Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU 1 1. Lí do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về cây chè 3 1.1.1 Phân loại 3 1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3 1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây chè 3 1.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè 3 1.1.5 Thành phần hóa sinh trong cây chè 3 1.1.6 Giá trị của cây chè 3 1.2 Thư viện cDNAEST 3 1.2.1 Giới thiệu về cDNAEST 3 1.2.2 Phương pháp tạo ra thư viện cDNAEST 3 1.3 Tình hình nghiên cứu gen và genome ở chè 3 1.3.1 Genome chè 3 1.3.2 Các nhóm gen chức năng ở chè 3 1.3.3 Thư viện cDNAEST ở chè 3 CHƯƠNG II. VẬt LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4 2.1 Vật liệu 4 2.1.1 Nguyên liệu 4 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 4 2.2 Phương pháp nghiên cứu 4 CHƯƠNG III. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 5 3.1 Dự kiến kết quả 5 3.2 Tiến độ thực hiện 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 6
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả NGUYỄN THỊ HẠNH 0949.141.000 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến - Giảng viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới cán công tác Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho trình làm đề tài Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – giảng viên trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên giúp đỡ thời gian thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nhóm nghiên cứu di truyền cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả NGUYỄN THỊ HẠNH DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ bp Cặp base Diethylpyrocarbonate DEPC Complementary DNA cDNA DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate đtg Đồng tác giả DTT EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid SSR Simple Sequence Repeat (đoạn lặp lại trình tự đơn giản) TAE Tris acetat EDTA MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Cây chè loài công nghiệp dài ngày, có nguồn gốc từ vùng khí hậu Nhiệt đới Á nhiệt đới Chè có nhiều vitamin có giá trị dinh dưỡng bảo vệ sức khoẻ, có tác dụng giải khát, bổ dưỡng kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hoá chất mỡ, giảm bệnh béo phì, chống lão hoá … Do nước chè trở thành thứ nước uống nhân loại Ngày nay, hầu hết dân cư giới dùng nước chè làm nước uống hàng ngày Một số nước uống chè thành tập quán tạo văn hoá nguyên sơ “văn hoá trà” Ngoài để uống người ta dùng nước chè xanh để rửa vết thương chỗ lở loét, nhiễm trùng thể Vì chè có tên danh mục giải khát mà có tên từ điển y học, dược học Người Nhật Bản khẳng định chè cứu người khỏi bị nhiễm xạ gọi thứ nước uống thời đại nguyên tử Ở vùng Tây Nam Trung Quốc thời cổ đại dùng chè làm vật trao đổi ngang giá thứ thuốc tiên Ngoài ra, chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn (Đỗ Ngọc Quý, Đỗ Thị Ngọc Oanh, 2008) Chè có giá trị sử dụng hàng hoá có giá trị kinh tế cao, sản phẩm xuất có giá trị thị trường giới.Thị trường nước giới đòi hỏi chè ngày nhiều với yêu cầu chất lượng ngày cao Tuy vậy, hiểu biết trình sinh học bên chè hạn chế Kích thước genome chè lớn (khoảng Gb) (Shi et al., 20110) nên việc giải mã toàn genome đòi hỏi thời gian nhiều năm chi phí ước tính hàng chục triệu đô la Ngày nay, để làm sáng tỏ trình sinh học chè, nhà khoa học bắt đầu tập trung nghiên cứu chè mức độ phân tử Để làm sáng tỏ vai trò ứng dụng chè cần phải nghiên cứu gen genome nhằm cung cấp thông tin di truyền cấu trúc chức gen quan trọng quy định nên sản phẩm chè Phương