ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR VÀ REALTIME RT-PCR TRONG XÁC ðịNH KIỂU GENE CỦA VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI B VÀ C Hồ Thị Thanh Thủy , Nguyễn Bảo Toàn , Cao Minh Nga , Vũ Thị Tường Vân 34 Công ty cổ phần TM – SX & DV Việt Á, Trung tâm chẩn ñoán Y khoa Medic, TP HCM, Khoa Y, ðại học Y dược TP HCM, Khoa Vi sinh, Bệnh viện Bạch Mai MỞ ðẦU Viêm gan siêu vi B (HBV) C (HCV) bệnh nhiễm ñáng lo ngại số lượng người bị nhiễm bệnh, kiểu biến chứng gây nguy hiểm ñến sức khỏe người xơ gan, ung thư gan Dựa vào mức ñộ tương ñồng trình tự nucleotide, người ta xếp HCV vào kiểu gene (genotype) khác (66-69% tương ñồng) Hiện nay, có genotype HCV ñược phân biệt phân bố genotype ñược 1,2 ghi nhận phụ thuộc vào ñịa dư Các nghiên cứu mối tương quan genotype HCV với ñáp ứng thuốc ñiều trị ñã ñược công bố ðối với HBV, kiểu gene ñã ñược xác ñịnh (kí hiệu từ A ñến H) dựa vào 4,5 khác 8% toàn bộ gene HBV, phân bố kiểu gene phụ thuộc vào 5,6 ñịa dư Mối tương quan genotype ñáp ứng với kiểu thuốc ñiều trị ñã ñược công bố 7,8,9,10 năm gần ñây Mặc dù thị trường ñã có nhiều kít ñược sản xuất nước dựa kĩ thuật sinh học phân tử phục vụ cho việc xác ñịnh kiểu gene HBV HCV Mỗi kít có ưu nhược ñiểm riêng, nhìn chung chi phí bệnh nhân phải trả cho việc xác ñịnh ñồng kiểu gene cao Nghiên cứu ñược ñặt nhằm xây dựng hai quy trình kĩ thuật realtime PCR realtime RT-PCR ñể xác ñịnh ñồng thời ba kiểu gene phổ biến (A, B C) HBV bốn kiểu gene phổ biến (1, 2, 6) virus HCV lưu hành người Việt nam, với mục ñích cuối ñưa ñến quy trình xác ñịnh kiểu gene virus HBV virus HCV ñơn giản, hiệu chi phí thấp Chúng chọn trình tự mục tiêu cho phản ứng realtime PCR realtime RT-PCR vùng gene S gene HBV vùng 5’NC gene HCV ðối với hai quy trình, ñiểm chung cặp mồi sử dụng cho phép nhân kiểu gene ñã xác ñịnh virus (mồi consensus) TaqMan probe ñặc hiệu cho kiểu gene (A, B C ñối với HBV 1, 2, ñối với HCV) ñược thiết kế bên ñoạn trình tự nằm hai mồi Các loại chất ñánh dấu huỳnh quang khác ñược sử dụng nhằm phân biệt dễ dàng kiểu gene NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu bệnh phẩm 100 mẫu bệnh phẩm huyết thanh, ñó 50 mẫu nhiễm HBV 50 mẫu nhiễm HCV bệnh viện ðại học Y dược TP HCM, Trung tâm chẩn ñoán Y khoa Medic phòng xét nghiệm Y khoa Âu Lạc cung cấp Mồi, mẫu dò Hai hệ mồi, mẫu dò (ñược tóm tắt bảng 2) sử dụng nghiên cứu ñược thiết kế, dựa vào trình tự gene S gene HBV vùng 5’NC gene HCV ñược công bố ngân hàng gene ñược tổng hợp công ty IDT (USA) Bảng Mồi mẫu dò gene S HBV Tên Chức Trình tự Chiều dài (bp) Kích thước sản phẩm PCR (bp) PrimerHBV-F Mồi xuôi 5’-CTGGTGGC TC AGT TCA GGA AC-3’ 22 91 PrimerHBV-R Mồi ngược ProbeA Mẫu dò ProbeB Mẫu dò ProbeC Mẫu dò 5’-GGCGCAGGGTCCCCAAT- 3’ 5’-FAM ACATCTCGTCAATCTCCGCGAG– BHQ1-3’ 5’-HEX TCCATATCGTCAATCTTATCGAAGA– BHQ1-3’ 5’-Cy5 CCCATATCGTCAATCTTCTCGAG– BHQ2-3’ 17 22 25 23 Bảng Mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV Tên Chức Trình tự Chiều dài (bp) Kích thước sản phẩm PCR (bp) PrimerF Mồi xuôi 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 99 PrimerR Mồi ngược 5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’ 