Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam (luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HỒ VĂN HOÀN NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG VEN BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2013 i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN Error! Bookmark not defined CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG BIỂU Error! Bookmark not defined DANH MỤC HÌNH VẼ Error! Bookmark not defined MỤC LỤC ii MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy) 1.2.5 Phân loại xạ khuẩn phương pháp giải trình tự gene 16SrDNA 1.3 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 10 1.3.1 Nhóm chất kháng sinh polyketide 10 1.3.2 Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide 11 1.3.3 Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide 12 1.3.4 Nhóm kháng sinh isoprenoid 12 1.3.5 Các chất kháng sinh khác 13 1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15 1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 17 1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh nước 17 1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh giới 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu hóa chất dùng nghiên cứu 21 2.1.1 Vật liệu 21 2.1.2 Hóa chất thiết bị 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 ii 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22 2.2.2 Phương pháp xác định thành phần số lượng vi sinh vật mẫu 22 2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh 23 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 24 2.2.5 Phân loại xạ khuẩn phương pháp sinh học phân tử 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh 29 3.2 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 32 3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 32 3.2.2 Đặc điểm hình thái 34 3.3 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 35 3.3.1 Khả sử dụng nguồn nitơ 35 3.3.2 Khả đồng hóa nguồn cacbon 36 3.3.3 Khả chịu muối NaCl 38 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng 38 3.3.5 Ảnh hưởng độ pH 39 3.4 Kết phân loại chủng xạ khuẩn NA113 NA115 40 3.4.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa 40 3.4.2 Phân loại chủng xạ khuẩn phương pháp sinh học phân tử 43 3.5.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men 48 3.5.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon nguồn nitơ 49 3.5.3 Ảnh hưởng pH môi trường độ thoáng khí 51 3.6 Phổ hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn nghiên cứu 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 KẾT LUẬN 53 ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA Error! Bookmark not defined iii MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 3.260 km bờ biển (không tính đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nƣớc ta tính đa dạng cảnh quan tự nhiên nguồn lợi thuỷ sinh vật Với mong muốn khám phá, khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, công nghệ sản xuất sinh học chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng đƣa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ vùng nƣớc ngập mặn, biển xa bờ, chí đáy biển sâu để sinh trƣởng bền vững dựa sở công nghệ Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Xạ khuẩn đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều có khả sản xuất sản phẩm trao đổi chất quan trọng Trong số 8000 chất kháng sinh đƣợc biết giới có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ yếu từ chi Streptomyces Micromonospora Giai đoạn năm 1980 trở trƣớc nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá chủng xạ khuẩn mặt đất Từ vài thập kỷ trở lại nhà khoa học phát chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý nhƣ: khả sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế tế bào ung thƣ… có ý nghĩa ứng dụng y học [1] Cùng với sinh trƣởng công nghệ sinh học đại, nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn biển thu đƣợc nhiều thành tựu to lớn sản xuất sinh khối, dƣợc phẩm… đƣợc sử dụng ngành công nghiệp, y dƣợc học, nông nghiệp… Trong lĩnh vực y dƣợc, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn đời sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật nâng cao sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến tƣợng nhờn thuốc làm ảnh hƣởng đến kết điều trị bệnh Việc tìm chất kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao từ nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh quan trọng, nghiên cứu giúp định hƣớng sản xuất sản phẩm hữu ích từ chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá đa dạng vi sinh vật biển Xuất phát từ định hƣớng trên, thực đề tài: “Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ vùng ven biển Việt Nam” Mục tiêu: Tuyển chọn phân loại chủng xạ khuẩn biển có khả tổng hợp kháng sinh cao định hƣớng ứng dụng y dƣợc Nội dung nghiên cứu: - Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nƣớc, bùn vùng biển Bắc, Trung, Nam - Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn lựa chọn - Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phƣơng pháp giải trình tự gene 16S-rRNA - Nghiên cứu số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn phòng thí nghiệm CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, nƣớc, phần bùn chất hữu khác, chí chất mà vi sinh vật khác không sinh trƣởng đƣợc Số lƣợng xạ khuẩn đất không phụ thuộc vào loại đất mà phụ thuộc vào mức độ canh tác đất khả bao phủ thực vật Đất giàu dinh dƣỡng lớp đất bề mặt thƣờng có số lƣợng lớn xạ khuẩn Trong gam đất canh tác phân lập đƣợc triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa có 10 – 100 nghìn mầm Số lƣợng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm [7] Xạ khuẩn thƣờng sống hoại sinh xác sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhƣng kí sinh thân, củ rễ Xạ khuẩn biển thƣờng đƣợc phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển độ sâu khác sinh vật khác nhƣ san hô, rong biển Trƣớc đó, ngƣời ta tin xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ cạn Tuy nhiên, sau có nhiều nghiên cứu rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển Xạ khuẩn biển thƣờng có khả chịu mặn cao, đặc biệt có chủng Streptomyces ssp sinh trƣởng đƣợc nồng độ NaCl 16% nhiều loài thuộc chi Streptomyces Nocardia sinh trƣởng tốt nồng độ NaCl 10%, Micromonospora sp Salinospora sp có khả chịu mặn cao [24, 25] 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn Ở môi trƣờng đặc, xạ khuẩn sinh trƣởng thành khuẩn lạc khô, kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tùy loài điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ƣớt nhƣ vi khuẩn, nấm men mà thƣờng có dạng thô ráp, có nếp tỏa theo hình phóng xạ Do có tên gọi xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hy Lạp: Aktis “tia”, mykes “nấm”) Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4] Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có lớp: lớp vỏ sợi bện chặt, lớp tƣơng đối xốp lớp có cấu trúc tổ ong Màu sắc khuẩn lạc đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài điều kiện dinh dƣỡng Xạ khuẩn giống nấm mốc chỗ tạo thành hệ sợi, nhƣng lại thể đơn bào, nhân thực kích thƣớc giống vi khuẩn Trên môi trƣờng đặc, hệ sợi xạ khuẩn sinh trƣởng thành hƣớng tạo thành khuẩn ti chất khuẩn ti khí sinh Khuẩn ti chất sinh trƣởng cắm sâu vào môi trƣờng với chức chủ yếu lấy nƣớc thức ăn Khuẩn ti chất sinh trƣởng thời gian dài không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh Ngƣời ta gọi khuẩn ti khí sinh khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp loại khuẩn ti sinh trƣởng từ loại bào tử nảy mầm [4] Nhiều loại có khuẩn ti chất mà khuẩn ti khí sinh, nhƣng có loại nhƣ chi Sporichthya lại có khuẩn ti khí sinh Khi khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản Khuẩn ti xạ khuẩn thƣờng mảnh nấm mốc, đƣờng kính thay đổi khoảng 0,2 – m đến – m Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti vách ngăn không tự đứt đoạn Sau thời gian sinh trƣởng, đầu khuẩn ti khí sinh thƣờng hình thành sợi bào tử Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung khuẩn ti dinh dƣỡng Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lƣới dày khoảng 10 – 20 nm, có tác dụng trì hình dáng khuẩn ti bảo vệ tế bào Căn vào kết cấu hóa học ngƣời ta chia thành tế bào thành nhóm: - Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP glycin Thuộc nhóm có Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides - Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP glycin Thuộc nhóm có Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella - Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP Gồm chi Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora, Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema - Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose