TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu đƣợc tiến hành với mục đích phân lập chủng nấm mốc từ chao khoai môn, sở lựa chọn chủng nấm mốc có khả lên men chao khoai môn tốt Nội dung tiến hành bao gồm phân lập mô tả số đặc điểm hình thái chủng nấm mốc lên men chao khoai môn; xác định khả thủy phân tinh bột protein enzyme sinh từ chủng nấm mốc Đề tài đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp pha loãng mẫu, sau trải mẫu môi trƣờng PDA để phân lập nấm mốc Các chủng nấm mốc phân lập đƣợc nhuộm quan sát kính hiển vi để mô tả đặc điểm hình thái, cuối xác định khả thủy phân tinh bột protein enzyme sinh từ chủng nấm mốc cách tính hoạt tính enzyme amylase protesae sinh Kết nghiên cứu thu đƣợc nhƣ sau: từ chao khoai môn phân lập đƣợc chủng nấm mốc Mucor Aspergillus (Asp.) Khả thủy phân tinh bột protein chủng nấm mốc Mucor, Asp DC (Mucor hiemalis) đƣợc xác định dựa vào hoạt tính enzyme amylase protease theo thời gian cụ thể: Chủng Mucor cho hoạt tính enzyme cao sau thời gian ngày ủ với hoạt tính enzyme amylase thu đƣợc 4433,78 U/mL hoạt tính enzyme protease thu đƣợc 35,23 U/mL Chủng Asp cho hoạt tính enzyme cao sau thời gian ngày ủ với hoạt tính enzyme amylase thu đƣợc 1245,27 U/mL hoạt tính enzyme protease thu đƣợc 33,83 U/mL Chủng DC cho hoạt tính enzyme amylase cao sau thời gian ngày ủ với hoạt tính enzyme amylase thu đƣợc 1385,29 U/mL hoạt tính enzyme protease cao sau ngày ủ 22,16 U/mL Kết cho thấy chủng Mucor có khả lên men chao khoai môn tốt iv LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu công trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học công trình nghiên cứu chƣa đƣợc công bố công trình khác An Giang, ngày 25 tháng 08 năm 2015 Ngƣời thực Nguyễn Thị Hồng Lê Phạm Thị Kim Liên v MỤC LỤC Trang CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i LỜI CẢM TẠ .ii ASBTRACT iii TÓM TẮT iv LỜI CAM KẾT v MỤC LỤC vi DANH SÁCH BẢNG viii DANH SÁCH HÌNH ix CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CƢU 2.1 LƢỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc 2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc 2.1.1.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 2.1.2 Các chủng nấm mốc thƣờng gặp sản xuất chao 2.2 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU HOẶC GIẢ THUYẾT NGHIÊN CỨU CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU 3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập mô tả số đặc điểm hình thái chủng nấm mốc từ chao khoai môn (Colocasia esculenta) 3.2.2 Thí nghiệm 2: Xác định khả thủy phân tinh bột protein enzyme sinh từ chủng nấm mốc 3.2.2.1 Xác định khả thủy phân tinh bột enzyme amylase sinh từ chủng nấm mốc lên men chao khoai môn 11 vi 3.2.2.2 Xác định khả thủy phân protein enzyme protease sinh từ chủng nấm mốc lên men chao khoai môn 11 3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 12 3.3.1 Môi trƣờng 12 3.3.2 Hóa chất 12 3.3.3 Thiết bị dụng cụ 13 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .14 4.1 THÍ NGHIỆM 1: PHÂN LẬP VÀ MÔ TẢ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TỪ CHAO KHOAI MÔN (Colocasia esculenta) 14 4.2 THÍ NGHIỆM 2: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT VÀ PROTEIN CỦA ENZYME SINH RA TỪ CÁC CHỦNG NẤM MỐC ĐÃ PHÂN LẬP 19 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 23 5.1 KẾT LUẬN 24 5.2 KHUYẾN NGHỊ 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 PHỤ CHƢƠNG A 27 PHỤ CHƢƠNG B 31 vii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng Kết phân lập