ÔN TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ PHIÊN MÃ o0o 1.Tái tổ hợp tương đồng -Xảy với điều kiện: hai vùng DNA TTH phải có trình tự tương đồng hai trình tự phải có điểm đứt mạch - RecB RecC : tháo xoắn cắt đứt mạch  phức hợp RecBC nhận biết trình tự gọi trình tự chi ( x)  cắt cách vài base - RecA : gắn lên mạch DNA đứt  nhận biết trình tự tương đồng mạch  hình thành phân tử lai - Tạo hai phân DNA tái tổ hợp hai phân tử DNA dị hợp vùng gene trao đổi - Ý nghĩa: • Tăng số lượng gene lặp lại • Điều hòa biểu gene • Loại bỏ gene hỏng trường hợp gene lặp lại • Có thể gây biến đổi có hại So sánh phiên mã pro euk - Phiên mã dịch mã Euk diễn tế bào chất - Ở pro phiên mã chép diễn gần đồng thời ( thiếu màng nhân) -mRNA pro polycistronic mRNA: chứa thông tin nhiều gene, chứa nhiều ORFs (khung đọc mở), mã hóa cho nhiều chuỗi polypeptide + chiều dài mRNA ngắn đoạn DNA mà PM - mRNA Euk monocistronic: mRNA chứa thông tin gene, chứa ORF, mRNA mã hóa cho chuỗi polypeptide Chiều dài mRNA gần băng đoạn DNA mà phiên mã 3.Promoter - Chiều promoter định chiều mạch khuôn - Có thành phần : hai trình tự tương ứng vị trí -35 (TTGACA) -10 (TATAAT) ( cách khoảng 15- 17 bp có trình tự định)  giúp dể tách mạch RNA pol bám chặt hơn,và điểm khởi đầu phiên mã - Không mã hóa - Nằm trước vùng gene mã hóa - Trình tự “consensus” promoter E.coli: trình tự xác lập dựa so sánh nhiều trình tự tương đồng promter khác E.coli RNA pol tiểu phần - RNA pol mà phức hợp enzyme nên gọi holoenzyme, gồm: enzyme lõi (core) nhân tố sigma • Core enzyme : tồn suốt trình PM, đảm bảo cho phản ứng kéo dài chuỗi RNA, gồm tiểu đơn vị: anpha, beta,beta’, omege The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN + Anpha : có vai trò gắn kết tiểu đơn vị + liên kết số nhân tố hoạt hóa, nhận biết promoter + β, β’ : trung tâm xúc tác RNA pol, β liên kết với DNA khuôn, RNA tổng hợp ribonucleotide • Sigma factor: đảm bảo tính đặc hiệu promoter: giảm lực RNA pol trình tự DNA bất kỳ, tăng lực RNA pol promoter Quá trinh phiên mã a Giai đoạn khởi đầu - RNA pol nhân biết gắn vào promoter nhờ sigma factor - RNA pol nhận biết gắn cách lỏng lẻo vào trình tự -35  tạo phức hợp đóng - RNA pol gắn với DNA chặc để mở xoắn vùng trình tự -10, tạo thành phức hợp, DNA tháo xoắn sợi đơn phơi dạng tự do làm khuôn cho phiên mã (chỉ mạch làm khuôn) b.Giai đoạn kéo dài - Khi phân tử RNA đạt chiều dài khoảng 8nu  sigma factor tách khỏi RNA pol thay nhân tố kéo dài - RNA pol tháo xoắn liên tục DNA, vùng DNA tháo xoắn gọi trancription bubble dịch chuyển DNA với RNA pol c Giai đoạn kết thúc • Kết thúc phiên mã phụ thuộc nhân tố rho (cần lượng) - Rho: protein gồm tiểu đơn vị, có domain (vùng) - Rho nhận diện vùng RNA gọi “ rut” (gồm 50-90bp nằm phía trước trình tự kết thúc, Giàu C G) - Rho thủy phân ATP để dịch chuyển RNA với tốc độ cao RNA pol  Rho phân tách liên kết RNA-DNA nhờ hoạt tính helicase  kết thúc phiên mã • Kết thúc PM không phụ thuộc sigma factor - Dấu hiệu kết thúc phiên mã cấu trúc đặc biêt Dna sợi khuôn, gồm: + Hai trình tự đối xứng bổ sung giàu GC, phiên mã tạo thành cấu trúc kẹp tóc cấu trúc ổn