết kế mồi cho phản ứng PCR phần nói nguyên lý để giúp thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR Tuy vậy, việc thiết kế mối khó thực thủ công có nhiều thông số phải tính đến Do nhà tin sinh học phát triển nhiều phần mềm trợ giúp công việc thiết kế mồi Trong hướng dẫn chi tiết cách sử dụng phần mềm thiết kế mồi phổ biến miễn phí Primer-Blast để thiết kế cặp mồi mong muốn Hơn nữa, viết giới thiệu đưa so sánh số phần mềm thiết kế mồi khác Hướng dẫn sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer – Blast Primer-BLAST công cụ phát triển NCBI giúp người dùng thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR cụ thể Primer-BLAST sử dụng mã nguồn mở Primer3 để thiết kế mồi, sau dùng công cụ BLAST thuật toán định tuyến tổng quát (global alignment) để kiểm tra sở liệu NCBI nhằm tránh sai sót kết cặp, tương đồng chéo nguyên nhân dẫn đến phản ứng PCR không hiệu Quá trình thiết kế đoạn mồi sử dụng Primer-BLAST thường diễn theo bước: Thu thập khuôn mẫu Thiết kế đoạn mồi 1.1 Thu thập khuôn mẫu Một ưu điểm lớn sử dụng Primer-BLAST người dùng tận dụng tối đa nguồn sở liệu từ NCBI Ví dụ sau hướng dẫn thiết kế mồi cho đoạn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein virus viêm gan siêu vi B Bước 1: Truy cập sở liệu NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) chọn “Nucleotide database” tìm kiếm sử dụng từ khóa “Hepatitis B virus genome” Bước 2: Kết trả hàng loạt liệu gen khác virus viêm gan siêu vi B Chúng ta chọn kết Ở phần kết số này, có định dạng là: GenBank, FASTA Graphics Để thu chuỗi khuôn mẫu chọn FASTA Graphics có lời khuyên nên sử dụng Graphics NCBI hiệu nhiều Vì mục chọn Graphics để đánh giá trực quan toàn bộ gen virus (xem hình 1) Bước 3: Bộ gen virus biểu diễn dạng hình ảnh trực quan (Hình 2) Toàn gen thích click vào gen thông tin chi tiết gen Trong ví dụ này, chọn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein Bước 4: Bảng nhỏ lên sau chọn gen có chứa dòng “FASTA View” Click vào vào mục bắt đầu ký hiệu NC_ chuỗi gene dạng file FASTA (hình) Vậy bước đầu thu thập khuôn mẫu hoàn thành sở liệu NCBI Lưu ý: Như phần Graphics cung cấp cho đoạn gen theo chiều ngược lại (Gen mang màu đen) Vì trước thực thiết kế mồi, cần phải đảo ngược đoạn khuôn mẫu lại cho chiều 5’-3’ 1.2 Thiết kế đoạn mồi Bước 1: Truy cập trang chủ phần mềm Primer-BLAST địa chỉ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Giao diện PrimerBLAST hình (1) Khung nhập liệu chuỗi khuôn mẫu: Nhập chuỗi dạng file FASTA (2) Thông số nhiệt độ nóng chảy (Tm )của đoạn mồi : điều chỉnh giống với thông số nguyên tắc thiết kế mồi phần loạt viết thiết kế mồi cho phản ứng PCR Ngoài nhiều thông số nâng cao khác mặt Vì hầu hết thông số dạng mặc định Bước 2: Đánh giấu bỏ dòng “Enable search for primer pairs specific to the intended PCR template” để bỏ qua việc tìm kiếm cặp mồi có sẵn sở liệu NCBI Sau thu thiết kế primer cách ấn vào ô “Get Primers” Cuối