chủng nấm mốc chao khoai môn (Colocasia esculenta) 14 Bảng Màu khuẩn lạc chủng nấm mốc phân lập đƣợc theo thời gian 15 Bảng Hoạt tính enzyme amylase chủng nấm mốc DC, Mucor, Aspergillus với thời gian ủ khác 20 Bảng Hoạt tính enzyme protease chủng nấm mốc DC, Mucor, Aspergillus với thời gian ủ khác 22 Bảng Các nồng độ pha loãng tyrosine 31 viii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Actinomucor elegans .4 Hình M brunneogriseus Hình Rhizopus oryzae Hình Aspergillus sp Hình Các kiểu cuống bào tử đính Aspergillus Hình Quy trình phân lập nấm mốc Hình Cuống mang bọc bào tử với bọc bào tử chủng Mucor 16 Hình Khuẩn ty phân nhánh, dạng ống có vách ngăn chủng Mucor 16 Hình Cuống bào tử mọc từ hệ sợi chủng 16 Hình 10 Chủng nấm mốc sau ngày nuôi cấy 16 Hình 11 Chủng nấm mốc sau ngày nuôi cấy 18 Hình 12: Cuống mang thể bình có bào tử đính chủng .18 Hình 13: Thể bình hình chùy, hai tầng chủng 18 Hình 14: Khuẩn ty phân nhánh chủng .18 Hình 15: Hoạt tính enzyme amylase chủng nấm mốc DC (M hiemalis) 19 Hình 16 Hoạt tính enzyme protease chủng nấm mốc DC (M hiemalis) .21 ix CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống loại thực phẩm lên men phổ biến dân tộc giới Đó thực phẩm đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp thủ công, đƣợc truyền từ đời sang đời khác, mang sắc thái kinh nghiệm sắc riêng dân tộc (Nguyễn Đức Lƣợng, 2006) Theo thời gian sản phẩm lên men đƣợc mở rộng chủng loại phƣơng pháp chế biến nhƣng giữ đƣợc nét đặc trƣng văn hóa vùng, miền, quốc gia Hiện nay, sản phẩm lên men truyền thống không đƣợc sản xuất hoàn toàn theo phƣơng pháp thủ công mà đƣợc chuyển dần sang sản xuất công nghiệp Chao sản phẩm lên men truyền thống nhƣ Ở Việt Nam, chao đƣợc sản xuất theo quy mô công nghiệp nhƣng kỹ thuật chƣa đƣợc phát triển cao, với thiết bị đơn giản Chao sản phẩm lên men từ đậu nành, có từ lâu đời, mang tính truyền thống đa số nƣớc phƣơng Đông, đặc biệt Việt Nam Chao có giá trị dinh dƣỡng có hệ số tiêu hóa cao Trên thị trƣờng Việt Nam bán nhiều loại chao khác nhƣ chao nƣớc, chao bánh, chao đặc chao bột (Nguyễn Đức Lƣợng, 2006) Chao trở thành ăn, gia vị thiếu bữa ăn ngƣời Việt, đƣợc ví nhƣ phomai Việt Nam Cùng với phát triển xã hội, nhu cầu ẩm thực ngày tăng cao Con ngƣời không ngừng tìm kiếm nguồn nguyên liệu để đa dạng hóa sản phẩm Với xu đó, chao khoai môn xuất số tỉnh Việt Nam nhƣ Sóc Trăng, Tây Ninh, An Giang, Chao khoai môn mang hƣơng vị đặc trƣng vừa có vị ngon, béo ngậy vừa có hƣơng thơm khoai môn Chao khoai môn đƣợc sản xuất với quy mô nhỏ phƣơng pháp lên men truyền thống, chất lƣợng chao chƣa ổn định chƣa xác định đƣợc chủng nấm mốc yếu tố quan trọng để tối ƣu điều kiện lên men chao Quá trình lên men truyền thống làm chất lƣợng sản phẩm chao kiểm soát đƣợc không ổn định, xâm nhập vi sinh vật làm hƣ hỏng sản phẩm sinh độc tố, cuối làm thay đổi giá trị dinh dƣỡng hƣơng vị, không đem lại hiệu kinh tế cao Cần có nguồn giống nấm mốc ổn định cho trình lên men chao khoai môn đạt chất lƣợng tốt, tạo sản phẩm có chất lƣợng tốt ổn định, đƣa vào sản xuất công nghiệp, có sức cạnh tranh cao thị trƣờng nƣớc, phát triển ẩm thực Việt Nam lên tầm cao Hiện nay, tài liệu nghiên cứu chủng nấm mốc ứng dụng sản xuất chao khoai môn Trong đó, nguồn giống quan trọng, ảnh hƣởng trực tiếp đến chất lƣợng chao Với mong muốn tìm nguồn giống nấm mốc sản xuất chao khoai môn, ổn định chất lƣợng sản phẩm chao mang đến cho ngƣời tiêu dùng sản phẩm có chất lƣợng tốt nhất, đề tài “Phân lập chủng nấm mốc từ chao khoai môn (Colocasia