galactose Gồm chi Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [4] Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm lớp: lớp dầy 60 – 120 Å, già dầy tới 150 Å; lớp rắn dầy 50 Å lớp dầy 50 Å Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ lớp glycopeptid gồm gốc N-acetylglucozamin liên kết với N-acetymuramic liên kết 1,4-glicozit Khi xử lí lysozym, liên kết bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy màng nguyên sinh chất bao bọc phần lại tế bào tạo thành tế bào trần Cấu trúc sợi xử lí hỗn hợp ether chloroform dung môi hòa tan lipit Điều chứng tỏ lớp thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo lipit Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitin [7] Đối với xạ khuẩn phân lập từ vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy độ bền học cao, chống chịu với điều kiện bất lợi môi trƣờng (nồng độ muối từ - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC) Thành tế bào xạ khuẩn chịu kiềm peptidoglycan có chứa nhiều axit polyme nhƣ axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic axit phosphoric Với điện tích âm thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào hấp thụ ion Na+, H+ đẩy ion OH- Bên cạnh đó, cấu trúc lớp peptidoglycan giống xạ khuẩn trung tính chịu kiềm nhƣng lại khác thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ƣa kiềm chứa nhiều hesoamin axit amin [20] Màng sinh chất xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ yếu phospholipit protein, chúng có cấu trúc chức tƣơng tự nhƣ màng sinh chất vi khuẩn Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trình vận chuyển chất qua màng [4] Thể trung gian hay mesosome nằm phía màng sinh chất có hình phiến, hình bọng hay hình ống Tác dụng thể trung gian làm tăng diện tích tiếp xúc màng tế bào từ làm tăng cƣờng hoạt tính enzyme, tăng chuyển điện tử…[4] Các thể ẩn nhập tế bào chất xạ khuẩn gồm hạt polyphosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [4] Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đặc biệt khác với vi sinh vật nhân sơ khác tỉ lệ G – C cao (>70%) vi khuẩn 25 – 45% Một đặc điểm đáng lƣu ý xạ khuẩn chúng không bền vững di truyền thƣờng xảy đột biến phân tử DNA Điều tạo tính đa dạng hình thái, tính kháng thuốc xuất dị vòng Hơn nữa, tự nhân lên đoạn DNA làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền xạ khuẩn [7] 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn Một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn dựa vào hình thái kích thƣớc cuống sinh bào tử Sợi bào tử có nhiều hình dạng khác tùy theo loài: thẳng-lƣợn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) có móc, vòng (Retinaculiaperti)… có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử, bên có chứa bào tử nang Bề mặt bào tử nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn [4, 5, 13] Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành theo phƣơng thức sau đây: - Phƣơng thức sinh trƣởng toàn bộ: toàn hay phận khuẩn ti hình thành thành bào tử - Phƣơng thức sinh trƣởng thành: thành bào tử sinh từ tầng nằm màng nguyên sinh chất thành khuẩn ti Trƣờng hợp gặp Planomonospora - Phƣơng thức sinh trƣởng bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ti không tham gia vào trình hình thành bào tử Trƣờng hợp gặp Thermoactinomycetes [4] Muốn kích thích hình thành bào tử trƣớc hết phải kích thích hình thành khuẩn ti khí sinh Nhiều tài liệu đề cập đến mối quan hệ hình thành bào tử môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng nuôi cấy xạ khuẩn Một số tác giả cho việc bổ sung CaCO3 CaCl2 vào môi trƣờng kích thích hình thành bào tử xạ khuẩn Tuy nhiên, việc bổ sung nguyên tố vào môi trƣờng phải đƣợc nghiên cứu kĩ sử dụng nồng độ định Nếu môi trƣờng giàu dinh dƣỡng trình hình thành bào tử thƣờng bị kìm hãm Độ ẩm nhiệt độ ảnh hƣởng đến hình thành bào tử [7] 1.2 Phân loại xạ khuẩn 1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Trong phân loại ngƣời ta thƣờng chia xạ khuẩn thành nhóm dựa dấu hiệu hình thái: - Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt Đặc trƣng nhóm sinh sản bào tử phân hóa thành KTKS KTCC - Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang Đặc trƣng nhóm khuẩn ti phân chia theo hƣớng vuông góc với nhau, tạo cấu trúc tƣơng tự nang bào tử - Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản cách phân đốt khuẩn ti - Nhóm xạ khuẩn dạng tƣơng tự Corynebacter