định ngăn không cho RNA pol tiếp tục tổng hợp + Tiếp theo cấu trúc loạt Adenin, phiên mã tạo thành Urcil  làm giảm lực RNA với DNA mạch gốc  RNA tách khỏi phức hợp phiên mã 7.RNA Pol Euk - RNA pol I: PM rRNA (28S, 18S, 5,8S) - RNA pol II: PM mRNA - RNA pol III: PM tRNA, rRNA 5S RNA nhỏ (snRNA) Vùng kiểm soát phiên mã gene eukaryote - Hộp TATA: 5’- TATAAA- 3’ - Hộp CAAT: 5’- GGCCAATCT - Hộp GC: GGGCGG (thường có nhiều sao) 9.Quá trình biến đổi tiền mRNA - Gắn mũ chụp đầu 5’ - Gắn đuôi poly A đầu 3’ - Cắt, nối, loại intron a 5’- Capping (gắn mũ chụp) - Capping G bị methyl hóa - Là bước đầu tiên, start phiên mã, G có gắn thêm Methyl N7 (7- methyl guanin)  gắn vào đầu 5’ mRNA nhờ liên kết phosphate The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN - Capping yếu tố cần thiết cho phiên mã sau b Gắn đuôi poly A - Ngay sau phiên mã, mRNA bị cắt bỏ khoản 20nu nằm trước trình tự 5’AUAAA-5’  trình tự nhận biết cho phản ứng cắt - Enzyme polyA pol gắn lượng A định vào đầu 3’ mRNA - Tất mRNA Euk có khả gắn đuôi polyA, ngoại trừ mRNA histone - Một protein đặc hiêu ( polyA binding protein): gắn vào đuôi polyA ổn định hình thành tiền mRNA c Quá trình ghép nối splicing) - Quá trình loại bỏ intron nối exon với - Có trình tự nằm intron có vai trò quan trọng: • Trình tự cho GU đầu 5’ intron • Trình tự rẽ nhánh giàu pyrimidine bao quanh A gần đầu 3’ • Trình tự AG đầu 3’ - Quá trình ghét nhờ tham gia spliceosome, phức snRNA và số protein chuyên biệt nhân (snRNP) 10 Tổng hợp tRNA - Tổng hợp tiền tRNA (gồm nhiều tRNA) Enzyme ribonuclease tách thành loại tRNA riêng - Các gene mã hóa tRNA euk trình tự intron ngắn - Ở euk trình tự CCA is addeds MÃ DI TRUYỀN VÀ DỊCH MÃ o0o Quá trình biểu gene - DNA VLDT sống - Quá trình chuyển thông tin từ DNA  protein, gọi biểu gene - Bao gồm bước: Transcription Translation The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN Mã di truyền − Codon: thông tin di truyền mã hóa ba base không chồng lắp − Tính suy thoái: nhiều ba quy định acid amin − Tính vạn năng: tất sinh vật có chung mã di truyền − Ngoại lệ tính vạn năng: ty thể • UGA mã hóa tryptophan • Các ba khởi đầu: AUG, AUA, AUU, AUC AUG mã hóa cho methyonine chuỗi polypeptide • AGA, AGG ty thể ba kết thúc quy định arginin Ở động vật nguyên sinh: UAA UAG mã hóa cho acid glutamic codon kết thúc Các công trình giả mã di truyền - Thuyết Wobble: Sự bắt cặp khập khiển của vị trí 3’ codon (có tính linh động) 5’ anticodon  anticodon đọc codon khác Khái niệm khung đọc mở (ORF) - ORF gồm: codon start codon stop cách khoảng 300codon (prokaryote) hay 400-500 codon ( euk) - Có thể có ba khung đọc cho bắt kỳ trình tự RNA phụ thuộc vào base chọn làm base bắt đầu - Thực tế khung đọc use, hai khung đọc chứa số codon stop nên ngăn cản chúng use - Ví dụ: Khung đọc 5’ - AUG ACU AAG AGA UCC GG - 3’ Met Thr Lys Arg Ser Khung đọc 5’ - A UGA CUA AGA GAU CCG G - 3' Stop Khung đọc 5’ - AU GAC UAA GAG AUC CGG - 3’ Stop The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN Cấu trúc tRNA - Hầu hết phân tử tRNA prokaryote euk có cấu trúc giống - Dây đơn gấp khúc tạo thành vòng (loop), cho phân