esculenta)” đƣợc tiến hành nghiên cứu 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phân lập chủng nấm mốc từ chao khoai môn để nâng cao suất chất lƣợng sản xuất 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Các chủng nấm mốc đƣợc phân lập từ chao khoai môn 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập mô tả số đặc điểm hình thái chủng nấm mốc lên men chao khoai môn Xác định khả thủy phân tinh bột protein enzyme sinh từ chủng nấm mốc, từ chọn chủng nấm mốc thích hợp sản xuất chao khoai môn có suất chất lƣợng tốt 1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI Đóng góp mặt khoa học: Xác địch đƣợc chủng nấm mốc nâng cao suất chất lƣợng sản xuất chao khoai môn Đóng góp công tác đào tạo: Nghiên cứu nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho công tác giảng dạy CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 LƢỢC KHẢO VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tình hình nghiên cứu nƣớc 2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước Đỗ Ngọc Đệ, Phạm Thị Xuân Ngọc (2010) tiến hành nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzyme amylase Kết phân lập đƣợc 11 chủng nấm mốc M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11 có khả sinh enzyme amylase phân giải tinh bột Trong đó, sử dụng chủng M4 thu nhận đƣợc enzyme amylase bán tinh khiết theo phƣơng pháp nuôi cấy chìm có hoạt độ cao 4912,72 (đv/g) Nguyễn Văn Thành Trần Nguyễn Ngọc Quỳnh (2011) tiến hành nghiên cứu sản xuất starter Actinomucor elegans có mật số sức sống cao dùng để cải tiến chất lƣợng chao truyền thống Kết cho thấy mật số bào tử A elegans đạt cao (1010 bào tử/g chất khô) với nghiệm thức gồm chất cám gạo tỉ lệ 2:1, chủng 105 bào tử/gck thu hoạch sau ngày ủ 30 oC Nhiệt độ, thời gian sấy, thời gian xay tối ƣu cho số lƣợng bào tử sống lần lƣợt 42 oC, 48 phút Sau tháng bảo quản, mật số bào tử sống trì tối đa 88,57% nghiệm thức bảo quản oC (trong tủ lạnh) túi nhựa polypropylen, bào tử sống giảm 2,2% so với mẫu ban đầu (90,77%) Lê Minh Nguyệt, Phan Thị Phƣơng Thảo (2012) tiến hành xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động cho sản xuất chao từ nấm mốc Mucor elegans Thí nghiệm xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tạo thành bào tử sinh tổng hợp enzyme protease nấm mốc Mucor elegans nhằm xây dựng quy trình sản xuất giống khởi động từ loại nấm mốc phục vụ cho sản xuất chao (đậu phụ lên men) Cụ thể xác định đƣợc loại nguyên liệu thích hợp cho sản xuất giống khởi động từ nấm mốc Mucor elegans bột đậu tƣơng; tỷ lệ phối trộn với bột gạo 50/50 Dƣơng Thị Thanh Hoài (2012) tiến hành phân lập sản xuất bột bào tử Mucor sp ứng dụng sản xuất chao Kết quả: môi trƣờng thích hợp để sản xuất bột bào tử Mucor sp là: 78% bã đậu nành + 11% trấu + 8% cám gạo + 3% MgSO4 Tỉ lệ cấy bột bào tử thích hợp 1% Chất lƣợng chao tỉ lệ cấy 1% giữ đƣợc hƣơng vị nhƣ chao bẫy mốc tự nhiên mà rút ngắn đƣợc thời gian nuôi mốc Lê Nguyễn Đoan Duy, Huỳnh Thị Phƣơng Thảo Nguyễn Công Hà (2014) tiến hành nghiên cứu với mục đích khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme protease từ Aspergillus oryzae môi trƣờng bán rắn với chất cảm ứng gelatin nhƣ xác định thông số động học enzyme nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu, Vmax Km Kết cho thấy thành phần môi trƣờng bán rắn nuôi cấy thích hợp hỗn hợp 70% cám, 25% trấu, 5% gelatin với độ ẩm môi trƣờng 60%, nhiệt độ ủ 30oC, pH = thời gian 72 Enzyme thu hồi thể hoạt tính tối ƣu nhiệt độ 45oC pH = 5,5 Động học enzyme