17 Probe1 Mẫu dò 5’-FAM –TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG-BHQ1-3’ 22 Probe2 Mẫu dò 5’-Cy5-AAG GAC CCA GTC TTC CCG GCA ATT C-BHQ2-3’ 25 Probe3 Mẫu dò 5’-ROX-ACC CGG TCA CCC CAG CGA TTC C- BHQ2-3’ 23 Probe Mẫu dò 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCAT-BHQ1-3’ 26 Tách chiết acid nucleic RNA DNA từ mẫu huyết bệnh nhân ñược ly trích phương pháp sử dụng phenol/chloroform, theo phương pháp Chomczynski & Sacchi (1987): 200 µl huyết ñược thêm vào 900 µl Trizol, pH4 (ñối với tách RNA) pH8 (ñối với tách DNA) Acid nucleic sau ñó ñược tủa Isopropanol với chất trợ tủa GlycoBlue Acid nucleic thu ñược sau tủa ñược giữ dung dịch TE 1X (Tris-EDTA) (ñối với DNA) o H2O cất ñã qua xử lý DEPC (ñối với RNA) bảo quản -20 C cho ñến sử dụng Realtime PCR Realtime-RT-PCR Phản ứng ñược thực máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương trình nhiệt bao gồm 95 C- 5’ (1 0 0 chu kỳ) 40 chu kỳ lặp lại với 95 C- 15’’, 60 C- 1’ cho Realtime PCR 25 C- 5’ (1 chu kỳ), 42 C- 30’ (1 chu 0 0 kỳ), 85 C- 5’ (1 chu kỳ) 95 C- 5’ (1 chu kỳ) 40 chu kỳ lặp lại với 95 C- 15’’, 60 C- 1’ cho Realtime RT-PCR Thể tích hỗn hợp phản ứng PCR realtime 50 µl bao gồm: 1× dung dịch ñệm PCR, 100 nmol/L mồi mẫu dò, 400 µmol/L loại dATP, dGTP, dCTP dTTP, 1.5 units hot-start Taq DNA polymerase, mmol/L MgCl2 Thể tích hỗn hợp phản ứng RT 20µl bao gồm: 1× dung dịch ñệm RT, 20 units Rnase Inhibitor, 0,2 µg Random hexamer, 200 units M-MuLV Reverse Transcriptase 100 ng - µg total RNA kiểu gien HBV ñược xác ñịnh phản ứng chứa ñầy ñủ mồi mẫu dò ñặc hiệu cho kiểu gien A, B C tương tự kiểu gien HCV ñược xác ñịnh phản ứng chứa ñầy ñủ mồi mẫu dò ñặc hiệu cho kiểu gien 1, 2, Giải trình tự Sản phẩm PCR RT-PCR ñặc trưng cho genotype HBV HCV sau ñó gửi ñến công ty Macrogen, Hàn quốc ñể tinh giải trình tự KẾT QUẢ & THẢO LUẬN ðộ ñặc hiệu mồi mẫu dò ðối với hệ mồi mẫu dò gene S HBV: thiết kế thí nghiệm sử dụng DNA chứng dương HBV genotype A ñược ñưa vào hỗn hợp cho phản ứng realtime PCR chứa probe ñặc trưng cho HBV genotype A, B C Việc bố trí thí nghiệm ñược tiến hành tương tự cho genotype lại Kết có hỗn hợp chứa mẫu dò ProbeA ñặc trương cho HBV genotype A cho tín hiệu dương tính Kết tương tự cho genotype lại (hình 1a) HBV genotype C HBV genotype A HBV genotype B Chứng âm Hình 1a Kết khảo sát khả khuếch ñại mồi mẫu dò gene S HBV ðối với hệ mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV: thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA chứng dương HCV genotype ñược ñưa vào hỗn hợp cho phản ứng realtime RT-PCR chứa probe ñặc trưng cho HCV genotype 1, 2, Việc bố trí thí nghiệm ñược tiến hành tương tự cho genotype lại Kết có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe1 ñặc trưng cho HCV genotype cho tín hiệu dương tính Kết tương tự cho genotype lại (hình 1b) HCV genotype HCV genotype HCV genotype HCV genotype Chứng âm Hình 1b Kết khảo sát khả khuếch ñại mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV Các hình a b ñều cho thấy phản ứng có kiểu genotype tương ứng với mẫu dò ñặc trưng tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu nền, mẫu chứng âm (ñược thiết kế với thành phần tương tự cho phản ứng realtime-PCR realtime RT-PCR, thay acid nucleic nước) có tín hiệu huỳnh quang thấp tín hiệu Như hệ mồi mẫu dò ñều hoạt ñộng hiệu ñặc hiệu cho genotype HBV HCV ðộ nhạy phản ứng Các hình 2a, b c cho thấy, dạng ñồ thị biểu thị cho kiểu genotype tương ứng với mồi mẫu dò ñặc trưng, tín hiệu huỳnh quang vượt tín hiệu nền, từ mẫu có nồng ñộ amplicon 10 copy/ml với chu kỳ ngưỡng (Ct) giảm dần ñến mẫu có nồng ñộ 10 copy/ml Các mẫu chứng âm (ñược thiết kế với thành phần tương tự cho phản ứng realtime-PCR realtime RT-PCR, thay acid nucleic nước) có tín hiệu huỳnh quang thấp tín hiệu 107 copy/ml 106 copy/ml 105 copy/ml 10 copy/ml 103 copyml GHI CHÚ: : HBV genotype A : HBV genotype B : HBV genotype C 102 copy/ml 101 copy/ml Chứng âm Hình 2a Kết khảo sát ñộ nhạy mồi mẫu dò gene S HBV 107 copy/ml 106 copy/ml GHI CHÚ: 105 copy/ml : HCV genotype 104 copy/ml 103 copy/ml : HCV genotype 102 copy/ml 101 copy/ml Chứng âm Hình 2b Kết khảo sát ñộ nhạy mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV, genotype 107 copy/ml 106 copy/ml 10 copy/ml 104 copy/ml GHI CHÚ: : HCV genotype : HCV genotype 103 copy/ml 102 copy/ml 101 copy/ml Chứng âm Hình 2c Kết khảo sát ñộ nhạy mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV, genotype Kết Realtime PCR Realtime RT-PCR bệnh phẩm Quy trình ñược thử nghiệm 50 mẫu bệnh phẩm nhiễm HBV HCV Kết cho thấy có 39 mẫu (78%) ñược xác ñịnh nhiễm HBV genotype B, 11 mẫu (22%) ñược xác ñịnh nhiễm HBV genotype C ðối với trường hợp nhiễm HCV, kết realtime RT-PCR ghi nhận 28 trường hợp (56%) nhiễm HCV genotype 1, trường hợp (14%) nhiễm HCV genotype 2, 15 trường hợp (30%) nhiễm HCV genotype Bước ñầu, kết ñã ñược kiểm chứng lại giải trình tự sản phẩm PCR kết hai phương pháp cho thấy hoàn toàn trùng khớp genotyping Tóm lại, phương pháp mà vừa xây dựng hoàn toàn phù hợp việc xác ñịnh kiểu gene virus HBV HCV nhiễm phổ biến Việt nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Simmonds P, Holmes EC, Cha TA, Chan SW, McOmish F, Irvine B, et al Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region J Gen Virol 1993a;74:2391–9 Simmonds P, McOmish F, Yap PL, Chan SW, Lin CK, Dusheiko G, et al Sequence variability in the 5_ non-coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity J Gen Virol 1993b;74:661–8 Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, et al Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial Lancet 2001;358:958–65 Norder H, Courouce AM, Magnius LO Complete genome, phylogenetic relatedness and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes Virology 1994;198:489-503 Okamoto H, Tsuda F, Sakagawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, et al Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence comparison of surface antigen subtypes J Gen Virol 1988;69:2575-83 Norder H, Hammas B, Lee SD, Bele C, Courouce AM, Mushawar IK, et al Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variation in the primary structure of the surface gene J Gen Virol 1993; 74:1341-8 Thakur V, Guptan RC, Kazim SN, Malhotra