pháp phân lập phân tích đoạn trình tự gene biểu (Expressed Sequence Tag, EST/cDNA) phương pháp sinh học phân tử đại nhằm tập trung nghiên cứu gen chức Để tạo tiền đề cho nghiên cứu cấu trúc genome nghiên cứu biểu gen chức chè, tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm đoạn cDNA/EST từ chè địa Thái Nguyên” Mục tiêu đề tài Tạo dòng xác định đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST từ chè địa Thái Nguyên phục vụ cho nghiên cứu sinh học phân tử Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề tài tiến hành nội dung nghiên cứu sau: Nghiên cứu tạo dòng tái tổ hợp mang đoạn cDNA/EST ngẫu nhiên tổng hợp từ mRNA chè địa Thái Nguyên Xác định phân tích đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST tạo dòng từ chè địa Thái Nguyên CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 Giới thiệu chung chè Phân loại Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O Kumtze và thuộc hệ thống phân loại sau : Giới thực vật – Plantae Ngành Ngọc Lan (Angiospermae) Lớp Ngọc lan ( Dicotyledonea) Bộ chè (Theales) Họ chè (Theaceae) Chi chè (Camellia Thea) Loài (Camellia sinensis) Họ chè có 29 chi khoảng 550 loài phân bố chủ yếu nước nhiệt đới cận nhiệt hai bán cầu, đặc biệt Đông Đông Nam Á Ở Việt Nam có khoảng 11 chi với 200 loài Dựa vào đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hóa, nguồn gốc phát sinh chè Cohen Stuart chia Camellia Sinensis làm bốn loại: a) Chè Trung Quốc nhỏ (Camellia sinensis var Bohea) Đặc điểm: - Cây bụi thấp phân cành nhiều - Lá nhỏ, dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, dài 3,5 - 6,5 cm - Có - đôi gân không rõ, cưa nhỏ, không - Búp nhỏ, hoa nhiều, suất thấp, phẩm chất bình thường 0 - Khả chịu rét độ nhiệt -12 C đến -15 C Phân bố chủ yếu miền đông, đông nam Trung Quốc, Nhật Bản số vùng khác b) Chè Trung Quốc to (Camellia sinensis var macrophylla) Đặc điểm: - Thân gỗ nhỡ cao tới 5m điều kiện sinh trưởng tự nhiên - Lá to trung bình chiều dài 12 - 15 cm, chiều rộng - cm, màu xanh nhạt, bóng, cưa sâu không đều, đầu nhọn - Có trung bình - đôi, gân rõ - Năng suất cao, phẩm chất tốt Nguyên sản Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc) c) Chè Shan (Camellia sinensis var Shan) Đặc điểm: - Thân gỗ, cao từ đến 10 m - Lá to dài 15 - 18 cm màu xanh nhạt, đầu dài, cưa nhỏ dày - Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng mịn trông tuyết, nên gọi chè tuyết - Có khoảng 10 đôi gân - Có khả thích ứng điều kiện ấm ẩm, địa hình cao, suất cao, phẩm chất thuộc loại tốt Nguyên sản Vân Nam - Trung Quốc, miền Bắc Miến Điện Việt Nam d) Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var assamica) Đặc điểm: - Thân gỗ cao tới 17 m phân cành thưa - Lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh đậm, dạng hình bầu dục, phiến gợn sóng, đầu dài - Có trung bình 12 - 15 đôi gân - Rất hoa - Không chịu rét hạn - Năng suất, phẩm chất tốt Trồng nhiều Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) số vùng khác 1.1.2 Nguồn gốc phân bố a) Nguồn gốc Nguồn gốc chè vấn đề phức tạp, có nhiều quan điểm khác nguồn gốc chè, dựa sơ lịch sử, khảo cổ học thực vật học Một số quan điểm nhiều nhà khoa học công nhận là: + Cây chè có nguồn gốc Vân Nam Trung Quốc: Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước cho nguồn gốc chè Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt ấm Theo tài liệu Trung Quốc cách 4000 năm người Trung Quốc biết dùng chè làm dược liệu sau để uống Năm 1753, Carl Van Linnacus, nhà thực vật học lần đầu tiên thế giới đã xác định Trung Quốc là