Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh các chủng vi khuẩn lao ở việt nam (luận văn thạc sĩ)
MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam 1.2 VI KHUẨN LAO 11 1.2.1 Đặc điểm phân loại 11 1.2.2 Đặc điểm cấu trúc 11 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 15 1.2.4 Khả gây bệnh 17 1.2.5 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao 18 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 25 1.3.1 Phương pháp soi trực tiếp 25 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy 26 1.3.3 Phương pháp phát kháng nguyên kháng thể 27 1.3.4 Phương pháp γ-interferon …………………………………………….23 1.3.5 Sinh học phân tử chẩn đoán lao 29 1.3.6 Các nghiên cứu chẩn đoán phân tử vi khuẩn lao Việt Nam tạo kit PCR chẩn đoán lao……………………………………………………27 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.1.1 Các chủng vi khuẩn lao 34 2.1.2 Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng 34 2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Các hóa chất thiết bị 30 2.2.2 Các cặp mồi sử dụng PCR multiplex PCR 37 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 38 2.3.2 Tách chiết DNA 39 2.3.3 Kĩ thuật PCR multiplex PCR 41 2.3.4 Phương pháp điện di 43 2.3.5 Tạo kit multiplex PCR ứng dụng chẩn đoán lao 44 2.3.6 Kiểm tra áp dụng kit multiplex PCR 46 2.4 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 47 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48 3.1 KẾT QUẢ TẠO KIT MULTIPLEX PCR ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN LAO 48 3.1.1 Tách chiết DNA 48 3.1.2 Tạo panel 50 3.1.3 Kết tối ưu qui trình multiplex PCR với gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA 54 3.1.4 Tạo master mix 63 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KIT MULTIPLEX PCR 63 3.2.1 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu ngưỡng phát kit mPCR panel mẫu 63 3.2.2 Đánh giá hiệu chẩn đoán kit mPCR mẫu bệnh phẩm lâm sàng 71 3.2.3 Kiểm tra độ ổn định master mix 73 KẾT LUẬN 73 KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Lời cảm ơn! Lời cảm ơn xin trân trọng gửi tới PGS TS Nguyễn Thái Sơn, người Thầy tận tình hướng dẫn bảo tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực luận văn Tôi xin gửi tới thầy lòng kính trọng biết ơn sâu sắc! Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị Phòng Vi sinh Vật Mầm bệnh Sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh - Y - Dược học Quân - Học viện Quân Y Cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình anh chị trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy cô Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho trình học tập trường Cuối cùng, muốn nói lời cảm ơn sâu sắc đến Gia đình bạn bè động viên giúp đỡ để hoàn thành khóa học thực tốt luận văn này! Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Thị Thanh Mai DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AFB Acid Fast Bacilli BCG Bacille Calmette-Guérin (Trực khuẩn Calmette-Guérin ) Bp Base pairs (Cặp base) BSA Bovine Serum Albumin DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates DR Direct Repeat (Đoạn lặp lại trực tiếp) EDTA Ethylene Diamine Tetra Acid ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 10 GuSCN Guanidinium thiocyanate 11 IR Inverted Repeat (Đoạn lặp lại ngược chiều) 12 kDa kilo-Dalton 13 IS Insertion Sequence (Trình tự chèn) 14 LAM Lipoarabinomannan 15 MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube 16 MOTT Mycobacteria other than tuberculosis 