V, Sarin SK Profile, spectrum and significance of HBV genotype in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent J Gastroenterol Hepatol 2002;17:165-70 Erhardt A, Reineke V, Blondin D, Gerlich WH, Adam O, Heintges T, et al Mutation of the core promoter and response to interferon in chronic replicative hepatitis B Hepatology 2000;31:716-25 Kao JH, WuNH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS Hepatitis B genotype and the response to interferon therapy J Hepatol 2000;33:998-1002 10 Thakur V, Sarin SK, Rehman S, Guptan RC, Kazim SN, Kumar S Role of HBV genotype in predicting response to lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B Indian J Gastroenterol 2005;24:12-1 Tác giả chịu trách nhiệm chính: Hồ Thị Thanh Thủy: Công ty cổ phần TM – SX & DV Việt Á, email: htthuy80@yahoo.com, mobile: 0903217541 SUMMARY APPLICATION OF REALTIME PCR AND REALTIME RT-PCR IN GENOTYPING OF HBV AND HCV Ho Thi Thanh Thuy , Nguyen Bao Toan , Cao Minh Nga , Vu Thi Tuong Van Viet A Trading – Production & Service Corp, Medic medical center of HoChiMinh city, Faculty of Medicine, Medicinal University of HoChiMinh city, Faculty of Microbiology, Bach Mai Hospital Background: There is the need for rapid and inexpensive methods for genotyping hepatitis B (HBV) and C viruses (HCV) to support clinical practice Objectives: To develop two realtime-PCR and realtime RT-PCR for HBV and HCV genotyping in a single tube Study design: Three type-specific probes, genotypes A–C and four type-specific probes, genotypes 1, 2, and 6, were designed around genotype-specific motifs in the S gene of HBV and 5’non-coding (NC) region of HCV, respectively The PCR based assays were compared with sequencing and were applied on a further 100 clinical samples Results: The performances of these assays were assessed by analyzing serial dilutions of acid nucleic of known concentrations and the lower limit of detection were found to be 10 acid nucleic copies/ml Then, 50 samples infected HBV were analysed by realtime PCR: 39 cases (78%) were genotype B, 11 cases (22%) genotype C For 50 samples infected HCV, 28 samples (56%) were HCV genotype 1, samples (14%) genotype 2, 15 samples (30%) genotype Concordant results were obtained with the sequencing for all cases tested Conclusions: The PCR-based assays were sensitive, specific, fast, accurate and convenient methods for routine HBV and HCV genotyping  ... Probe1 Mẫu dò 5’-FAM –TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG-BHQ1-3’ 22 Probe2 Mẫu dò 5’-Cy5-AAG GAC CCA GTC TTC CCG GCA ATT C- BHQ2-3’ 25 Probe3 Mẫu dò 5’-ROX-ACC CGG TCA CCC CAG CGA TTC C- BHQ2-3’ 23 Probe.. .B ng Mồi mẫu dò vùng 5’NC HCV Tên Ch c Trình tự Chiều dài (bp) Kích thư c sản phẩm PCR (bp) PrimerF Mồi xuôi 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 99 PrimerR Mồi ngư c 5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’... 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCAT-BHQ1-3’ 26 Tách chiết acid nucleic RNA DNA từ mẫu huyết b nh nhân ñư c ly trích phương pháp sử dụng phenol/chloroform, theo phương pháp Chomczynski & Sacchi (1987):