protease đƣợc xác định chất casein có Vmax = 1,2548 μmol/phút Km = 0,3932% Khả thủy phân enzyme protease dịch acid protein (da cá tra ngâm acid acetic 24 ) ứng với thời gian thuỷ phân 50 phút với thể tích dung dịch enzyme 1mL protein, pH dung dịch 3,2 nhiệt độ thuỷ phân 45oC Kết rằng, enzyme protease có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae đƣợc nuôi cấy môi trƣờng bán rắn có khả sử dụng tốt việc thủy phân dung dịch protein 2.1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước Bei Zhong Han, Frans M Rombouts M.J Robert Nout (2000) tiến hành nghiên cứu lựa chọn phƣơng pháp chế biến chao nhƣ chao lên men từ nấm mốc, chao lên men tự nhiên, chao lên men từ vi khuẩn Kết nghiên cứu tìm loại nấm mốc làm giống sản xuất chao bao gồm Mucor spp., Actinomucor spp., Rhizopus spp Song song đó, thành phần hóa học có chao đƣợc thảo luận với số liệu thống kê hàm lƣợng acid amin chất dinh dƣỡng, nhƣ thành phần dễ bay hƣơng vị loại chao đạt tiêu chuẩn sản phẩm Bei Zhong Han, Yong Ma, Frans M Rombouts MJ Robert Nout (2003) nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ độ ẩm tƣơng đối đến tăng trƣởng sản xuất enzyme Actinomucor elegans Rhizopus oligosporus lên men chao Kết quả: sau 48 25 °C độ ẩm 95 - 97%, A elegans tạo protease (108 U/g), lipase (172 U/g) glutaminase (176 U/g), cho α-amylase (279 U/g) αgalactosidase (227 U/g) 30 °C, độ ẩm 95 - 97% sau 48 ủ R oligosporus đƣợc ghi nhận sau 48 35 °C độ ẩm 95 - 97% tạo α-amylase (288 U/g pehtze) glutaminase (187 U/g), α-galactosidase (226 U/g Có thể kết luận R oligosporus thay tiềm cho A elegans trình sản xuất chao nhiệt độ cao 2.1.2 Các chủng nấm mốc thƣờng gặp sản xuất chao  Chi Actinomucor Hệ thống phân loại Giới: Fungi Lớp: Zygomycota Bộ: Mucorales Họ: Mucoraceae Chi: Actinomucor (Nguồn: C R Benj., & Hesselt, 1957) Hình 1: Actinomucor elegans Đặc điểm Actinomucor có sợi nấm đơn bào, vách ngăn, suốt (Nguồn: internet (1) ) Khuẩn lạc Actinomucor phát triển nhanh thành mảng nhƣ Ban đầu khuẩn lạc có màu trắng sau có màu xanh ô liu đến vàng sẫm Phân tích dƣới kính hiển vi, ta thấy phân nhánh cuống bào tử Trên cuống bào tử ban đầu, cách túi bào tử đoạn ngắn, mọc cuống bào tử thứ hai Bọc bào tử hình cầu, cuống bọc bào tử tập trung thành nhóm thân bò có rễ giả, cuống bọc bào tử phân nhánh với bọc bào tử lớn đầu cùng, nhánh bên xếp thành vành nhƣ vành cánh hoa, bọc bào tử bên bé bào tử (Nguyễn Đức Lƣợng, 2006)  Chi Mucor PHỤ CHƢƠNG A PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MẬT SỐ NẤM MỐC BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐO ĐỘ ĐỤC (TRẦN LINH THƢỚC, 2012) Pha loãng huyền phù chứa nấm mốc thành huyền phù khác có độ đục đo OD610nm đạt giá trị lân cận 0, 1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 Đo OD610nm huyền phù vừa đƣợc pha Ghi nhân số đo thực tế Dùng phƣơng pháp đếm trực tiếp dƣới kính hiển vi, xác định mật độ tế bào (N/mL) huyền phù Tính giá trị log (N/mL) cho giá trị mật độ N/mL tƣơng ứng với độ đục Vẽ đƣờng biểu diễn log (N/mL) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành) Xác định khoảng tuyến tính log (N/mL) OD610nm Đo độ đục huyền phù tế bào cần xác định mật độ Từ trị số OD610nm đo đƣợc, dựa vào đƣờng tƣơng quan log (N/mL) độ đục OD610nm, suy trị số log (N/mL) trị số mật độ N/mL (N/mL = 10a với a = log (N/mL)) 27 QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT VÀ PROTEIN Chủng Mucor hiemalis Khoai môn xử Ủ ( – ngày, 25oC) Hòa tan khoai môn với H2O cất Lọc Enzyme thô Xác định hoạt tính enzyme