17 MTBC Mycobacteria tuberculosis complex 18 M t Mycobacterium tuberculosis 19 OD Optical Density (Mật độ quang học) 20 ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở) 21 PBS Phosphat Buffer Saline 22 PCR Polymerase Chain Reaction 23 PCRRFLP Polymerase Chain Reaction - Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài đoạn giới hạn dựa PCR) 24 PE Proline-Glutamine 25 PDIM Phthiocerol dilycoserosates 26 PGL Phenolic glycolipids 27 RFLP 28 PGRS 29 PPD Purified Protein Derivative 30 PPD-S Purified Protein Derivative Standard 31 PPE Proline-Proline-Glutamine 32 RNA Ribonucleic acid 33 SDS Sodium dodecyl sulfate (NaDS - C12H25NaO4S) 34 SL Sulfolipids 35 TB Tuberculosis (vi khuẩn lao) 36 TBE Tris - Boric Acid - EDTA 37 UV Ultraviolet (tử ngoại) 38 XDR-TB Xtensively drug-resistant tuberculosis (Lao kháng đa thuốc mở rộng) 39 WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) Restriction fragment length polymorphism (Phân tích đa hình độ dài đoạn giới hạn) Polymorphic GC-rich Repetitive Sequences (Trình tự lặp lại giầu G-C) MỞ ĐẦU Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao chiếm 1/3 dân số giới Hàng năm có thêm khoảng triệu người mắc lao có khoảng triệu người chết lao Với tốc độ lây truyền nhanh tỷ lệ tử vong cao vậy, bệnh lao xếp vào bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Tuy nhiên theo ước tính tỷ lệ phát bệnh đạt 37% Như số bệnh nhân mắc lao không phát chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, nguồn lây nhiễm khó kiểm soát Theo đánh giá WHO Việt Nam quốc gia phát triển có tỉ lệ nhiễm lao đứng thứ 12 số 22 nước có số bệnh nhân mắc lao cao giới (WHO 2004) Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3, sau Trung Quốc Philipine [2, 11, 74] Trước diễn biến nghiêm trọng đó, tổ chức Y tế Thế giới kêu gọi quốc gia giới quan tâm đặc biệt đến phòng chống kiểm soát bệnh lao Bệnh lao ngày trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt lao kháng đa thuốc gây tử vong lớn, cần thiết việc phát điều trị sớm Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh xác Tuy nhiên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn Ở Việt Nam, phương pháp phổ biến nhuộm Ziehl- Neelsen Tuy nhiên phương pháp phát trường hợp số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/1ml bệnh phẩm, để sót nhiều bệnh nhân kết âm tính giả Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao môi trường LowensteinJensen coi tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán, nhiên phải đến tuần nuôi cấy cho kết Trên môi trường nuôi cấy cải tiến MGIT, BACTEC đến tuần, khó đáp ứng yêu cầu giám sát kiểm soát bệnh lao [4, 19] Hiện nay, với phát triển công nghệ sinh học khắc phục nhược điểm Việc áp dụng công nghệ sinh học phân tử chẩn đoán lao rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống hai ngày Phương pháp có độ nhậy độ đặc hiệu cao, cho phép phân biệt xác loài có khả gây bệnh lao phát khả kháng thuốc thông qua gen đặc trưng Hiện nay, số sở nước áp dụng sinh học phân tử chẩn đoán lao chủ yếu sử dụng kít chẩn đoán cũ nhằm vào nhân đoạn IS6110, trình tự đặc trưng vi khuẩn lao [28, 34] Tuy nhiên, gần số nghiên cứu công bố tỷ lệ định chủng lao không chứa trình tự IS6110, đặc biệt chủng tìm thấy Ấn Độ Đông Nam Á có Việt Nam [34, 72] Vì dễ bỏ sót bệnh nhân có mang vi khuẩn lao khuyết IS6110 Do cần thiết kế loại primer để chẩn đoán lao Việt Nam cách hiệu xác Theo số nghiên cứu gần cho biết, đoạn gen IS6110 có số gen đích khác IS1081 23SrDNA có mặt tất