dạng cầu: tế bào có hình chữ V, T dạng cầu, thông thƣờng khuẩn ti Trƣớc kia, nhiều loại xạ khuẩn đƣợc phân chia tùy theo khác đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy nhƣ màu KTCC, KTKS, sắc tố tan; có mặt KTCC, hình dạng kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử phân đốt khuẩn ti Tuy nhiên, ngày tiêu bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học sinh học phân tử [7, 36] Mannitol + + D-fructose + + L-rhamnose + + Raffinose - - ISP9 (đ/c âm) ± - Ghi chú: +: có sinh trưởng; - không sinh trưởng; ± sinh trưởng yếu 3.4.2 Phân loại chủng xạ khuẩn phương pháp sinh học phân tử 3.4.2.1 Kết tách DNA tổng số Trƣớc tiến hành tách DNA tổng số, cấy xạ khuẩn môi trƣờng ISP2 (dịch thể), nhiệt độ 30oC, sau 48 thu sinh khối DNA đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Sambrook cs có cải tiến Kết tách chiết đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% đƣợc thể hình sau: Hình 3.9 Kết điện di DNA tổng số chủng xạ khuẩn gel agarose 1%: băng 2: DNA chủng NA113; băng 4: DNA chủng NA115 DNA tổng số chủng xạ khuẩn NA113 NA115 đƣợc tách sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Kết điện di cho thấy đoạn gene điện di xuất băng có kích thƣớc rõ nét Đo quang phổ bƣớc sóng 260 280 nm cho thấy hệ số đạt đƣợc chủng NA113 1.88 chủng NA115 1,96 Nhƣ vậy, nói DNA thu đƣợc trình tách chiết đạt yêu cầu tiếp tục tiến hành nghiên cứu 43 3.4.2.2 Kết nhân gene mã hóa 16S-rRNA phản ứng PCR Để phân loại định tên xác chủng xạ khuẩn, tiến hành nhân gene mã hóa 16S-rRNA để làm sở phân tích trình tự Đây gene thị đƣợc dùng phổ biến phân loại vi sinh vật Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân gene FC27 RC1492 Kết đƣợc thể hình 3.10 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1% (M: thang ADN chuẩn kb; băng 1: sản phẩm PCR nhân dòng gene mã hóa 16S-rRNA chủng NA113, băng 2: sản phẩm PCR nhân dòng gene mã hóa 16S-rRNA chủng NA115) Kết điện di hình 3.10 cho thấy sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, sản phẩm phụ Dựa vào thang DNA chuẩn cho thấy, sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb tƣơng ứng với kích thƣớc tính toán chọn cặp mồi đặc hiệu Do kết luận đoạn DNA đƣợc nhân lên gene mã hóa 16SrRNA chủng NA113 NA115 Kết sở để tiến hành tách dòng giải trình tự phân loại chủng xạ khuẩn 3.4.2.3 Kết giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA Sau thực phản ứng PCR với gene mã hóa 16S-rRNA, tiến hành tinh sản phẩm PCR kit PureLinkTM-DNA Purification (Invitrogen) Kết giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA chủng xạ khuẩn NA113 hai chiều phòng TNTĐCNG - viện Công nghệ sinh học, đƣợc so sánh với trình 44 tự gene tƣơng ứng ngân hàng liệu sở GenBank công cụ BLAST NCBI cho thấy: gene mã hóa 16S rRNA chủng NA113 có độ tƣơng đồng cao 99% so với gene tƣơng ứng chủng thuộc loài S scabies Bảng 3.10 Kết so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA chủng NA113 với gene tƣơng ứng chủng xạ khuẩn đƣợc đăng ký GenBank Trình tự gene mã hóa 16S rRNA chủng xạ khuẩn đƣợc so sánh Acc No Độ tƣơng đồng (%) Chủng S scabies RL-34 NR_025865.1 100 Chủng S scabies 8722 AB026202.1 100 Chủng Streptomyces sp WI03-4c EU080962.1 99 Chủng Streptomyces sp EF-35 AF112154.1 99 Chủng S scabies R90-3 AB026205.1 99 Chủng S scabies RB2 AB026204.1 99 Chủng S scabies CEK-037 AB026206.1 99 Chủng S scabies D63864.1 99 Chủng S scabies D63863.1 99 Chủng Streptomyces sp SDT-5 AM889489.1 99 Chủng Streptomyces sp NM-15 AM889481.1 99 Chủng S scabies LM5MT-2 AB026210.1 99 45 AB026205.1|S.scabies R90-3 AB026206.1|S.scabies CEK-037 AF112154.1|Streptomyces sp.EF-35 D63862.1|S scabies NA113 NR 074848.1|S scabies 87.22 NR 025865.1|S.scabies RL-34 EU080962.1|Streptomyces sp.WI03-4c D63864.1|S.scabies Hình 3.11 Cây phân loại chủng NA113 số chủng xạ khuẩn Kết giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA chủng xạ khuẩn NA115 hai chiều đƣợc so sánh với trình tự gene tƣơng ứng ngân hàng liệu sở GenBank công cụ BLAST NCBI cho thấy: gene mã hóa 16S-rRNA chủng NA115 có độ tƣơng đồng cao tới 100% so với gene tƣơng ứng chủng S tendae ATCC 19812, S tendae NBRC 12822 S tendae KSI 1700 (Bảng 3.11) 46 Bảng 3.11 Kết so sánh trình tự gene mã hóa 16S rRNA chủng NA115 với gene tƣơng ứng chủng xạ khuẩn đƣợc đăng ký GenBank Acc No Độ tƣơng đồng (%) Chủng S tendae ATCC 19812 NR_025871.1 100 Chủng không nuôi cấy đƣợc D1B5 