TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA KỸ THUẬT VÀ CNTP Chủ đề : XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GEN ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM GVHD: TS.ĐOÀN THỊ NGỌC THANH NHÓM: Mai Thị Bích Thuyền 013142051 Trần Thị Mộng Thơ 013142047 Lê Thị Yến Nhi 013142054 Ngô Thị Trúc Quyên 013142043 Hà Thị Thùy Trang 013142062 I II III • TỔNG QUAN • QUY TRÌNH THỰC HIỆN • ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCRRFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN I TỔNG QUAN 1977, Jeffrys Flavell dùng enzyme restriction để lập đồ giới hạn gene β-globin thỏ Ứng dụng kỹ thuật gene βglobin người thấy vị trí enzyme tìm thấy 300bp NST số 11 1979, ba vị trí cắt (1 enzyme Pst I HindIII) liên quan đến đa hình cá thể I TỔNG QUAN Locus cá thể khác có hay nhiều vị trí cắt khác nên sản phẩm cắt giới hạn có chiều dài khác →Sự đa dạng chiều dài phân đoạn cắt giới hạn ( restriction fragment length polymorphism- RFLP) RFLP: kỹ thuật khai thác khác biệt trình tự DNA DNA mẫu cắt thành đoạn nhỏ cách sử dụng enzyme cắt giới hạn, sau đoạn DNA nhỏ tạo thành phân tách dựa theo kích thước kỹ thuật điện di gel I TỔNG QUAN phát đột biến phân biệt giống, phân biệt cá thể RFLP lập đồ di truyền phát gene chuyển trình chuyển gene trồng I TỔNG QUAN -1980, David Botstein ứng dụng kỹ thuật RFLP “xây dựng đồ di truyền người” -1985: Jeffreys phát triển kỹ thuật RFLP để thử nghiệm di truyền DNA ( DNA-fingerprinting) -2013, Nejat Mahdieh “Tổng quan Đột biến phương pháp phát rối loạn di truyền” I TỔNG QUAN -2006, Trần Như Ngọc ”Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định đa dạng di truyền nấm Metarrhizium anisopliae nấm Beauveria bassiana ký sinh côn trùng gây hại” -2011,Nguyễn Thị Thu Hương ”Nghiên cứu đột biến gen MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không không polyp di truyền kỹ thuật PCR-RFLP” -2011, Phạm Minh Huệ “Phát loại đột biến gen ty thể người Việt Nam kỹ thuật PCR-RFLP” -2013,Lê Hữu Song, Trần Thị Huyền Trang “nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP xác định kiểu gen virus viêm gan B” II QUY TRÌNH THỰC HIỆN RFLP Các bước thực hiện: Tách chiết tinh DNA mẫu Thực phản ứng cắt DNA với chủng loại enzyme Điện di tiến hành phản ứng Southern lot II QUY TRÌNH THỰC HIỆN RFLP Hóa chất sử dụng: -Hóa chất dùng để thu nhận tách chiết DNA : + Đệm STE(NaCl, Tris-HCl, EDTA) +Dung dịch PCl( Phenol: Chloroform: Isoamylcohol Tỉ lệ 25:24:1) +TE 1X -Hóa chất chạy điện di: + TAE, Loading dye, nước cất lần, agarose polyacrylamide II QUY TRÌNH THỰC HIỆN Hóa chất sử dụng: -Hóa chất cho phản ứng cắt: +Buffer 10X enzyme cắt giới hạn +Enzyme cắt giới hạn +Nước +Sản phẩm DNA tinh III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Quypháp trìnhlytách Phương tríchchiết DNA DNA từ mẫu tế bào niêm mạc miệng(quy trình tách chiết kit Buccal Swab DNA extraction kit hãng GeneShun Biotech) III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Khuếch đại vùng exon 16 gene ACTN3 R577X kỹ thuật PCR: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Khuếch đại vùng exon 16 gene ACTN3 R577X kỹ thuật PCR: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Tinh sản phẩm PCR: Thêm lần thể tích đệm BD vào, trộn Chuyển sang ống DNA spin column/ 2ml Ủ phút, li tâm 12000rpm/1 phút,bỏ dịch Thêm 500 µl đệm rửa PE Li tâm 12000rpm/1 phút,, bỏ dịch Li tâm tiếp cột lọc 12000rpm/ phút Chuyển cột vào ống li tâm 1,5 ml Thêm 30-50 µl đệm EB/ nước deion tiệt trùng Ủ phút, li tâm 12000 rpm/ phút DNA tinh III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Phương pháp PCR-RFLP Thành phần điều kiện phản ứng cắt Enzyme giới hạn DdeI III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Sản phẩm PCR tinh tiến hành điện di gel agarose với nồng độ khác nhau: 0.8%, 1.5%, 2% Thời gian 30-45 phút, hiệu điện 100V III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận Khuếch đại vùng exon 16 gene ACTN3 thông qua phản ứng PCR III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận Tinh sản phẩm PCR: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận Phân tích RFLP-PCR vùng exon 16 gene ACTN3: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN B11 Kết thảo luận Kết giải trình tự ACTN3 R577X B9 K18 III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận Phân bố tần số kiểu gene ACTN3 R577X tần số alen R/X: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận - Kiểu gene RR có liên quan mật thiết với sức nhanh mạnh VĐV kiểu gene XX (gây thiếu hụt αactinin-3, tạo nhiều sợi co chậm) công nhận có đóng góp vào sức bền mặt lý thuyết VĐV (Yang cs 2003; Roth cs, 2008; Druzhevskaya cs, 2008) - Tuy nhiên số mẫu nên kiểm định xác CÂU HỎI ÔN TẬP Câu Định nghĩa, ưu điểm ứng dụng kỹ thuật RFLP? Phương pháp khắc phục nhược điểm kỹ thuật này? Câu 2: Đa hình gen gì? Vì đoạn exon 16 ACTN3 sử dụng để nghiên cứu đa hình gene? Câu Các phương pháp nghiên cứu để xác định đa hình gene ACTN3 R577X? Câu Đặc điểm chức gen ACTN3? THAN KYOU SO MUCH [...]