chủng lao gây bệnh Do sử dụng lúc cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn IS6110, IS1081 23S rDNA thuận lợi việc phát M tuberculosis complex, tránh bỏ sót bệnh nhân [13] Xuất phát từ vấn đề đề xuất đề tài “Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh chủng vi khuẩn lao Việt Nam” nhằm chẩn đoán nhanh, xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm soát nâng cao hiệu chẩn đoán lao Đề tài có hai mục tiêu sau: Tạo kit multiplex PCR với gen đích IS6110, IS1081 23SrDNA chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện Việt Nam Đánh giá hiệu kit panel mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi lao Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO 1.1.1 Tình hình bệnh lao gới Lao bệnh truyền nhiễm mãn tính xuất từ lâu Hàng nghìn năm trôi qua, lây lan giết chết hàng triệu người, số người chết bệnh lao lớn AIDS sốt rét cộng lại Ngày nay, bệnh lao trở nên nghiêm trọng xuất chủng lao kháng đa thuốc, lao kháng thuốc phổ rộng lao đồng nhiễm HIV/AIDS Cùng với AIDS sốt rét, lao xếp vào ba bệnh truyền nhiễm nguy hiểm giới [2, 53] Do tính chất lây truyền qua tiếp xúc qua không khí bệnh cúm nên tốc độ lan truyền nhanh khả kiểm soát bệnh lao phức tạp Các kết thống kê lặp lại nhiều lần ước tính có khoảng 1/3 dân số giới (khoảng 2,2 tỷ người) bị lây nhiễm tiên phát với M tuberculosis 10% số phát triển thành bệnh thời điểm đời Mỗi năm có khoảng triệu bệnh nhân phát hiện, hàng năm giới có khoảng 49 triệu bệnh nhân lao lưu hành, số ngày gia tăng Bệnh lao giết chết 8000 người ngày, gần triệu người năm [73] Đáng báo động bệnh lao trở thành nguyên nhân hàng đầu giết hại nhiều thiếu niên người lớn, chủ yếu nhóm tuổi nguồn lao động xã hội (từ 20 tới 49 tuổi) [78] Số bệnh nhân lao nước phát triển chiếm 95% tổng số bệnh nhân lao toàn giới Khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn giới tập trung vào 22 quốc gia có gánh nặng bệnh tật cao Bệnh lao chiếm 25% nguyên nhân gây tử vong nước Tính riêng Ấn Độ, hàng năm có khoảng 500.000 người chết bệnh này, tương đương tỷ lệ phút lại có người quốc gia chết lao [63, 73] Năm 2007, WHO ước tính khu vực Đông Nam Á có số người nhiễm lao chiếm tới 34% toàn giới Còn cận Sahara châu Phi tỷ lệ cao gấp đôi so với Đông Nam Á, tỷ lệ nhiễm lao 343 ca 100.000 người dân Thông báo gần năm 2007 tổ chức y tế giới cho biết bệnh lao xác định bước đầu ổn định giảm vùng giới Tuy nhiên số lượng ca nhiễm toàn cầu tăng lên tập trung châu Phi, Đông Địa Trung Hải Đông Nam Á Tình hình cho thấy bệnh lao không giảm nguy hại loài người Hiện tỷ lệ điều trị lao thành công toàn cầu đạt 82%, nhiên nhiều bệnh nhân chưa phát không chữa trị, bệnh nhân tiếp tục lây cho cộng đồng Theo ước tính WHO tỷ lệ phát bệnh nhân đạt 37% tổng số người nhiễm lao [63] Sự gia tăng bệnh lao quy mô toàn cầu với mối liên quan với HIV xuất chủng kháng thuốc vấn nạn y tế cộng đồng Điều khiến cho bệnh lao trở nên khó khăn việc kiểm soát điều trị Đến năm 1993 WHO phải tuyên bố tình trạng khẩn cấp bệnh lao toàn cầu để kêu gọi quốc gia giới chung tay phòng chống lao [64] 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam Theo báo cáo vào năm 2006 chương trình chống lao quốc gia Việt Nam đứng thứ 12 số 22 quốc gia có số bệnh nhân lao cao giới Tại khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng hàng thứ sau Trung Quốc Philipine tổng số bệnh nhân lao lưu hành số bệnh nhân lao phát Bên cạnh gia tăng đáng lo ngại tình trạng lao kháng thuốc vấn đề cấp bách [2, 10, 53] Năm 