tử có cấu trúc bậc thành thân • Thân (stem) nhánh (arm): vùng chứa base nối với nhau, tương ứng theo mã di truyền • Ở loop bắt cặp base - tRNA phiên mã không dịch mã, sau bị cắt đầu tạo tRNA có cấu hình chùy, cuộn lại tạo cấu hình, biến đổi base thường thành bất thường - Chức chung gian tRNA thực nhờ enzyme đặc hiệu AminoacyltRNA synthetase (20 loại ứng với 20 amino acid) RNA ribosome − Chếm 80% tổng số RNA tế bào − Các RNA kết hợp với protein chuyên biệt tạo thành ribosome − Một Ribosome gồm tiểu đơn vị nhỏ tiểu đơn vị lớn, tiểu đơn gồm nhiều protein rRNA có size khác − Tiểu đơn vị nhỏ có vị trí gắn với phân tử mRNA − Tiểu đơn vị lớn có ba vị trí gắn cho phân tử tRNA, vị trí P (peptide), vị trí A (amino acid), vị trí E (Exit site) Trong suốt trình tổng hợp protein hai tiểu phần gắn với Ribosome − Là thành phần nằm tế bào chất tham gia dịch mã, tổng hợp chuỗi polypeptide − Ở Pro 70S ribosome = 30S + 50S − Ở Euk 80S ribosome= 40S + 60S − Vị trí P giữ tRNA mang chuỗi polypeptide hình thành, tRNA sau dó giải phóng nhờ vị trí E − Sự phân tách Ribosome: • Các ribosome E.coli phân tách tiểu phần bước cuối trình dịch mã • IF1 xúc tác hoạt hóa cho trình tách • IF3 gắn vào tiểu phân 30S tự ngăn tái liên kết với tiểu phần 50S  hình thành ribosome hoàn chỉnh Hoạt hóa amino acid − Enzyme: Aminoacyl-tRNA synthetase (gắn amino acid với tRNA chuyên biệt − Bước 1: amino acid ATP gắn vào enzyme  a.a hoạt hóa − Bước 2: tRNA liên kết (giàu lượng) với phức hợp enzyme-aminoacid − Bước 3: tRNA nôi với amino acid liên kết giàu lượng (tRNA gắn a.a vào đầu 3’ Quá trình khởi đầu dịch mã Tóm tắc: − Bước 1: IF1 tác động làm tách ribosome 70S thành 50S 30S − Bước 2: gắn IF3 vào 30S, ngăn tái hình thành ribosome hoàn chỉnh − Bước 3: IF1, IF2, GTP gắn vào dọc bên IF3 − Bước 4: IF2 mang tRNA gắn vào phức hợp mRNA-30SrRN − Bước 5: thay đổi cấu hình tiểu phần nhỏ, IF1 IF3 tách − Bước 6: toàn phức hợp liên kết với tiểu phần 50S ribosome hình thành ribosome hoàn chỉnh − IF2 tách thủy phân GTP *Note: prokaryote có nhân tố IF Euk có nhân tố khởi động eIF The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN a.Phức hợp 30S khởi đầu dịch mã -Khi ribosome tách tiểu phần 30S 50S phức hợp 30S hình thành, gồm: mRNA, GTP, yếu tố IF1, IF2, IF3 fMet-tRNA b gắn mRNA vào tiểu phần 30S - Phức hợp 30S khởi đầu dịch mã hình thành từ tiểu phần ribosome 30S + mRNA +fMettRNA - Việc gắn tiểu phần ribosome 30S prokaryote vào vị trí khởi đầu dịch mã mRNa phụ thuộc vào bắt cặp bổ sung giữa: c Một trình tự ngắn Shine-Dalgarno (5’-AGGAGGU-3’) mRNA nằm upstream codon start -Giúp mRNA liên kết chặc chẽ xác với rRNA bước khởi đầu dịch mã - Trình tự bổ sung đầu cuối 3’ 16S RNA - Ở vi khuẩn tiểu đơn vị nhỏ gắn với mRNA trình tự Shine-Dalgarno thượng nguồn codon khởi đầu d Gắn fMet-tRNA vào 30S Initiation Complex - IF2 nhân tố xúc tác cho việc gắn fMet-tRNA vào 30S initiation complex - GTP cần thiết cho việc gắn IF2, không bị thủy phân bước e Phức hợp 70S khởi đầu dịch mã − GTP thủy phân sau 50S gắn vào phức hợp 30S  70S  khởi đầu dịch mã − Mục đích thủy phân GTP tách IF2 GTP khỏi complex giúp cho trình