protease Xác định hoạt tính enzyme amylase 40 µL Cystein 0,02 M 1,8 mL tinh bột 1% 140 µL đệm 0,2 mL enzyme thô 20 µL enzyme thô Ủ ( 50 oC, 10 phút) Lọc Cho vào 600 µL Casein 1% Ủ lắc 10 phút, 37 oC, 550 rmp Pha loãng nồng độ thích hợp Cho vào 600 µL TCA 15% Để yên 10 Thêm 3mL DNS Đun sôi phút Đo độ hấp thụ ánh sáng 540 nm phút Ly tâm 10000 rmp, 10 phút, o C Bỏ cặn Đo độ hấp thụ ánh sáng 275 nm Dựng đƣờng chuẩn glucose Dựng đƣờng chuẩn tyrosine Xác định hoạt tính amylase Tính hoạt tính protease 28 PHƢƠNG PHÁP ĐO HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE Sử dụng tinh bột 1% (pha tinh bột với dung dịch đệm Sodium phosphate 0,05 M, pH = 6,5), hút 1,8 mL tinh bột 1% 0,2 mL enzyme thô, ủ 50 oC 10 phút Lọc lấy dịch tiến hành đo lƣợng đƣờng khử Lấy phần dịch lọc pha loãng với hệ số pha loãng thích hợp (pha loãng 100 lần) Thêm vào ống nghiệm mL thuốc thử DNS Đun sôi phút (có đậy nút) Làm lạnh đến nhiệt độ phòng Đo mật độ quang bƣớc sóng 540 nm với mẫu trắng Vẽ đƣờng chuẩn glucose với trục tung mật độ quang (OD540nm), trục hoành nồng độ glucose Tìm phƣơng trình biểu diễn đƣờng chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540nm; X = [glucose] (mg/mL) hệ số tƣơng quan R2 nhờ phần mềm Excel Từ phƣơng trình đồ thị đƣờng cong chuẩn tính đƣợc X mg/mL đƣờng khử dung dịch đƣờng pha loãng Nhân với hệ số pha loãng để đƣợc lƣợng đƣờng mL dung dịch gốc Chọn hệ số pha loãng cho OD nằm giới hạn đƣờng chuẩn Tính hàm lƣợng đƣờng nguyên liệu (mg/g): X n V/m V: thể tích dịch đƣờng gốc (mL) m: khối lƣợng mẫu cân (g) Từ kết hàm lƣợng đƣờng tính đƣợc, xác định đơn vị hoạt tính enzyme mL enzyme theo công thức: Trong : U: hoạt tính enzyme (UI/mL) X: hàm lƣợng glucose dung dịch đo (mg/mL) Vhh: thể tích hỗn hợp T: thời gian phản ứng VE: thể tích enzyme PHƢƠNG PHÁP ĐO HOẠT TÍNH ENYME PROTEASE Pha loãng enzyme thô lọc dung dịch đệm sodium phosphate 0.05 M, pH = 6,5 tỷ lệ 10x, 20x, 50x, 100x Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine: chuẩn bị dung dịch tyrosine có nồng độ từ 0,1, 0,125; 0,2; 0,25; 0,5; µM/mL cách pha loãng dung dịch tyrosine chuẩn µM/mL với dung dịch đệm phosphat Tìm phƣơng trình biểu diễn đƣờng chuẩn tyrosine dạng y = ax + b với y = OD275nm; X = [tyrosine] (mg/mL) hệ số tƣơng quan R2 nhờ phần mềm Excel 29 Bảng 5: Các nồng độ pha loãng tyrosine Ống Nồng độ tyrosine (µM/mL) 0,1 Thể tích Tyrosine (1mM) 200 Thể tích đệm (µL) Tổng thể tích dd (µL) 0,125 0,2 0,25 0,5 300 400 500 1000 2000 2000 1800 1700 1600 1500 1000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 Xác định hoạt tính enzyme + Hút 40 µL cysteine 0,02 M, 140 µL đệm, 20 µL enzyme (ống đối chứng cho enzyme bất hoạt) vào ống eppendorf mL Cho vào tiếp 600 µL casein 1% Ủ máy lắc 10 phút, 37 oC, 550 rpm + Sau đó, cho tiếp 600 µL TCA 15% để ngừng phản ứng thủy phân protein, để yên 10 phút, đem ly tâm 10000 rmp 10 phút, oC Lọc Hút phần dịch qua ống eppendorf 1,5 mL Đem đo độ hấp thụ ánh sáng bƣớc sống 275 nm Tính kết Đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc tính theo công thức: TU = ) K Trong đó: x: nồng độ tyrosine (µM/mL), đƣợc xác định dựa dòng đƣờng chuẩn Tyrosine Vhh: thể tích tổng dung dịch phản ứng ( 1400 µL) T: Thời gian phản ứng ( 10 phút) VE: thể tích enzyme sử dụng ( 20 µL) K: hệ số pha loãng 30 PHỤ CHƢƠNG B KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TRONG LÊN MEN CHAO KHOAI MÔN Source Sum Squares of Df Mean Square F-Ratio P-Value MAIN EFFECTS A:Thoigian 1,59785E7 3,99463E6 10,08 0,0000 B:giong 3,32956E6 1,66478E6 