1995, trước biến động xấu tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực bắt đầu phải đối mặt với thách thức bệnh lao kháng thuốc Lao/HIV, Nhà nước Bộ Y tế Việt nam định đưa Chương trình chống lao thành Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm Trong giai đoạn 1997 đến 2000, chương trình chống lao Quốc Gia phát 532.703 bệnh nhân lao thể, tỷ lệ phát ước tính đạt 82% số bệnh nhân Đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi với tỷ lệ khỏi 92% [2, 10, 53] Theo WHO Việt Nam nước có gánh nặng bệnh lao cao toàn cầu với khoảng 44% dân số nhiễm lao Tỷ lệ lao mắc thể 173/100.000 dân, tỷ lệ lao phổi AFB (+) 77/100.000 dân, tỷ lệ mắc thể 225/100.000 dân, tỷ lệ tử vong lao 26/100.000 dân, tỷ lệ đồng nhiễm lao/HIV bệnh nhân lao 5% [2], thực tế số liệu nhiễm lao cao số thống kê Vấn đề đồng nhiễm HIV lao không làm tăng số bệnh nhân lao mà làm giảm hiệu điều trị bệnh, tăng tỷ lệ tử vong Đó khó khăn, thách thức lớn công tác phòng chống lao quốc gia Đáng ngại tỷ lệ lao kháng thuốc Việt Nam ngày gia tăng, tỷ lệ lao kháng đa thuốc bệnh nhân lao 2,7% tỷ lệ lao kháng đa thuốc số bệnh nhân điều trị lại 19% Như vậy, ngày có gần 400 người mắc, có 178 người mắc lao phổi ho khạc vi khuẩn làm lây nhiễm cho cộng đồng 55 người chết bệnh lao Hiện nay, nguy nhiễm lao hàng năm nước ta ước tính 1,5% [2] Thực tế nay, tỷ lệ phát đạt khoảng 44% tỷ lệ chữa khỏi 81% [2] Những năm gần việc áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử PCR giới A.S Mustafa cộng (1999) kiểm tra độ đặc hiệu kit multiplex PCR panel với gen đích IS6110 IS1081[54] Đánh giá ngưỡng phát kit multiplex PCR panel 3.2.1.2 mẫu vi khuẩn lao Để kiểm tra đánh giá ngưỡng phát kit multiplex PCR tiến hành kiểm tra panel mẫu chuẩn bị sẵn Panel gồm 51 tube DNA pha loãng có nồng độ từ N1 (21,7 ng/µl) đến N51 (0,000273 ng/µl) bp 416 300 206 N1 10 20 30 40 46 47 48 49 50 51 M M: marker 100 bp N1-N51: Sản phẩm mPCR Hình 3.10: Kiểm tra ngưỡng phát kit multiplex PCR Dựa vào kết điện di thấy mẫu N1 đến N30 sản phẩm mPCR xuất band đặc hiệu cho gen đích IS1081, IS6110, 23S rDNA Từ mẫu N40 đến mẫu N50 band có giảm dần độ sắc nét, band đặc trưng cho gen 23S rDNA mờ khó quan sát Đến mẫu N51 không xuất band đặc hiệu Như với nồng độ DNA mẫu N50 đạt 0,000302 ng/µl, tương đương 30,2 fg/µl kit multiplex PCR khả nhận DNA M tuberculosis Vì nồng độ DNA 30,2 fg/µl coi ngưỡng phát kit multiplex PCR Theo tác giả Mishra A cộng (2005) nồng độ DNA 10fg tương ứng với tế bào vi khuẩn lao [52] Như kết tương đương với khoảng vi khuẩn lao có mẫu xét nghiệm Như với mức DNA ≥ 0,000302 ng/µl hay với mẫu bệnh phẩm có từ vi khuẩn lao kit multiplex PCR có khả phát Kết nghiên cứu tương tự kết số tác giả giới Tác giả Sjobring cộng cho thấy DNA tách chiết quy trình tách chiết tác giả từ số lượng 10 tế bào Mycobacteria phát kỹ thuật PCR [64] Như khả phát master mix tương đối cao, với khả phát vi khuẩn mẫu bệnh phẩm có 10 tế bào M tuberculosis Theo tác giả Lazraq cộng nghiên cứu đánh giá hiệu chẩn đoán phát M tuberculosis complex so với phương pháp soi trực tiếp nuôi cấy 102 mẫu đờm 41 mẫu bệnh phẩm phổi đạt độ nhậy 93,1% [46] Tác giả Andersen cộng (1993) kết hợp hai trình tự chèn IS6110 IS 986 để chẩn đoán phát M tuberculosis đạt giới hạn phát 0,05 pg đến 0,5pg DNA tinh vi khuẩn lao tương ứng với 10 đến 100 vi khuẩn [19] Ngoài kết kiểm tra ngưỡng phát trên, tiến hành gửi panel đặc hiệu panel ngưỡng phát mã hóa đến Viện Kiểm Định Quốc Gia Vắcxin Sinh Phẩm y tế Bộ y tế Việt