kéo dài polypeptide bắt đầu 10 Kéo dài dịch mã - Bước 1: nhận diện codon: anticodon aminoacyl tRNA đến bắt cặp bổ sung với codon mRNA vị trí A Sự phân hủy GTP làm tăng độ xác hiệu bước - Bước 2: hình thành liên kết peptide: phân tử rRNA tiểu phần lớn xúc tác hình thành cầu nối peptide amino acid vị trí A đầu cuối carboxyl chuỗi polypeptide hình thành The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN vị trí P site Bước chuyển chuỗi polypeptide sang tRNA vị trí A  nhờ Hoạt tính peptide transferase - Bước 3: Ribosome chuyển vị trí tRNA vị trí A sang vị trí P, tRNA vị trí P chuyển sang vị trí E giải phóng *Hoạt tính peptidyl transferase ribosome : xúc tác tạo liên kết peptide amino acid 11 Kết thúc dịch mã - Bước cuối dịch mã ribosome tới codon stop trêm mRNA - RF (release factor- nhân tố giải phóng) gắn vào vị trí A (vị trí codon stop)  thủy phân tRNA cuối khỏi chuỗi polypeptide  kết thúc dịch mã -RRF (nhân tố giải phóng ribosome): gắn vị trí RF  gắn vào A  phức hợp PM tách 12 Polyribosome - Nhiều ribosome tham gia dịch mã phân tử mRNA lúc hình thành nên polyribosome 13 Sai sót dịch mã - RNA pol bắt nhầm nucleotide phiên mã - Ribosome đọc lệch khung -tRNA-aa không phù hợp : tần số sai lớn 10-3 - Aminoacyl-tRNA-synthetase : bắt nhầm amino acid - Aminoacyl-tRNA-synthetase bắt nhầm tRNA 14 Sửa sai bước gắn tRNA-amino acid - Enzyme AMP : phân cắt a.a không phù hợp 15 Sửa sai dịch mã ĐIỀU HÒA BIỂU HIỆN CỦA GENE 1.Ý nghĩa - Prokaryote: +Điều chỉnh enzyme cho phù hợp với nhân tố môi trường, có tính linh động tính thuận nghịch + Điều hòa chủ yếu diễn giai đoạn phiên mã - Euk: + Biệt hóa loại tế bào, tính thuận nghịch, khả quay lại trạng thái ban đầu + Điều hòa trải qua nhiều giai đoạn phức tạp hợp - Các kiểu điều hòa Prokaryote: • Operon Lac • Operon Tryptophane • Operon arabinose • Điều hòa sigma factor • Điều hòa “làm giảm” The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN Điều hòa âm dương - Kiểm soát dương tính: activator gắn vào vùng điều hòa  transcription start ( phổ biến euk) + Kiểm soát dương (cảm ứng): phức hợp activator-inducer gắn lên vùng điều hòa  transcription + Kiểm soát dương (ức chế): phức hợp activator-repressor gắn lên vùng điều hòa no transcription - Kiểm soát âm: + Repressor ( chất ức chế): gắn lên vùng điều hòa  no transcription + Inducer (chất cảm ứng) làm bất hoạt repressor không thể gắn lên vùng điều hòa transcription Cấu trúc operon lac - Có phần: promoter, operator, gene cấu trúc Thêm vào gene điều hòa hoạt động gene cấu trúc  Promoter: nhận diện RNA pol, nơi bắt đầu phiên mã  Operator: kiểm soát việc gắn RNA pol vào promotor, thông thường nằm promotor promotor gene cần phiên mã (không mã hóa cho protein)  Gene cấu trúc: mã hóa chuỗi polypeptide - Là tập hợp gene có đường chuyển hóa chung đặt điều hòa of trình tự điều hòa chung 4.Hoạt động operon lac - Môi trường lactose  repressor gắn vào operator  no transcription - Môi trường có lactose (được gọi nhân tố cám ứng- inductor)  inductor gắn vào repressor  repressor bị bất hoạt  Transcription  Tiết kiệm lượng, glucose tế bào sử dụng lactose (trường hợp điều