vùng nguyên sản của chè và định tên khoa học của chè là Thea sinensis, phân thành loại: Thea bohea và Thea viridis Theo Daraselia Gruzia (1989) nhà khoa học Trung Quốc như: Schenpen, Jaiding, …đã giải thích chè mẹ Trung Quốc sau: Tỉnh Vân Nam nơi bắt đầu hàng loạt sông lớn đổ sông Việt Nam, Lào, Campuchia, Mianma Đầu tiên chè mọc Vân Nam, sau hạt chè di chuyển theo dòng nước đến nước nói sau lan dần nơi khác, dọc theo cao nguyên Tây Tạng + Cây chè có nguồn gốc vùng Atxam (Ấn Độ): Năm 1823, R.Bruce phát chè dại to vùng Atxam (Ấn Độ), từ học giả người anh cho rằng: Nguyên sản chè vùng Atxam Vân Nam – Trung Quốc + Cây chè có nguồn gốc Việt Nam: Những công trình nghiên cứu Đjemukhatze (1961 – 1976) phức catechin chè từ nguồn gốc khác nhau, so sánh thành phần chất catechin loại chè trồng trọt chè mọc hoang dại nêu lên luận điểm tiến hóa sinh hóa chè, sở xác minh nguồn gốc chè Đjemukhatze kết luận chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu (-) – epicatechin galat, chúng có khả tổng hợp (-) epigalocatechin galat để tạo (+) galocatechin chậm Nghiên cứu chè dại Việt Nam cho thấy chủ yếu tổng hợp (-) – epicatechin (-) – epicatechin galat (chiếm 70% tổng loại catechin) Khi di thực chè dại lên phía Bắc với điều kiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng thích hợp dần với điều kiện sinh thái cách có thành phần catechin phức tạp hơn, với tạo thành (-) epigalocatechin galat Điều có nghĩa trao đổi chất hướng phía tăng cường trình hidroxil hóa galil hóa Từ biến đổi hóa sinh chè dại chè trồng trọt, chăm sóc cho phép tới kết luận “ Nguồn gốc chè Việt Nam” Từ đó có sơ đồ tiến hóa chè thế giới sau đây: Camellia → Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to → Chè Trung Quốc → Chè Assam (Ấn Độ ) Tuy có khác quan điểm nêu có thống rằng: CHƯƠNG II VẬt LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu - Mẫu chọn chè trung du đầu dòng tím tuyển chọn luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Lương chuyên ngành khoa học trồng mã số 60.62.01.10 chè trung du xanh tuyển chọn khóa luận tốt nghiệp Luân Thị Bích Thùy chuyên ngành khoa học trồng với tiêu: Chỉ tiêu theo dõi Cây đầu dòng xanh Tân Cương (TC-1-255) Màu sắc Xanh đậm Dạng Thuôn dài Răng cưa Thưa, nông Phiến Ghồ ghề Đường kính gốc (cm) 2,5 Chiều cao (m) 0,62 Độ cao phân cành (cm) Số cành (cành) Độ rộng tán (m) 0,62 Chiều dài (cm) 6,5 Chiều rộng (cm) 3,5 Diện tích (cm) 15,92 Chiều dài búp (cm) Khối lượng búp (g/búp) 0,3 Mức độ lông tuyết Ít tuyết Thời gian sinh 265 trưởng/năm (ngày) Số lứa hái/năm (lứa) Năng suất (g/cây/lứa) 66,6 Hàm lượng cafein (%) Hàm lượng Tanin (%) Hàm lượng chất tan (%) Hàm lượng axid amin (%) Cây đầu dòng tím Tân cương (TC-6-257) Phớt tím Bầu dục Sâu, không Ghồ ghề 4,2 0,88 16 1,15 8,0 4,0 22,4 6,5 0,6 Ít tuyết 275 132,16 2,79 36,63 44,15 19,78 2.1.2 Hóa chất, thiết bị a) Hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu nhập từ hãng Fermentas, Clontech, Watson-Japan … - Hóa chất tách chiết RNA tổng số: Genejet plant RNA purification kit (Fermentas), DTT, PVP, Ethanol - Tinh mRNA: GeneJet RNA cleanup and Concentration Micro kit (Fermentas), Ethanol Tổng hợp cDNA: “In-Fusion®SMARTer® Directinal cDNA library construction kit” (Clontech) - Các hóa chất dùng tinh sản phẩm PCR (Fermentas) - Hóa chất chạy điện di DNA: + Agarose; + Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X; + Dung dịch đệm tra mẫu: Glycerol 20%; Tris-Cl 0,1M (pH 8,0); EDTA 0,01 M; (pH 8,0); Bromophenol blue 0,25%; + Thang DNA chuẩn (Fermentas); + Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) - CloneJet PCR cloning kit (Thermo) dùng để gắn sản phẩm tạo dòng vào vector pSMART2IFD - Môi trường nuôi cấy E coli + Môi trường LB lỏng: Hỗn hợp Lucia Bertani bao gồm Bacto Tryptone 10 g/l; Yeast extract g/l; NaCl 10 g/l; NaOH mM; + Môi trường LB đặc: Bao gồm môi trường LB lỏng bổ sung thêm Bacto - Agar 15 g/l - Kháng sinh: Ampicillin - Các dung dịch tách chiết DNA plasmid + Dung dịch I: Glucose 50 mM; Tris-Cl 25 mM, pH 8.0; EDTA 10 mM, pH + Dung dịch II: NaOH 0,2 N, SDS 1%; + Dung dịch III: CH COOK M pH 5.5; - Xác định trình tự: c) Thiết bị Các thiết bị sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Tên Máy xác định trình tự ABI PRISM 3100 Máy ly tâm 5415 R (Centrifuge ) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Máy làm khô chân không (Speed Vacuum Sc 110A) 0 Tủ -20 C, -80 C Lò vi sóng Cân điện tử (Electronic balances) Pippetman Máy ly tâm (Table centrifuge 5415 C) Vortex Bể ổn nhiệt Máy lắc (Shaking Incubator Bộ điện di DNA Công ty sản xuất Applied BioSystems Eppendorf Mettler Toledo Savant Sanyo samsung Ohaus Gilson Eppendorf OSI Rotolab Tempette Junior Techne Gyromax 737R Amerex Instrument d) Các vi sinh vật sử dụng nghiên cứu - Vi khuẩn E coli DH10b sử dụng làm tế bào khả biến tách dòng phân tử 2.2 Phương pháp nghiên cứu - phương pháp lấy mẫu: + Số mẫu lấy: + Kí hiệu tên mẫu: TC-1-255 TC-6-257 + Chọn bánh tẻ thứ từ đỉnh búp xuống + Lấy mẫu vào buổi sáng sớm (7h - 8h sáng) + Số lượng mẫu: mẫu lấy khoảng 300mg + Các mẫu rửa nước 2x pha DEPC, sau cắt mẫu thành mảnh kích thước 0,5 cm, cho vào ống falcol có bổ xung 5-10 lần thể tích dung dịch RNAlater + Để mẫu 4oC qua đêm, loại bỏ dịch nổi, sau chuyển vào tủ -20 -80 - phương pháp tách chiết RNA tổng số: RNA tổng số tách chiết kit: Genejet plant RNA purification kit với quy trình gồm bước: Trước tách RNA, xử lí mẫu ngâm dung dịch RNA later cách: đặt mẫu lên giấy thấm để thấm hết dung dịch RNAlater + Bước 1: Nghiền mẫu: Nghiền 100mg mẫu mô nitơ lỏng cối chày sứ Sau chuyển vào ống epp 1,5 ml chứa 500 µl Plant RNA Lysis Solution, bổ sung với 10 µl DTT 2M PVP Vortex 10- 20 giây + Bước 2: ủ mẫu 560C phút sau ly tâm 14000 vòng/ phút phút, 220C + Bước 3: thu dịch chuyển sang ống epp Bổ sung thêm 250µl cồn 960 Mix + Bước 4: chuyển hỗn hợp sang cột, ly tâm 11000 vòng/ phút phút, 220C, bỏ dịch thu cột + Bước 5: bổ sung 700µl đệm rửa WB1 vào cột (đệm rửa bổ sung ethanol) ly tâm 11000 vòng / phút phút, 220C Bỏ dịch lấy cột đặt sang ống epp 2ml + Bước 6: bổ sung 500µl đệm rửa WB2 ( bổ sung ethanol) vào cột ly tâm 11000 vòng/ phút phút, 220C Bỏ dịch thu cột + Bước 7: bổ sung 500µl đệm rửa WB2 (đã bổ sung ethanol) vào cột lọc, ly tâm 14000 vòng/ phút phút, 220C, bỏ dịch thu cột Sau ly tâm cột phút, 14000vòng/phút, 220C Chuyển cột đặt ống epp 1,5 ml + Bước8: bổ sung 50µ nước free nuclease ly tâm 11000 vòng/ phút phút, 220C, bỏ cột thu dịch Bảo quản lạnh + Bước 9: bảo quản mẫu -700C - Phương pháp tổng hợp cDNA Tổng hợp sợi cDNA đầu tiên: + Bước 1: cho vào ống epp 0,5ml hỗn hợp: 1,5 µl RNA (100ng mRNA) µl 3’ In-Fusion SMARTer CDS Primer (oligodT) Thêm nước khử ion đến 4,5 µl + Bước 2: mix spin nhẹ + Bước 3: ủ ống 720C (máy PCR) phút, 420C phút + Bước 4: chuẩn bị master Mix, để tất ống hóa chất nhiệt độ phòng (tốt để bình đá) cách lấy thành phần theo thứ tự: 2.0 µl 5X First-Strand Buffer 0.25 µl DTT (100 mM) 1.0 µl dNTP Mix (10 mM ) 1.0 µl SMARTer V Oligonucleotide (12 μM) 0.25 µl RNase Inhibitor 1.0 µl SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U)* Tổng