Nam Để kiểm tra lần kết ngưỡng phát panel phiên tạo tiếp ba mẫu DNA N49 (0,000331ng/µl) thành N52 (0,000165ng/µl) , N50 (0,000302ng/µl) thành N53 (0,000151ng/µl), N51 (0,000273ng/µl) thành N54 (0,000137ng/µl) Như panel ngưỡng phát gồm có 54 mẫu Panel sử dụng để kiểm tra độ nhạy kit multiplex PCR Kết Viện Kiểm định sau kiểm tra tiến hành mở mã thu kết sau: Độ đặc hiệu: (50/50) x 100% = 100% Độ nhạy: (52/54) x 100% = 96% với ngưỡng phát (0,000165ng/µl), tương đương 16,5 fg/µl Dưới kết kiểm định Viện kiểm định quốc gia kit mPCR chẩn đoán lao sản xuất 3.2.2 Đánh giá hiệu chẩn đoán kit mPCR mẫu bệnh phẩm lâm sàng Sau kiểm tra độ nhạy độ đặc hiệu mPCR panel mẫu từ chủng vi khuẩn lao MTBC MOTT, tiến hành áp dụng mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi lao Tổng số gồm 100 mẫu bệnh phẩm thu thập Bệnh viện Quân y 103 Các mẫu bệnh phẩm tiến hành chẩn đoán độc lập phương pháp soi AFB, nuôi cấy BK multiplex PCR Bảng 3.13 Kết chẩn đoán phƣơng pháp bệnh phẩm lâm sàng Nuôi cấy BK AFB St Loại bệnh Số t phẩm lƣợng Multiplex PCR Âm tính Dƣơng tính Âm tính Dƣơng tính Âm tính Dƣơng tính Dịch màng phổi 14 12 8 Đờm 32 19 13 15 17 26 Dịch phế quản 51 42 43 39 12 Sinh thiết hạch 2 0 2 Sinh thiết phế quản 1 0 1 100 76 24 66 34 54 46 Tổng số Bảng 3.14: So sánh kết nuôi cấy, mPCR soi AFB Phƣơng pháp Nuôi cấy mPCR AFB + 34 46 24 - 66 54 76 Tổng 100 100 100 Kết So sánh kết phát lao phương pháp cho thấy kết phát mPCR cao nhất, đạt 46% Phương pháp nuôi cấy có tỷ lệ phát 34% Soi AFB phát 24% phương pháp phát vi khuẩn lao số lượng vi khuẩn lao ≥ 104 AFB/ml bệnh phẩm Bảng 3.15: So sánh độ phù hợp chẩn đoán phƣơng pháp multiplex PCR phƣơng pháp nuôi cấy Kết Nuôi cấy + m PCR Tổng số Tổng số - + 33 13 46 - 53 54 34 66 100 Chúng tính độ nhạy độ đặc hiệu chẩn đoán kit mPCR mẫu bệnh phẩm lâm sàng Việc sử dụng phần mềm Epi-Info 6.0 cho phép tính hệ số K nhằm đánh giá độ phù hợp chẩn đoán phương pháp mPCR với nuôi cấy, qua đánh giá khả áp dụng mPCR chẩn đoán lâm sàng Se = 33/ (33 + 1) x 100% = 97,05% Sp = 53/ (53 + 13) x 100% = 80,30% Hệ số K = 0,71 Như vậy, coi nuôi cấy tiêu chuẩn vàng độ nhậy kit MTB PCR đạt 97,05 %, độ đặc hiệu đạt 80,30% so với nuôi cấy Trên thực tế nhiều trường hợp có triệu chứng lao rõ nuôi cấy âm tính lượng vi khuẩn có bệnh phẩm, số bị ức chế trình xử lý bệnh phẩm, số khác trình nuôi cấy bị nhiễm tạp khuẩn, tạp nấm nên không phát vi khuẩn lao khiến cho độ nhạy nuôi cấy tuyệt đối, kết âm tính nuôi cấy không loại trừ khả nhiễm lao Vì chưa có phương pháp thật coi “chuẩn vàng” chẩn đoán lao Trong PCR với nguyên lý khuyếch đại gen có khả khuyếch đại hàng triệu lần đoạn gen đích có bệnh phẩm, không phụ thuộc vào việc vi khuẩn sống hay chết trình xử lý bệnh phẩm Như mặt lý thuyết PCR có độ nhậy cao so với nuôi cấy, nên có trường hợp nuôi cấy âm tính PCR cho kết qủa dương tính Vì lấy nuôi cấy làm tiêu chuẩn vàng tức công nhận kết âm tính nuôi cấy âm tính thật khiến cho độ đặc hiệu PCR giảm xuống Đây khó khăn đánh giá phương pháp chẩn đoán lâm sàng điều kiện chưa có phương pháp chuẩn Vì độ nhậy đặc hiệu trường hợp chưa phản ánh thực chất kit mPCR mà cần phải đánh giá panel mẫu so sánh thêm với kit chẩn đoán thương mại quan chuyên môn có thẩm quyền kiểm định (có chứng IVD dùng cho chẩn đoán) sử dụng rộng rãi 3.2.3 Kiểm tra độ ổn định kit multiplex PCR Để hoàn thiện kit multiplex PCR chẩn đoán vi khuẩn lao tiến hành kiểm tra độ ổn định kit điều kiện bảo quản – 200C Để lấy mẫu chuẩn so sánh kiểm tra chất lượng kit