4,20 0,0246 AB 1,64958E7 2,06198E6 5,20 0,0004 RESIDUAL 1,18863E7 30 396210,00 TOTAL (CORRECTED) 4,76902E7 44 INTERACTIONS 1.1 Kết xác định hoạt tính enzyme amylase chủng nấm mốc lên men chao khoai môn  Chủng Mucor ANOVA Table Source Sum Squares of Df Mean Square Between groups 3,11678E7 7,79195E6 6,79 Within groups 1,14727E7 10 1,14727E6 Total (Corr.) 14 4,26405E7 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ngày 686,55 X Ngày 770,40 X F-Ratio 31 P-Value 0,0066 Ngày 864,23 X Ngày 3 1049,90 X Ngày 4433,78 X  Chủng Asp ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 368425, of Df Mean Square 92106,20 Within groups 185544, 10 18554,40 Total (Corr.) 14 553969, F-Ratio P-Value 4,96 0,0182 F-Ratio P-Value Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ngày 844,27 X Ngày 862,24 X Ngày 990,01 XX Ngày 3 1143,73 XX Ngày 1245,55 X  Chủng DC ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 938111,00 of Df Mean Square 234528,00 10,28 Within groups 228063,00 10 22806,30 Total (Corr.) 14 1,16617E6 32 0,0014 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ngày 646,63 X Ngày 812,33 XX Ngày 3 890,19 XX Ngày 1043,91 X Ngày 1385,30 X 1.2 Kết xác định hoạt tính enzyme amylase theo thời gian chủng nấm mốc lên men chao khoai môn  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares of Df Mean Square Between groups 120117,00 60058,70 Within groups 169068,00 28178,00 Total (Corr.) 289185,00 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneo us Groups Mucor 770,40 X Asp 844,27 X DC 1043,91 X  Ngày ANOVA Table 33 F-Ratio P-Value 2,13 0,1998 Source Sum Squares of Df Mean Square Between groups 1,94777E7 9,73883E6 5,12 Within groups 1,14229E7 1,90381E6 Total (Corr.) 3,09005E7 F-Ratio P-Value 0,0505 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Asp 1245,55 X Dc 1385,30 X Mucor 4433,78 X  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 98594,90 of Df Mean Square 49297,50 Within groups 171005,00 28500,80 Total (Corr.) 269600,00 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Dc Count Mean Homogeneous Groups X Mucor 890,19 1049,90 X 34 F-Ratio P-Value 1,73 0,2552 Asp 1143,73 X  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares of Df Mean Square Between groups 50082,90 25041,40 Within groups 41059,40 6843,24 Total (Corr.) 91142,30 F-Ratio P-Value 3,66 0,0914 F-Ratio P-Value 2,88 0,1329 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 812,33 X Mucor 864,23 XX Asp 990,01 X Dc  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 78946,2 39473,1 Within groups 82286,2 13714,4 Total (Corr.) 161232, of Df Mean Square Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous 35 Groups Dc 646,63 X Mucor 686,55 X Asp 862,24 X KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TRONG LÊN MEN CHAO KHOAI MÔN Analysis of Variance for hoat tinh - Type III Sums of Squares Source Sum Squares of Df Mean Square FRatio P-Value MAIN EFFECTS A:thoi gian 2626,36 656,589 48,09 0,0000 B:giong 650,54 325,27 23,82 0,0000 AB 972,66 121,58 8,90 0,0000 RESIDUAL 409,64 30 13,65 TOTAL (CORRECTED) 4659,2 44 INTERACTIONS 2.1 Kết xác định hoạt tính enzyme protease chủng nấm mốc lên men chao khoai môn  Chủng Mucor ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 1404,21 of Df Mean Square 351,05 Within groups 177,70 10 17,77 Total (Corr.) 14 1581,92 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD 36 F-Ratio P-Value 19,75 0,0001 Count Mean Homogeneous Groups Ngày 6,76 X Ngày 11,66 XX Ngày 3 16,80 XX Ngày 19,83 