thể tích : 5,5 µl * Thêm enzyme phiên mã ngược vào hỗn hợp trước sử dụng sau trộn + Bước : bổ sung 5,5 µl Master Mix vào ống phản ứng ban đầu trộn nhẹ nhàng quay ống thời gian để thu hỗn hợp phía + Bước 6: Ủ ống 420C 90 phút + Bước 7: Ủ ống 680C 10 phút để kết thúc tổng hợp sợi cDNA + Bước 8: ống phản ứng, lấy µl dịch chia đôi vào ống epp sau đặt đá khuếch đại cDNA: + Bước 1: bật máy PCR đến 950C + Bước 2: cho vào ống epp 0,5 ml lần lượt: µl First-strand cDNA 80 µl nước khử ion 10 µl 10X Advantage PCR Buffer µl 50X dNTP Mix (10 mM) µl 5’ PCR Primer II A (12 μM) µl 3’ In-Fusion SMARTer PCR Primer (12 μM) µl 50X Advantage Polymerase Mix Tổng 100 µl cho ống Đảo phủ hỗn hợp phản ứng với giọt dầu khoáng + Bước 3: chu trình nhiệt: • 95 ° C phút • X chu trình 95 ° C 15 giây 65 ° C 30 giây 68 ° C phút + Bước 4: tối ưu hóa chu trình nhiệt Sau chạy 15 chu kỳ, tạm dừng chương trình lấy 30 µl từ ống để làm phản ứng tối ưu hóa chu trình nhiệt gọi “ống tối ưu hóa” phần lại bảo quản 4oC Lấy µl từ “ống tối ưu hóa” sau chạy 15 chu kỳ để điện di phân tích gel Phần lại “ống tối ưu hóa” (25 µl) cho chạy thêm chu kỳ 18 chu kỳ sau lại lấy µl để điện di phân tích gel Phần lại “ống tối ưu hóa” (20 µl) cho chạy thêm chu kỳ 21 chu kỳ sau lại lấy µl để điện di phân tích gel Phần lại “ống tối ưu hóa” (15 µl) cho chạy thêm chu kỳ 24 chu kỳ sau lại lấy µl để điện di phân tích gel Phần lại “ống tối ưu hóa” (10 µl) cho chạy thêm chu kỳ 27 chu kỳ sau lại lấy µl để điện di phân tích gel + Bước 5: lấy µl sản phẩm phản ứng PCR sau chu kỳ chạy thử bước 0,1µg macker DNA (1kb) điện di gel agsrose 1,2% TAE 1X So sánh với macker băng sáng thành dải không phân biệt chạy nhiều chu kỳ ngược lại, băng sáng mờ chạy thiếu chu kỳ nhiệt Như vậy, phản ứng tối ưu phải phản ứng cho hình ảnh rõ nét băng Tuy nhiên số lượng vị trí băng sáng khác Sau phân tích so sánh tìm số chu kỳ tối ưu cho phần lại chạy đến chu kỳ tối ưu + Bước 6: lấy phần dịch để 40C cho chạy đủ số chu kỳ nhiệt tối ưu + Bước 7: chia sản phẩm phản ứng PCR thành ống, ống 85 µl sau thêm vào ống 10 µl xylene cyanol dye 1% Trộn hỗn hợp - tinh phân đoạn + Bước 1: dán nhãn hai 16 ống 1.5ml xếp theo thứ tự + Bước 2: chuẩn bị hai cột Chroma spin + TE1000 cho trình nhỏ giọt 85 µl mẫu - Đảo ngược cột nhiều lần Loại bỏ bong bóng khí từ cột cách đảo ngược cột nhiều lần Sau tháo đáy nắp nhỏ giọt tự nhiên (Nếu dung dịch không thoát - sau phút, đậy nắp gây Áp lực vào cột để thoát nước) Có thể để cột lên vòng chuẩn Để cột nước cách để nhỏ giọt tự nhiên nhìn thấy - giọt gel bề mặt cột Tốc độ nhỏ giọt: 40-60s/ giot, 40 µl / giọt chậm cần làm lại thao tác + Bước 3: sau buffer dự trữ dừng nhỏ giọt, cẩn thận nhẹ nhàng thêm 700 µl dung dịch đệm vào cột , để nhỏ giọt bước + Bước 4: cột ngừng nhỏ giọt (15-20 phút) cẩn thận cho 85 µl sản phẩm PCR nhuộm xylene cyanol dye 1% vào cột để thấm bề mặt cột, tránh tác động vào màng + Bước 5: Để mẫu hấp thụ hoàn toàn vào màng (đến không nhìn thấy chất lỏng bề mặt màng) + Bước 6: Bổ sung nhẹ nhàng 100 µl đệm , + Bước 7: để cột nước sau tiến hành bước Tai thời điểm này, lớp thuốc nhuộm có vài mm cột + Bước 8: đặt giá có chứa ống thu (ở bước 1) cột ống + Bước 9: thêm 600 µl đệm cột bắt đầu thu phân đoạn cDNA từ ống thứ đến ống thứ 16 (khoảng 35 µl) cho ống) đậy nắp ống lại sau lần thu, ống thứ 16 hoàn thành + Bước 10: kiểm tra đặc tính phần trước tiến hành thí nghiệm Mỗi ống lấy µl để tiến hành điện di gel agarose 1,2%, (0,05 µg macker DNA 1kb) Chạy điện di phần thuốc nhuộm chạy khỏi giếng khoảng 1-2 cm dừng lại (nếu để