hòa theo đường dị hóa) - Kiểm soát dương Operon Lac: Glucose nguồn đường chủ yếu tế bào  Hàm lượng cAMP nội bào có tương quan tỉ lệ nghịch với hàm lượng glucose cAMP hoạt hóa CAP ( CAP repressor cho gene tổng hợp nó) The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN  Enzyme adenylate cyclase ức chế tổng hợp cAMP  Như vậy: low glucose  phức hợp cAMP-CAP gắn vào DNA upstream Lac promoter (trình tự kế với promoter)  uốn cong vùng DNA xung quanh  Transcription  CAP-cAMP tăng gắp RNA pol vào promoter  tăng phiên mã 50 lần - Ảnh hưởng Glucose lactose tới phiên mã: 5.Trp operon (operon đồng hóa) - Trp operon: chứa gene cấu trúc (5gene) cần thiết cho trình sinh tổng hợp tryptophan - Trp operon hoạt hóa trình phiên mã diện tryptophan - Hệ thống ức chế điều hòa chế kiểm soát ngược âm - Trp operon đóng tryp gắn vào làm bất hoạt aporepressor - Phức hợp tryptophan-repressor: gắn vào operator ngăn phiên mã mức tryptophan cao - Nếu tryptophan giảm, phức hợp trp-repressor tách khỏi operator - Tryp gọi corepressor, hoạt động với protein repressor để lock phiên mã, operon trp operon ức chế  chế kiểm soát âm tính represspr ngăn chặn phiên mã 6.Điều hòa giảm bớt (attenuation) cấu trúc ngừng phiên mã The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN - Trình tự trp attenuator: chứa trình tự base bổ sung đầu 5’ mRNA bắt cặp bổ sung tạo thành cấu trúc kẹp tóc  kết thúc phiên mã đầu 5’ mRNA - Nếu tRNA-trp diện, trình tổng hợp peptide leader dẫn tới bắt cặp bổ sung mRNA tạo thành cấu trúc cản hoạt động RNA pol - Một số operon điều hòa theo chế operon trp: Trp, PheA, His,Leu, Thr, Ileu Các yếu tố sigma E.coli - Sử dụng sigma factor khác chế điều hòa nhanh chóng tiết kiệm lượng prokaryote - Ở 50oC, sigma 32 gắn chuyên biệt với promoter shock nhiệt tổng hợp 17 protein - Ở nhiệt độ thấp sigma32 bị phân hủy protease màng (FtsH) 8.Phage SP01 xâm nhiễm bacillus subtilis SP01 phage xâm nhiễm vào bacillus sub có bước biểu gene: gene sớm, trung gian gene muộn biểu thời điểm khác - Giai đoạn sớm: enzyme vi khuẩn nhận biết promoter phage  sigma28 factor of phage thay sigma factor vi khuẩn - Giai đoạn trung gian: phức hợp enzyme-gp28 phiên mã gene trung gian phage Các gene trung gian 33, 34 (gene có nhân tố 33,34) mã hóa cho nhân tố sigma khác thay cho gp28 - Giai đoạn muộn: phức hợp enzyme-gp33/gp34 phiên mã gene muộn phage The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN 10 Operon Arabinose (operon dị hóa) - The secret to happiness is low expectations TH LIVERPUDLIAN 11 ... thành phức hợp, DNA tháo xoắn sợi đơn phơi dạng tự do làm khuôn cho phiên mã (chỉ mạch làm khuôn) b.Giai đoạn kéo dài - Khi phân tử RNA đạt chiều dài khoảng 8nu  sigma factor tách khỏi RNA pol... expectations TH LIVERPUDLIAN Cấu trúc tRNA - Hầu hết phân tử tRNA prokaryote euk có cấu trúc giống - Dây đơn gấp khúc tạo thành vòng (loop), cho phân tử có cấu trúc bậc thành thân • Thân (stem) nhánh... nhiều protein rRNA có size khác − Tiểu đơn vị nhỏ có vị trí gắn với phân tử mRNA − Tiểu đơn vị lớn có ba vị trí gắn cho phân tử tRNA, vị trí P (peptide), vị trí A (amino acid), vị trí E (Exit