HM131970.1 100 Chủng Streptomyces sp 1A01559 EF012090.1 99 Chủng S tendae 13661U EU741192.1 100 Chủng S lividans rrnB Y00484.1 99 Chủng xạ khuẩn R03 AY944262.1 99 Chủng Streptomyces sp OAct 28 JX047030.1 99 Chủng Streptomyces sp ME01-18h EU080950.1 99 Chủng S tendae NBRC 12822 AB184172.1 100 Chủng Streptomyces sp 3194 DQ663150.1 99 Chủng Streptomyces sp 223116 GU130100.1 99 Trình tự gene mã hóa 16S rRNA chủng xạ khuẩn đƣợc so sánh Kết hợp kết phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA chủng NA113 NA115 với kết thu đƣợc nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn này, đặt tên chủng S scabies NA113 S tendae NA115 47 EF012090.1|Streptomyces sp 1A01559 FJ267618.1|Streptomyces sp 216802 FJ267617.1|Streptomyces sp 216801 JX047063.1|Streptomyces sp OAct27 JQ819729.1|S tendae AM13 NR042829.1|Streptomyces sp 40002 NR042760.1|Streptomyces sp 40003 EU741192.1|S tendae 13661U HM594286.1|S tendae M23 KC292819.1|S tendae C-4 NA115 NR025871.1|S tendae ATCC19812 Hình 3.12 Cây phân loại chủng NA115 số chủng xạ khuẩn 3.5 Ảnh hƣởng số yếu tố lên men tới khả sinh chất kháng sinh chủng S scabies NA113 S tendae NA115 3.5.1 Lựa chọn môi trường lên men Trong trình lên men, việc lựa chọn môi trƣờng thích hợp yếu tố định đến hoạt tính kháng sinh thu đƣợc Để chọn đƣợc môi trƣờng lên men đáp ứng đƣợc yêu cầu trên, sử dụng loại môi trƣờng lên men Kết lên men đƣợc thể bảng 3.12, vi sinh vật kiểm định B subtilis ATCC 6633 48 Bảng 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn chủng xạ khuẩn NA113 NA115 môi trƣờng lên men khác Chủng xạ khuẩn Môi trƣờng lên men, Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm) 48 MT7 79 M1-ASW A4H MPM MPG NA113 23 17 14 14 NA115 12 - 16 23 22 - - Chủng NA113 có hoạt tính mạnh lên men môi trƣờng MT7 với vòng kháng khuẩn 23 mm, chủng NA115 sinh chất kháng sinh có hoạt tính mạnh môi trƣờng M1-ASW với vòng kháng khuẩn 23 mm, môi trƣờng MT7, MPG MPM chủng NA115 hoạt tính Môi trƣờng MT7 M1-ASW đƣợc lựa chọn để lên men chủng xạ khuẩn nghiên cứu 3.5.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon nguồn nitơ Những hiểu biết thành phần môi trƣờng lên men (nồng độ nguồn cacbon, nitơ, photphat vô cơ, chất kích thích kìm hãm sinh tổng hợp chất kháng sinh) nhƣ ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy khác (nhƣ pH, nhiệt độ, độ thông khí, đặc điểm chủng giống) có ý nghĩa to lớn điều khiển trình lên men nhằm trì trạng thái hoạt động kéo dài pha sinh tổng hợp chủng sản xuất Trên sở môi trƣờng lên men lựa chọn đƣợc, tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn cacbon nitơ tới khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng thí nghiệm B subtilis ATCC 6630 49 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng nguồn cacbon nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn chủng NA113 NA115 Khả sinh trƣởng sinh chất kháng khuẩn (D-d, mm) Nguồn cacbon NA113 NA115 Glucose ++ 18 ++ 17 Maltose + 21 + 20 Tinh bột ++ 23 ++ 24 Dextrose + 19 + 20 Saccarose + 20 + 19 NH4Cl ± 10 - (NH4)2SO4 - - Yeast extract + 20 ++ 21 Casein ++ 23 ++ 20 Pepton + 19 ++ 25 Trypton + 19 ++ 21 Cao ngô ± 11 ± Bột đâu tƣơng ++ 23 ++ 23 Khô lạc ± 10 ± 10 Malt extract ± 10 ± Nguồn nitơ Ghi chú:+ Sinh trưởng bình thường; - Không sinh trưởng; ± Sinh trưởng yếu; ++ Sinh trưởng tốt Kết cho thấy chủng xạ khuẩn NA113 triển tốt môi trƣờng có nguồn cacbon tinh bột, glucose Nguồn cacbon tốt để tạo chất kháng sinh tinh bột với vòng kháng khuẩn 23 mm hoạt tính kháng sinh sử dụng nguồn cacbon glucose với vòng kháng khuẩn 18 mm Bột đậu tƣơng casein nguồn nitơ thích hợp cho sinh trƣởng tổng hợp chất kháng sinh chủng NA113 với vòng kháng khuẩn 23 mm Trên môi trƣờng nitơ vô cơ, chủng sinh trƣởng yếu hoạt tính kháng sinh yếu Tinh bột nguồn cacbon thích hợp cho sinh trƣởng tổng hợp chất kháng sinh chủng NA115 (VKK 24 mm); nguồn nitơ thích hợp pepton 50 với vòng kháng khuẩn 25 mm Chủng không sinh trƣởng môi trƣờng có nitơ vô 3.5.3 Ảnh hưởng pH môi trường độ thoáng khí Độ thoáng khí pH ban đầu có vai trò quan trọng trình tạo chất kháng sinh Chủng xạ khuẩn đƣợc nuôi môi trƣờng lên men lựa chọn trên, với pH khác (từ - 9) Để xác định ảnh hƣởng độ thoáng khí tới sinh tổng hợp chất kháng sinh, thay đổi thể tích dịch nuôi bình có dung tích 500ml để ôxi khuếch tán vào trong, từ xác định đƣợc thể tích môi trƣờng nuôi cấy thích hợp Bảng 3.14 Ảnh hƣởng pH ban đầu