mPCR, tiến hành phản ứng multiplex PCR lần sau tạo master mix DNA template vừa tách chiết từ vi khuẩn lao Kết cho thấy chất lượng master mix DNA đảm bảo để sử dụng cho kiểm tra độ ổn định bp 10 M Sản 1-10: phẩm mPCR DNA chủng lao 416 300 206 M: Marker 100 bp Hình 3.11: Sản phẩm mPCR DNA chủng vi khuẩn lao sau tạo master mix Sau tạo 120 master mix chia thành 12 nhóm, nhóm gồm 10 master mix, đánh số thứ tự 12 nhóm thành 12 tháng tương ứng, bảo quản -200C, tháng lấy nhóm master mix để kiểm tra DNA template sử dụng 10 mẫu DNA chủng lao chia nhỏ mẫu thành 12 tubes, đánh số thứ tự từ tháng đến tháng 12, đem bảo quản - 200C để dùng trình kiểm tra độ ổn định để tránh tượng rã đông nhiều lần Các mẫu DNA lựa chọn đảm bảo dương tính chạy thử nghiệm cho band đặc hiệu cho gen đích IS1081, IS6110, 23S rDNA Chúng thực việc kiểm tra định kì hàng tháng Ở tháng 1, tháng tháng thứ nhận thấy chất lượng master mix không thay đổi so với lần kiểm tra bp 10 M 416 300 206 1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau tháng M: Marker 100 bp Hình 3.12 Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau tháng bảo quản -20oC Ở tháng thứ sản phẩm điện di master mix cho band đặc trưng cho gen đích rõ nét bp 416 300 206 10 M 1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau tháng M:Marker 100 bp Hình 3.13 Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau tháng bảo quản -20oC Ở tháng thứ 7, sản phẩm master mix sau điện di có giảm độ sắc nét so với kiểm tra tháng thư Tuy nhiên khác biệt không rõ ràng Từ mẫu số đến mẫu số 10 nhìn rõ ba band đặc trưng cho ba gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA Chúng kiểm tra chất lượng master mix tháng thứ thu kết sau điện di sau: 10 M bp 416 300 206 1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính ổn định sau tháng M: Marker 100 bp Hình 3.14 Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau tháng bảo quản -200C Như mẫu giảm độ sắc nét đồng từ mẫu số đến mẫu số 10 Tuy nhiên có khả quan sát band đặc hiệu cho ba gen đích IS6110, IS1081 23S rDNA Kiểm tra tiếp master mix tháng thứ thu kết hình sau: bp 10 M 1-10 : Sản phẩm mPCR kiểm tra tính 416 300 206 ổn định sau tháng M: Marker 100 bp Hình 3.16: Sản phẩm mPCR kiểm tra độ ổn định sau tháng bảo quản -20oC Dựa vào kết điện di nhận xét master mix bảo quản - 20oC sau tháng giảm hiệu chẩn đoán Các band đặc trưng IS6110, IS1081 quan sát thấy Band gen đích 23S rDNA mờ, khó quan sát KẾT LUẬN Tạo thành công kit multiplex PCR chẩn đoán vi khuẩn lao với gen đích IS1081, IS6110, 23S rDNA Hiệu kit multiplex PCR chẩn đoán vi khuẩn lao Độ nhạy, độ đặc hiệu ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR panel chủng vi khuẩn lao: - Độ nhạy kit mPCR: 100% - Độ đặc hiệu kit mPCR: 100% - Ngưỡng phát phản ứng m PCR: Nồng độ DNA = 30,2fg /µl Hiệu chẩn đoán áp dụng bệnh phẩm lâm sàng: - Độ nhạy kit mPCR chẩn đoán bệnh phẩm lâm sàng: 97,05% - Độ đặc hiệu kit mPCR chẩn đoán bệnh phẩm lâm sàng: 80,30% Độ ổn định kit mPCR điều kiện bảo quản – 20oC trì tháng KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu hiệu chẩn đoán lâm sàng độ ổn định kit với số mẫu lớn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sỹ Sinh học Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương trình chống lao quốc gia 2005 Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hoà (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Trần Thị Thanh Hoa, Hoa Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2005), Sử dụng kết