cùng, kết đoạn mồi thu dạng: hình ảnh trực quan thông tin chi tiết kết 2 Đánh giá phần mềm phổ biến Phần mềm FastPCR công cụ tích hợp hàng loạt tính toàn diện chuyên nghiệp dùng để thiết kế loại mồi cho PCR Mặc dù vậy, điểm yếu phần mềm phức tạp sử dụng Primer-BLAST phần mềm online cung cấp The National Center forBiotechnology Information (NCBI) Phần mềm tạo nên nhờ kết hợp Primer3 BLAST Nổi trội nhờ khả sử dụng sở liệu lớn NCBI bằngBLAST công cụ online, Primer-BLAST không tránh khỏi hạn chế Primer3 phần mềm mã nguồn mở tiếng BatchPrimer3 phát triển sau Đặc điểm bật BatchPrimer việc chạy web online khả chạy thông lượng lớn đầu vào giúp BatchPrimer3 công cụ phổ biến thiết kế mồi cho PCR nhằm thay cho người anh Primer3 BatchPrimer3 (Primer3) IDT SciTools: PrimerQuest, OligoAnalyzer 3.1 PerlPrimer Đặc điểm jPCR Tool &FastPCR NCBI/PrimerBLAST (Primer3) Độ dài Primer (nt) 12-500 15-30 Chưa rõ 16-35 12-30 Giới hạn độ dài khuôn mẫu (nt) Không giới hạn 50,000 Chưa rõ Không giới hạn Không giới hạn Tốc độ tính toán nhanh chậm chậm chậm chậm Cho phép chạy thông lượng lớn với hàng loạt khuôn mẫu hàng loạt mục tiêu khuôn lúc có không không Tùy chọn PCR cho khuôn mẫu có có có có có Degenerated nucleotides at all operation (Tm calculation, searches and probe, primer design etc.) có có không Cho phép sửa đổi LNA (Nucleotide khóa) nucleotide khác có không không Tính toán nhằm tối ưu hóa nhiệt độ anneal sử dụng có không không không không BatchPrimer3 (Primer3) IDT SciTools: PrimerQuest, OligoAnalyzer 3.1 PerlPrimer Đặc điểm jPCR Tool &FastPCR NCBI/PrimerBLAST (Primer3) Kiểm tra đầu 3’ kết thúc mồi giao tự tạo dimer có Lỗi có có có Kiểm tra mồi nội giao tự tạo dimer có Lỗi không Lỗi có Tìm kiếm khuôn mẫu sử dụngBLAST không Kiếm tra khuôn mẫu có có không không không Kiểm tra khuôn mẫu dựa thư viện sẵn có có có không Bảng 1: So sánh công cụ thiết kế Primer phân tích oligonucleotide phổ biến (http://primerdigital.com/tools/soft.html) Ghi chú: Bảng so sánh mang tính chất tương đối công ty cung cấp phần mềm jPCR Tool &FastPCR thống kê, khả đặc điểm mang tính chất có lợi so với công cụ khác Mặc dù vậy, tài liệu đáng để tham khảo [...]... PerlPrimer Đặc điểm jPCR Tool &FastPCR NCBI/PrimerBLAST (Primer3) Kiểm tra đầu 3’ kết thúc của mồi giao và tự tạo dimer có Lỗi có có có Kiểm tra mồi nội giao và tự tạo dimer có Lỗi không Lỗi có Tìm kiếm khuôn mẫu sử dụngBLAST không có không không có Kiếm tra khuôn mẫu có có không không không Kiểm tra khuôn mẫu dựa trên thư viện sẵn có có có không không có Bảng 1: So sánh các công cụ thiết kế Primer và phân... cụ thiết kế Primer và phân tích oligonucleotide phổ biến hiện nay (http://primerdigital.com/tools/soft.html) Ghi chú: Bảng so sánh trên mang tính chất tương đối vì do công ty cung cấp phần mềm jPCR Tool &FastPCR thống kê, vì thế khả năng các đặc điểm mang tính chất có lợi hơn so với các công cụ khác Mặc dù vậy, đây là tài liệu đáng để tham khảo