chạy xa khó nhận biết băng cDNA) Xác định phân đoạn cDNA thông qua băng sáng Thu lại phần có chứa cDNA, để chung phần ống 1,5 ml + Bước 11: lặp lại bước 4-10 cho cột thứ hai + Bước 12: cho vào hai ống chứa phần chung cDNA bước 10 ( khoảng 105-140 µl): 1/10 vol Sodium Acetate (3 M, pH 4.8) 1,3 ml Glycogen (20 mg / ml) 2,5 vol 95% ethanol (-20 ° C) + Bước 13: lắc ống trộn nhẹ nhàng + Bước 14: ủ -20 ° C ủ qua đêm để hiệu tốt + Bước 15: li tâm ống 14000 vòng/phút, 20 phút nhiệt độ phòng + Bước 16: cẩn thận lấy phần lên bề mặt pipet cho không động đến phần tủa phía bên + Bước 17: li tâm nhẹ + Bước 18: cẩn thận loại bỏ tất chất lỏng , thêm 600 µl ethanol 80% + Bước 19: li tâm ống 14000 vòng/phút, phút nhiệt độ phòng + Bước 20: : cẩn thận lấy phần lên bề mặt pipet cho không động đến phần tủa phía bên + Bước 21: loại bỏ hết chất lỏng, làm khô tủa 10 phút + Bước 22: hòa tủa 10 µl nước khử ion, sau gộp chung hai ống lại mang đo OD - Tạo vector tái tổ hợp + Bước 1: thiết lập phản ứng gồm ống: ống nghiệm Hóa chất A 5X In-Fusion HD Enzyme μl B C μl μl Đối chứng Đối chứng âm dương μl μl Premix pSMART2IFD Linearized μl Vector (150 ng/μl) SMARTer cDNA (purified, μl 150 ng/μl) dd H2 O pUC19 Linearized Vector Control Insert TOTAL VOLUME μl 4,5 μl 1,5 μl μl 10 μl 10 μl μl μl - μl - - μl μl μl 10 μl 10 μl μl μl 10 μl + Bước 2: trộn ống spin nhẹ xuống + Bước 3: ủ ống 500C 15 phút sau để đá + Bước 4: Thêm 90 μl TE 10 μl QuickClean Resin cho ống từ bước Vortex phút, sau spin xuống chuyển phần bề mặt sang ống sau thêm 1,2 μl glycogen cho ống Trộn thêm 280 μl ethanol 100%, trộn nhẹ + Bước 5: để ống -70 0C nước đá qua đêm + Bước 6: li tâm 15000 vòng /phút 20 phút lấy cẩn thận ethanol mà không làm ảnh hưởng đến tủa bên + Bước 7: để khô tủa, sau hòa phần tủa vào 10 μl nước vô trùng + Bước 8: bảo quản -20 0C - biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli + Bước 1: làm tan tế bào khả biến, sử dụng tế bào sau chúng tan để đạt hiệu biến nạp tốt + Bước 2: Thêm 965 μl LB vào ống epp 2ml có dán nhãn A, B C, đối chứng âm, đối chứng dương + Bước 3: chia 25 μl tế bào khả biến thành phần, cho vào ống epp 1,5ml + Bước 4: cho 10 μl vector tái tổ hợp phần vào ống theo thứ tự ống: A,B Trộn DNA tế bào nhẹ nhàng cách trộn(lắc) mẫu ống lần + Bước 5: Chuyển hỗn hợp vào ống cuvet 0,1cm + Bước 6: điện biến nạp (Electroporat) sau chuyển cuvet + Bước 7: chuyển toàn hỗn hợp sang ống epp dán nhãn có chứa 965 μl LB chuẩn bị bước + Bước 8: lắc 225 vòng/phút 370C + Bước 9: chuẩn bị ống epp 1,5ml dán nhãn: A,B,C, đối chứng âm đối chứng dương Cho vào ống 50 μl LB + Bước 10 Sau ủ giờ, lấy μl dịch từ ống theo thứ tự cho vào ống chứa 50 μl LB Sau trộn nhẹ Phần lại bảo quản 4oC + Bước 11: cấy trải môi trường LB rắn chứa 100μg/ml Ampicilin, 1mM TPTG 75μg/ml X-Gal + Bước 12: Để khô 10 phút + Bước 13: ủ đĩa thạch 37oC qua đêm Ngày hôm sau kiểm tra đĩa - kiểm tra sản phẩm tách dòng: tách plasmid + Bước 1: lấy 1,5 ml mẫu vi khuẩn nuôi dịch lỏng cho vào ống epp Li tâm phút, 6000 vòng/phút 40C + Bước 2: bỏ dịch, hòa tế bào vào trong: 150 μl Sol I: Vortex 150 μl Sol II: đảo nhẹ, để đá khoảng phút 150 μl Sol III: dảo nhẹ, để đá khoảng 5- 10 phút + Bước : bổ sung chloroform : isoamyl ancohol (24 :1) vào dung dịch mẫu theo tỉ lệ :1 + Bước : đảo nhẹ, li tâm 14000 vòng/phút 15 phút 40C + Bước : hút pha chuyển sang ống epp + Bước : bổ sung cồn 100% vào mẫu theo tỉ lệ :1 Để -200C + Bước : ly tâm thu tủa 14000v/p, 15 phút, 40C + Bước : rửa cồn 70% (bổ sung 300 μl) Ly tâm 14000v/p, 10 phút, 40C + Bước : làm khô tủa