hợp hai phương pháp hoá sinh PCR để xác định đa kháng thuốc M tuberculosis, Hội nghị khoa học toàn quốc công nghệ sinh học, Tháng 12/2005 Nguyễn Văn Hƣng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học Phan Thị Thu Hƣơng, Đỗ Quỳnh Nga, Vũ Tân Trào (2005), “Phát M tuberculosis môi trường bệnh viện lao sử dụng kỹ thuật PCR”, Hội nghị khoa học toàn quốc công nghệ sinh học Tháng 12/2005 10 Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phòng nghiên cứu Lao Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tử bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007 11 Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Giáo dục 12 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, NXB Giáo dục 13 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ cộng (2007), “Hoàn thiện qui trình PCR hai gen IS1081 23Sr ADN nâng cao hiệu chẩn đoán lao”, Tạp chí Y Dược Học Quân Sự , 32(2), p 31-37 14 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31 15 Quyền Đình Thi (2005), Công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật 16 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Quân Y 17 Phạm Hùng Vân (2007), ”Các qui trình kỹ thuật sinh học phân tử thường sử dụng chẩn đoán nghiên cứu y sinh học”, www.nk-biotek.com.vn Tiếng Anh 18 Alcaide F., M A Benitez, J M Escriba, R Martin (2000), “Evaluation of the BACTEC MGIT 969 and thi MB/BacT systems for recovery of Mycobacteria from clinical specimens and for species identification by DNA AccuProbe”, Journal Clinical Microbiology 38, 398-401 19 Andersen A.B., Thybo S., R Godfrey-Faussett, Stoker N.G (1993), “Polymerase Chain Reaction for Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum” Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis, 12 (12), 922-927 20 Ahuja G K., Mohan K K., Prasad K., Behari M (1994), “Diagnostic criteria for tuberculous meningitis and their validation”, Tuber Lung Dis 75, 149-152 21 Barouni A S., Saridakis H O., Vidotto M C (2004), “Detection of Mycobacterium in clinical samples by multiprimer polymerase chain reaction”, Brazilian Journal of Microbiology 35, 29-32 22 Bhattacharya B (2003), “Development of a new sensitive and efficient multiplex polymerase chain reaction (PCR) for identification and differentiation of defferent Mycobacteria species”, Tropical Medicine and International Health, (2), 150-157 23 Bonnie B Plikaytis, Jennifer L Marden, Jack T Crawford, Charles L Woodley, W Ray Butler, and Thomas M Shinnick (1994) “Multiplex PCR Assay Specific for the Multidrug-Resistant Strain W of Mycobacterium tuberculosis”, Journal of Clinical Microbiology, 32 (6), 1542-1546 24 Clarrridge JE III, Shawar RM, Shinnck TM, Plikaytis BB (1993), “Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory”, Journal Clinical Microbiology, 31, 2041-56 25 Cole S T (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature, 393, 537544 ... đề xuất đề tài Nghiên cứu tạo kit multiplex PCR chẩn đoán nhanh chủng vi khuẩn lao Vi t Nam nhằm chẩn đoán nhanh, xác vi khuẩn lao, góp phần kiểm soát nâng cao hiệu chẩn đoán lao Đề tài có hai... mục tiêu sau: Tạo kit multiplex PCR với gen đích IS6110, IS1081 23SrDNA chẩn đoán vi khuẩn lao phù hợp với điều kiện Vi t Nam Đánh giá hiệu kit panel mẫu bệnh phẩm lâm sàng nghi lao Chƣơng TỔNG... vi khuẩn lao khuyết IS6110 Do cần thiết kế loại primer để chẩn đoán lao Vi t Nam cách hiệu xác Theo số nghiên cứu gần cho biết, đoạn gen IS6110 có số gen đích khác IS1081 23SrDNA có mặt tất chủng