độ thoáng khí đến đến hoạt tính kháng khuẩn chủng NA113 NA115 pH NA113 NA115 15 13 22 19 28 27 20 15 15 11 10 15 13 15 22 19 20 28 27 25 26 27 30 15 19 Độ thoáng khí (%, v/v) Kết cho thấy hai chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh môi trƣờng có pH 7, chủng NA113 có hoạt tính kháng B subtilis ATCC6633 với đƣờng kính vòng kháng khuẩn 28 mm vòng kháng khuẩn chủng NA115 27 mm Thể tích môi trƣờng chiếm 20 – 25% thể tích bình nuôi cho hiệu tổng hợp chất kháng sinh cao Chủng NA113 có vòng kháng khuẩn 28 mm có lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 20% 26 mm với lƣợng dịch môi trƣờng chiếm 25% 51 thể tích bình Chủng NA115 có hoạt tính mạnh lƣợng dịch nuôi chiếm 20 – 25% thể tích bình lên men với vòng kháng khuẩn 27 mm 3.6 Phổ hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn nghiên cứu Kiểm tra phổ kháng sinh chủng xạ khuẩn NA113 NA115 cho thấy, dịch chiết sinh khối hoàn toàn không ức chế vi sinh vật kiểm định, chứng tỏ chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp chất kháng sinh tiết vào môi trƣờng nuôi cấy Dịch chiết từ dịch lên men chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mức độ khác Cả hai chủng NA113 NA115 sinh chất kháng sinh kháng đƣợc nhiều chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm B subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, S epidermidis ATCC 12228, S typhi IFO14193, E coli ATCC 11105 C albicans ATCC 10321; không kháng đƣợc chủng vi sinh vật kiểm định A faecallis P auroginosa Với vi sinh vật kiểm định E aerogenes ATCC 13048 có chủng NA113 kháng đƣợc với vòng kháng khuẩn 13 mm Kết thu đƣợc phổ kháng khuẩn chủng xạ khuẩn S scabies NA113 S tendae NA115 mở tiềm ứng dụng sản xuất thuốc dùng y dƣợc Bảng 3.15 Phổ kháng khuẩn chủng xạ khuẩn S scabies NA113 S tandae NA115 Đƣờng kính vòng đối kháng (mm) Chủng vi sinh vật kiểm định NA113 NA115 B subtilis ATCC 6633 25 24 B cereus ATCC 21778 14 21 S epidermidis ATCC 12228 26 22 E coli ATCC 11105 22 17 E aerogenes ATCC 13048 13 - - - 15 19 P auroginosa - - C albicans ATCC 10231 15 A faecallis S typhi IFO 14193 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ mẫu đất, nƣớc, bùn thu thập từ vùng biển Hải Phòng, Quảng Ninh Nghệ An phân lập đƣợc 40 chủng xạ khuẩn, 30 chủng có khả sinh chất kháng sinh Chủng NA113 NA115 có hoạt tính kháng sinh cao đƣợc chọn tiếp tục nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sinh học, kết hợp giải trình tự gene mã hóa 16SrRNA, phân loại đƣợc chủng NA113 thuộc loài S scabies đặt tên S scabies NA113 Chủng có khả sinh trƣởng tốt với nguồn nitơ hữu nhƣ cao nấm men, trypton, pepton pH thích hợp từ – 10 Chủng sinh trƣởng tốt nồng độ NaCl từ – 5% nhiệt độ 30oC Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa giải trình tự gene 16SrRNA, phân loại đƣợc chủng NA115 thuộc loài S tendae đặt tên S tandae NA115 Chủng thích hợp với pH – 10, nồng độ NaCl – 3% nhiệt độ 30oC Hai chủng S scabies NA113 S tendae NA115 có khả kháng lại chủng vi sinh vật kiểm định B subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 11778, S epidemidis ATCC 12228, C albicans ATCC 10231 E coli ATCC 11105, S typhi IFO 14193 Ngoài chủng NA113 kháng đƣợc vi khuẩn E aerogenes ATCC 13048 Môi trƣờng thích hợp để chủng NA113 sinh chất kháng sinh môi trƣờng MT7; pH thể tích môi trƣờng nuôi cấy chiếm 20% thể tích bình Trong môi trƣờng thích hợp cho chủng NA115 M1-ASW; pH thể tích môi trƣờng nuôi cấy chiếm 20 – 25% thể tích bình thích hợp cho trình lên men ĐỀ NGHỊ Khảo sát điều kiện lên men thích hợp cho tổng hợp chất kháng sinh Nghiên cứu tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn biển S scabies NA113 S tendae NA115, thử hoạt tính kháng tế bào ung thƣ chất kháng sinh thu đƣợc 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp – chất kháng sinh Viện Khoa học Việt Nam, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – tập 1, NXB KH KT, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - tập 3, NXB KH KT, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB ĐHSP, Hà Nội Nguyễn Nhƣ Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, NXB Giáo Dục, Hà Nội Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối rễ phân lập Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học, viện CNSH, Trung tâm KHTN CN Quốc Gia, Hà Nội Lê Gia Hy cs (2005), “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn biển