nhiệt độ phòng 10-15 phút sau bổ sung 30 μl nước khử ion + Bước 10 : điện di kiểm tra kết - Giải trình tự: giải trình tự theo phương pháp hóa học sanger CHƯƠNG III DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 3.1 Dự kiến kết Đề tài dự kiến thu kết sau: Tạo dòng đoạn cDNA/EST từ chè địa Thái Nguyên Xác định đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST tạo dòng từ chè địa Thái Nguyên 3.2 Tiến độ thực - Thời gian thực luận văn: Từ 8/2015 đến 5/2016 - Kế hoạch thời gian cụ thể: Bảng 3.1: Tiến độ thực luận văn STT Các nội dung, công việc thực Sản phẩm Thời gian ( dự kiến) Thu thập mẫu chè địa Mẫu chè địa Thái 8/2015 Thái Nguyên Nguyên Tách RNA tổng số tinh Thu mRNA tinh 9/2015 mRNA Tổng hợp cDNA chè phiên Các đoạn cDNA/EST 10/2015 mã ngược chè Gắn đoạn cDNA/EST vào Vector tái tổ hợp chứa vector tạo dòng Tạo dòng đoạn cDNA/EST đoạn cDNA/EST chè 11/2015 Tạo số dòng 12/2015cDNA/EST chè 1/2016 Xác định trình tự đoạn Biết trình tự 2/2016cDNA/EST tạo dòng Chỉnh sửa và viết luận văn số đoạn cDNA/EST chè 3/2016 4/20165/2016 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Ngọc Qúy, Nguyễn Kim Phong (1997), Cây chè Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Trung Thành (2013), Nghiên cứu xác định số gen tôm sú (penaeus Monodon) sử dụng phương pháp phân tích thư viện cDNA/EST, Luận văn thạc sĩ, viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Hà Nội, Tr 19-27 Trần Đức Trung, Lã Tuấn Nghĩa cs (2009), “Nghiên cứu đa dạng di truyền thị phân tử giống chè Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, (3/2009) Trần Ngọc Việt (2006), Khái thác liệu EST(Expressed Sequence Tags) nhằm phát microsatellite phục vụ cho công tác phân tích so sánh đặc điểm di truyền ong mật, Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học, trường Đại học Nông lâm Hồ Chí Minh, Tr 8-10 Tiếng anh Jian Qiang Ma, Yan Hua Zhou, Chun Lei Ma, Ming Zhe Yao, Ji Qiang Jin, Xin Chao Wang and Liang Chen (2010), “Identification and characterization of 74 novel polymorphic EST-SSR marker in tea plant, Camellia Thynensis”, American journal of Botany: e153-156.2010 Ram Kumar Sharma, Pankaj Bhardwaj(2009), “Identification, characterization and utilization of unigene derived microsatellite markers in tea”, BMC plant Biology2009, 5.93 Rajan Kumar Mishra, Sabdip Chaudhury, Altaf Ahmad, M Pradhan, Tariq O Siddiqi, “ Molecuar analysis of tea clones using AFLP markers, international Journal of integrative Biology [...]... hệ gen của cây chè Những nghiên cứu trước đây đã cho ra những kết quả rất khác nhau Năm 2001, nghiên cứu của Hanson cho thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia sinensis vào khoảng 15.298 Mbp Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase Nghiên cứu tế bào học các giống chè của Kondo... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu - Mẫu được chọn là lá của cây chè trung du đầu dòng lá tím đã được tuyển chọn trong luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Lương chuyên ngành khoa học cây trồng mã số 60.62.01.10 và cây chè trung du lá xanh đã được tuyển chọn trong khóa luận tốt nghiệp của Luân Thị Bích Thùy chuyên ngành khoa học cây trồng với các chỉ tiêu: Chỉ tiêu theo dõi Cây đầu dòng... năng ở chè 1.3.3 Thư viện cDNA/EST ở chè Trong những năm gần đây, những phân tích cDNA/EST của chè đã tạo ra nguồn thông tin khá lớn.Việc giải mã các đoạn trình tự biểu hiện (EST) là phương pháp hữu hiệu trong việc xác định các gen quy định những đặc điểm quan trọng của cây chè Một số phân tích EST của cây chè đã