... III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 3 Kết quả và thảo luận Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 thông qua phản ứng PCR III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 3 Kết quả và thảo luận Tinh sạch sản phẩm PCR: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 3 Kết quả và thảo luận Phân tích RFLP -PCR vùng exon 16 của gene ACTN3: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH... ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực hiện Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực hiện Khuếch đại vùng exon 16 của gene ACTN3 R577X bằng kỹ thuật PCR: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene ACTN3 R577X: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH... Glycerol, 60mM EDTA) • 100 bp Ladder Plus(17µg/µl) • Agarose Metaphore • Các hóa chất khác… III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực hiện Thu tế bào niêm mạc Tách chiết DNA Khuếch đại gene ACTN3 với cặp mồi đặc hiệu Tinh sạch sản phẩm PCR Cắt bằng enzyme cắt giới hạn DdeI Điện di trên gel agarose Xác định đa hình gene III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy... PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực hiện Phương pháp PCR- RFLP Thành phần và điều kiện phản ứng cắt Enzyme giới hạn DdeI III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực hiện Sản phẩm PCR tinh sạch tiến hành điện di trên gel agarose với nồng độ khác nhau: 0. 8%, 1.5%, 2% Thời gian 30- 45 phút, hiệu điện thế 100 V III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 3 Kết quả... nghiên cứu III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 239 gene liên quan đến hoạt động thể chất, 7 gene nằm trên NST, 18 gene ty thể cũng liên quan đến hoạt động thể chất -Sự biểu hiện của protein αactinin-3 liên quan đến sợi cơ co nhanh loại II (Mills và cs, 200 1) Z-line giúp nâng đỡ, sắp xếp các sợi myosin (Yang và cs, 200 3) III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Năm 201 2 Ahmetov... phẩm PCR: Thêm 3 lần thể tích đệm BD vào, trộn đều Chuyển sang ống DNA spin column/ 2ml sạch Ủ 2 phút, li tâm 1 200 0rpm/1 phút,bỏ dịch Thêm 500 µl đệm rửa PE Li tâm 1 200 0rpm/1 phút,, bỏ dịch Li tâm tiếp cột lọc 1 200 0rpm/ 2 phút Chuyển cột vào ống li tâm 1,5 ml sạch Thêm 30- 50 µl đệm EB/ nước deion đã tiệt trùng Ủ 5 phút, li tâm 1 200 0 rpm/ 2 phút DNA đã tinh sạch III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA. .. X) XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GEN ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR- RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 1.Vật liệu nghiên cứu • Mẫu nghiên cứu: -Tế bào niêm mạc miệng của 54 VĐV điền kinh, 34 VĐV bơi lội - 40 sinh viên tình nguyện từ trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội làm mẫu đối chứng III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP. .. quả và thảo luận Kết quả giải trình tự ACTN3 R577X B9 K18 III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 3 Kết quả và thảo luận Phân bố tần số kiểu gene ACTN3 R577X và tần số alen R/X: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 3 Kết quả và thảo luận - Kiểu gene RR có liên quan mật thiết với sức nhanh mạnh của VĐV và kiểu gene XX (gây ra thiếu hụt αactinin-3, tạo ra nhiều sợi co chậm)... 10 giây Dùng tăm bông quẹt xoay tròn bên thành má trong Cho tăm bông có mẫu vào phong bì và ghi đầy đủ thông tin Bảo quản III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực hiện Quypháp trìnhlytách Phương tríchchiết DNA DNA từ mẫu tế bào niêm mạc miệng(quy trình tách chiết của bộ kit Buccal Swab DNA extraction kit của hãng GeneShun Biotech) III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA. .. PCR- RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Dụng cụ • ống nghiệm, eppendorf, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất,hộp đựng đá… Thiết bị • cân phân tích, cân kỹ thuật, lò vi sóng, máy PCR, nồi khử trùng, máy điện di, tủ lạnh sâu, tủ ấm, tủ sấy, bể ổn nhiệt, máy quang phổ Hóa chất • Đệm TAE 50X • Dung dịch nhuộm gel (0. 1µg/ml ethidium bromide) • Loading dye (0. 03% brommophenol blue, 100 mM Tris-HCl(pH 7.6), 60% ... III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 2.Quy trình thực Phương pháp PCR-RFLP Thành phần điều kiện phản ứng cắt Enzyme giới hạn DdeI III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN... hiệu điện 100V III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận Kết tách chiết DNA tổng số từ mẫu niêm mạc miệng: III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN Kết thảo luận... thứ 577 (R hay X) XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH KIỂU GEN ACTN3 R577X BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP CỦA MỘT SỐ VẬN ĐỘNG VIÊN ĐIỀN KINH VÀ BƠI LỘI Ở VIỆT NAM III ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN 1.Vật