X Ngày 35,23 X  Chủng Asp ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 1546,90 of Df Mean Square 386,72 Within groups 169,86 10 16,98 Total (Corr.) 14 1716,76 F-Ratio P-Value 22,77 0,0001 F-Ratio P-Value Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ngày 5,83 X Ngày 8,17 X Ngày 3 13,07 X Ngày 21,00 X Ngày 33,83 X  Chủng DC ANOVA Table Source Sum of Df Mean 37 Squares Between groups Square 647,91 161,97 Within groups 62,07 10 6,20 Total (Corr.) 14 709,98 26,10 0,0000 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ngày 4,43 X Ngày 5,37 X Ngày 3 6,07 X Ngày 8,40 X Ngày 22,17 X 2.2 Kết xác định hoạt tính enzyme amylase theo thời gian chủng nấm mốc lên men chao khoai môn  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 8,17 of Df Mean Square 4,08 Within groups 209,39 34,89 Total (Corr.) 217,56 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Mucor 19,83 Homogeneous Groups X 38 F-Ratio P-Value 0,12 0,8916 Asp 21,00 X Dc 22,17 X  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 1368,84 of Df Mean Square 684,42 Within groups 97,67 16,27 Total (Corr.) 1466,52 F-Ratio P-Value 42,04 0,0003 F-Ratio P-Value 15,73 0,0041 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Dc 8,40 X Asp 33,83 X Mucor 35,23 X  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 178,14 of Df Mean Square 89,07 Within groups 33,97 5,66 Total (Corr.) 212,12 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD 39 Count Mean Homogeneous Groups Dc 6,07 X Asp 13,07 X Mucor 16,80 X  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares of Df Mean Square Between groups 59,78 29,89 Within groups 58,80 9,80 Total (Corr.) 118,58 F-Ratio P-Value 3,05 0,1219 F-Ratio P-Value 2,53 0,1594 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Dc 5,36 X Asp 8,16 XX Mucor 11,6 X  Ngày ANOVA Table Source Sum Squares Between groups 8,27556 of Df Mean Square 4,14 Within groups 9,8 1,63 Total (Corr.) 18,0756 40 Multiple Range Tests Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Dc 4,43 X Asp 5,83 X Mucor 6,77 X 41 [...]... nghiệm 1: Phân lập và mô tả một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc từ chao khoai môn (Colocasia esculenta) Mục đích: Phân lập đƣợc các chủng nấm mốc từ chao khoai môn (Colocasia esculenta) từ đó tiến hành mô tả một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc đã phân lập Bố trí thí nghiệm: thực hiện thí nghiệm với 1 nhân tố, 3 lần lặp lại Nguyên tắc: Lấy 10 g mẫu pha loãng mẫu ở các nồng độ... protease của các chủng nấm mốc phân lập đƣợc Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính enzyme amylase và protease của các chủng nấm mốc phân lập đƣợc Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ muối (NaCl) đến lên men chao khoai môn từ chủng Mucor Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ rƣợu (C2H5OH) đến lên men chao khoai môn từ chủng Mucor Phân tích chỉ tiêu vi sinh vật trong chao khoai môn len men từ chủng Mucor... 18 Từ những đặc điểm hình thái đã mô tả, căn cứ theo khóa phân loại của Nguyễn Đức Lƣợng (2006) có thể kết luận chủng nấm mốc 1 thuộc chi Aspergillus (Asp.) 4.2 THÍ NGHIỆM 2: XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG THỦY PHÂN TINH BỘT VÀ PROTEIN CỦA ENZYME SINH RA TỪ CÁC CHỦNG NẤM MỐC ĐÃ PHÂN LẬP  Kết quả xác định hoạt tính enzyme amylase của các chủng nấm mốc Nấm mốc sau khi đạt mật số 107 CFU/mL sẽ đƣợc cấy vào khoai môn. .. nắp và các dụng cụ thủy tinh thông thƣờng khác Bếp điện Nồi hấp thanh trùng Máy ly tâm 3.4 