được công bố: Chen et al (2005) xác định được 1.684 ESTs từ chồi non của cây chè Park.. .cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm Hiện nay cây chè phân bố khá rộng rãi trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 vĩ độ nam (Natan – Nam Phi) đến 45 vĩ độ bắc (Gruzia – Liên Xô), là những nơi có điều kiện tự nhiên rất khác xa vùng nguyên sản b) Phân bố Sự phân bố của cây chè phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu Các kết quả nghiên cứu đều đưa đến một kết luận. .. % Sinh trưởng và phát triển của cây chè Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm 1.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè Chè là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nơi trên... thấy đặc điểm cùng nguồn (monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia 1.1.5 Thành phần hóa sinh trong cây chè Phẩm chất của chè thành phẩm được quyết định do những thành phần hóa học của nguyên liệu và kỹ thuật chế biến Thành phần sinh hóa của chè biến động rất phức tạp nó phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện đất đai, địa hình, kỹ thuật canh tác, mùa thu hoạch Trên cơ sở nắm được những đặc điểm. .. rộng cùng với sự tiến bộ của khoa học hiện nay chè được trồng ở những vùng khắc nghiệt hơn 1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây chè Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặc thân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và mang một số đặc điểm sinh học sau đây: Đặc điểm hình thái Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục... chúng ta có thể nghiên cứu điều gì xảy ra trong một trạng thái đã thay đổi, ví dụ như trường hợp bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, để thực hiện được mục tiêu sau cùng, các nhà nghiên cứu phải xác định và nghiên cứu về protein, hay những protein mà nó được mã hóa bởi một gen nào đó Việc tìm thấy một gen mã hóa cho một protein hoặc nhiều protein là điều không dễ dàng Như trước đây các nhà nghiên cứu sẽ bắt đầu... đĩa Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt Quả chè có dạng hình tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín chuyển xang màu xanh thẫm hoặc nâu Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt chè Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác Hạt chè có khối lượng từ 0,6 – 2g thường từ 1- 1,6g Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành... tro: Các nguyên tố tro giữ vai trò quan trọng trong hoạt động của cơ thể sống, chúng là những nhân tố của sự thay đổi trạng thái các chất keo và ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của tế bào Hàm lượng tro trong chè tươi từ 4-5% và trong chè khô từ 5-6% Trong chè, tro chia thành hai nhóm: hòa tan trong nước và không hòa tan trong nước Chè thành phẩm loại tốt, hàm lượng tro ít hơn so với loại chè xấu ... genome nghiên cứu biểu gen chức chè, tiến hành thực đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu đặc điểm đoạn cDNA/EST từ chè địa Thái Nguyên Mục tiêu đề tài Tạo dòng xác định đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST từ. .. hợp từ mRNA chè địa Thái Nguyên Xác định phân tích đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST tạo dòng từ chè địa Thái Nguyên CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 Giới thiệu chung chè Phân loại Cây chè. .. cDNA/EST từ chè địa Thái Nguyên phục vụ cho nghiên cứu sinh học phân tử Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề tài tiến hành nội dung nghiên cứu sau: Nghiên cứu tạo dòng tái tổ hợp mang đoạn cDNA/EST