HT0523”, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống định hướng y học, 549-552, NXB KHKT, Hà Nội Bùi Minh Lý, Ngô Quyền Bƣu, Nguyễn Duy Nhứt, Phạm Đức Thịnh, Trần Thị Thanh Vân (2007), “Nghiên cứu sản xuất Fucoidan từ rong nâu Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học Biển Đông 54 10 Chu Văn Mẫn (2011), Tin học Công nghệ Sinh học, NXB Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội 11 Nguyễn Phƣơng Nhuệ (2010), Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, Luận án tiến sĩ Sinh học, viện CNSH, viện KH CN Việt Nam, Hà Nội 12 Nguyễn Duy Nhứt cộng sự, (2009), “Bƣớc đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn số loài rong biển Khánh Hòa”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 825- 830 13 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Giáo dục, Hà Nội TIẾNG ANH 14 Carlos O., Carmen M., José A S (2009), “Antitumor Compounds from Marine Actinomycetes”, Marine Drugs, 7, 210-248 15 Demain A L (1981), Industrial Microbiology, Science 214, 987 – 995 16 George P R (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd, Springer, 1709 – 1712 17 Isoken Nekpen Henrietta Ogunmwonyi (2010), Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach, Master of Science in Microbiology, Department of biochemistry and microbiology faculty of science and agriculture, University of for Hare, Alice, South Africa 18 James B M., Arjun H B., Romila D C., Gerhard S., Emmanuel Z., Mahmood P., Jeffrey J., Valerie S B., Mustapha A., Chris M F., Xidong F., Zhizi Z., Guy T C (2008), “Biosynthesis of Diazepinomicin/ECO-4601, a Micromonospora Secondary Metabolite with a novel ring system”; J Nat Prod, 71, 1585-1590 55 19 Jin Xiong (2006), Essential Bioinformatics, Cambridge University press, New York 20 Kamerua Masahiro and Moris Kates (1999), “Structural diversity of membrane lipits in member of Halobacteriaceae”, Bioscience Biotechnology Biochem, 63(6), 969-972 21 Keswanit J and Whitman W.B (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 – 678 22 Kin S Lam (2006), “Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes”, Current Opinion in Microbiology, 245-251 23 Krishnaraj M., Mathivanan N (2009), “Antimicrobial potential of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal” Envis centre newsletter, vol 7, issue 24 Nor Ainy Mahyudin (2008), “Actinomycetes and Fungi associated with marine Invertebrates: A potential source of bioactive compounds”, Doctor of Philosophy in Microbiology at the University of Canterbury, New Zealand 25 Paul R Jensen, Dwight R., and Fenical W (1991), “Distribution of Actinomycetes in Near-Shore Tropical Marine Sediments”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 57, No 4, 1102-1108 26 Paul R Jensen, Tracy J Mincer, Philip G Williams, William Fenical (2005), “Marine actinomycete diversity and natural product discovery”, Antonie van Leeuwenhoek, 43-48 27 Robert S., E G D Murray, Nathan R (1957), Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, 7th, Williams & Wilkins , 744-822 28 Rofiq Sunaryanto, Bambang Marwoto (2010), “Marine actinomycetes screening of Banten west coast and their antibiotics purification” Biodiversitas, volume 11, 4, 176-181 56 29 Sambrook J and Rusell W.D (2001), Molecular cloning – Laboratory manual, vol 2, 3nd, pp 8.4 – 8.25, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Newyork 30 Shirling E.B., Gottlieb D (1966) International of systematic bacteriology: Method for characterization of Streptomyces species Derpartment of Botany and Bacteriology Ohio Wesleyan University, Delaware, Ohio and Derpartment of Plant Pathology University of Illinois, Urbana, Illinois 31 Stanley T Williams et al (1989), Bergey’s Mannual® of Systematic Bacteriology Williams & Wilkins Vol 4, 2452-2492 32 Sumei Li, Xinpeng Tian, Siwen Niu, Wenjun Zhang, Yuchan Chen, Haibo Zhang, Xianwen Yang, Weimin Zhang, Wenjun Li, Si Zhang, Jianhua Ju, Chángheng Zhang (2011) “Pseudonocardians A-C, New diazaanthraquinone derivatives from a deap-sea actinomycete Pseudonocardia sp SCSIO 01299” Marine Drugs, 9, 1428-1439 33 Turk biol (2003), Investigaion of the Antimicrobial Activity of some Streptomyces Isolates, No 27, 79-84 34 Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P Reena A (2012), “Antimicrobial potential of actinomycetes species isolated from marine environment”, Asian Pacific Journal og Tropical Biomedicine, 469-473 57 [...]... ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ, kháng khuẩn Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng khuẩn Kháng khuẩn, kháng ung thƣ Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng tế bào ung thƣ Kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ung thƣ Kháng khuẩn Kháng khuẩn 1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn. .. ngừng quá trình sinh tổng hợp CKS Sự thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp làm giảm khả năng tổng hợp CKS [7] 1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả năng sinh các chất có hoạt tính đối kháng còn hạn... 1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới Trong những năm gần đây, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiều nghiên cứu mới về vi sinh vật ở nhiều nƣớc trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển nhƣ các chất kháng khuẩn, kháng virus, kháng tế bào ung thƣ, kháng nấm, chống đông máu hoặc là kháng trùng sốt... năng sinh kháng sinh kháng C albicans ATCC 10231 và chỉ có 17,5% số chủng có khả năng sinh kháng sinh kháng chủng nấm men này Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn 3.2 Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy Từ 30 chủng có hoạt tính kháng sinh chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính mạnh nhất để tiếp tục nghiên cứu sâu hơn bao gồm NA113 và NA115 Các chủng xạ khuẩn. .. ra Vi sinh vật sau khi nuôi lắc đem ly tâm ở 6000 - 8000 vòng/phút, lấy dịch nhỏ vào lỗ thạch Sau đó cho vào tủ lạnh 6-8 giờ để dịch tế bào khuếch tán vào môi trƣờng rồi chuyển ra nuôi ở 28 - 30oC sau 14 - 18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn [3] Chọn và giữ các chủng có vòng kháng khuẩn để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại 2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn Nghiên cứu. .. có quy mô lớn nghiên cứu các vi sinh vật và tách chiết các chất kháng sinh từ vi sinh vật biển Tác giả Lê Gia Hy và cs, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập và nghiên cứu đƣợc đặc điểm của chủng vi khuẩn biển HT0523 có nhiều đặc điểm quý có thể khai thác trong nuôi trồng thủy sản Chủng vi khuẩn biển HT0523 chính là vi khuẩn Gram dƣơng, sinh bào tử có khả năng ức chế mạnh cả 2 chủng vi sinh vật Vibrio... năng sinh trƣởng và sinh trƣởng bình thƣờng khi không có các hợp chất này Do đó, vai trò đối với tế bào của các sản phẩm này cần đƣợc nghiên cứu kỹ lƣỡng hơn [11] 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ, thành phần môi trƣờng lên men… Để xạ khuẩn sinh trƣởng tốt và hình thành các. .. năng ức chế vi sinh vật kiểm định, 30 chủng có khả năng sinh chất kháng sinh; chiếm 75% số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc Điều này cho thấy, vi sinh vật biển có tiềm năng lớn đối với ngành hóa dƣợc, đặc biệt là xạ khuẩn, đòi hỏi chúng ta cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa để khai thác nguồn lợi này Trong 30 chủng có hoạt tính kháng sinh, có 5 chủng sinh chất kháng sinh kháng cả 4 chủng vi sinh vật kiểm định... trong phân loại xạ khuẩn [7] 1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Khi phân loại xạ khuẩn ngƣời ta thƣờng sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trƣởng Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng đƣợc xác định nhƣ pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với chất kháng sinh, 8 khả năng tạo thành chất kháng. .. kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trƣng của xạ khuẩn Tuy nhiên, do xạ khuẩn thƣờng xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thƣờng có giá trị thấp về mặt phân loại Nhƣng để phát hiện loài mới ngƣời ta thƣờng sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số [7, 34] 1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy) Phân loại số đƣợc Williams và cs, (1983) sử dụng để phân loại chi ... ích từ chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá đa dạng vi sinh vật biển Xuất phát từ định hƣớng trên, thực đề tài: Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ vùng ven biển Việt. .. hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả sinh chất có hoạt tính đối kháng. .. sát vòng kháng khuẩn [3] Chọn giữ chủng có vòng kháng khuẩn để nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại 2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn Nghiên cứu định tên chủng xạ khuẩn