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU Xử lý số liệu, đồ thị bằng phần mềm excel Tiến hành thống kê số liệu bằng phần mềm statgraphic 13 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 THÍ NGHIỆM 1: PHÂN LẬP VÀ MÔ TẢ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TỪ CHAO KHOAI MÔN (Colocasia esculenta) Bảng 1: Kết quả phân lập các chủng nấm mốc. .. năng thủy phân tinh bột và protein của enzyme sinh ra từ các chủng nấm mốc 9  Quy trình đề nghị xác định khả năng thủy phân tinh bột và protein của các chủng nấm mốc 200 mL môi trƣờng PDA lỏng Thanh trùng (121 0C, 15 phút) Làm nguội 30 – 40 0C Thêm 1 mL dịch nấm mốc Nuôi trên máy lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ phòng Đo mật số nấm mốc sau 1, 2, 3, 4, 5 ngày Nấm mốc đạt mật số 107 CFU/mL Khoai môn Xử lí... Cuống mang bọc bào tử với 1 bọc bào tử của chủng 1 Hình 9: Cuống bào tử mọc từ hệ sợi của chủng 1 Hình 8: Khuẩn ty phân nhánh, dạng ống có vách ngăn của chủng 1 Hình 10: Chủng nấm mốc 1 sau 3 ngày nuôi cấy Từ những đặc điểm hình thái đã mô tả, căn cứ theo khóa phân loại của Nguyễn Đức Lƣợng (2006) có thể kết luận chủng nấm mốc 1 thuộc chi Mucor 16 Chủng nấm mốc 2 Một số đặc điểm hình thái đƣợc miêu... của các chủng nấm mốc Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 3 lần lặp lại Thực hiện với mẫu đối chứng sử dụng Mucor hiemalis Số đơn vị thí nghiệm: n = (t + DC)*3 Với t là số chủng nấm mốc phân lập đƣợc Cách tiến hành: Khoai môn đƣợc làm sạch và cắt nhỏ, sau đó tiệt trùng và làm nguội đến 30 – 40 oC Khi nấm mốc đã đạt mật số 107 CFU/mL, tiến hành cấy mốc vào khoai. .. dõi từng ngày sự phát triển của hệ sợi , các hạch nấm Thí nghiệm đƣợc thực hiện theo sơ đồ sau: Đồng nhất và pha loãng mẫu thành các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 Trải 0,1 mL mẫu lên đĩa PDA , ủ ngửa đĩa 25 oC, 3 ngày Phân lập nấm mốc Nhuộm mẫu Quan sát dƣới kính hiển vi Mô tả một số đặc điểm hình thái các chủng nấm mốc Hình 6: Quy trình phân lập và mô tả đặc điểm hình thái nấm mốc. .. LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ những kết quả thu đƣợc sau quá trình tiến hành thí nghiệm, kết luận đƣợc đƣa ra nhƣ sau: từ chao khoai môn phân lập đƣợc 2 chủng nấm mốc Mucor và Aspergillus Khả năng thủy phân tinh bột và protein của 3 chủng nấm mốc Mucor, Aspergillus và DC (M hiemalis) đƣợc xác định dựa vào hoạt tính enzyme amylase và protease theo thời gian cụ thể: Chủng Mucor cho hoạt tính enzyme... phân lập đƣợc Cách tiến hành: Khoai môn đƣợc làm sạch và cắt nhỏ, sau đó tiệt trùng và làm nguội đến 30 – 40 oC Khi nấm mốc đã đạt mật số 107 CFU/mL, tiến hành cấy mốc vào khoai môn đã xử lí (1 mL nấm mốc cấy vào 10 g khoai môn) và ủ theo thời gian đã bố trí Hòa tan khoai môn sau khi ủ với nƣớc cất (tỉ lệ 1 : 4), thu lấy dịch lọc enzyme thô và đo hoạt tính enzyme protease Chỉ tiêu theo dõi: Các mẫu thí ... Thí nghiệm 1: Phân lập mô tả số đặc điểm hình thái chủng nấm mốc từ chao khoai môn (Colocasia esculenta) Mục đích: Phân lập đƣợc chủng nấm mốc từ chao khoai môn (Colocasia esculenta) từ tiến hành... CỨU Phân lập chủng nấm mốc từ chao khoai môn để nâng cao suất chất lƣợng sản xuất 1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Các chủng nấm mốc đƣợc phân lập từ chao khoai môn 1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập mô... MÔ TẢ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC TỪ CHAO KHOAI MÔN (Colocasia esculenta) Bảng 1: Kết phân lập chủng nấm mốc chao khoai môn (Colocasia esculenta) Kết Mẫu 10-1 10-2 10-3 10-4