Đang tải... (xem toàn văn)
GII THIU LUN ÁN 1. TÍNH CP THIT CA LUN ÁN Viêm là một triệu chứng rất phổ biến, là kết quả của nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra. Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể, gây ra nhiều ảnh hưng xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của ngưi bệnh. Hiện nay, các thuốc chống viêm giảm đau đang sử dụng rất đa dạng và phong phú, gồm cả thuốc y học cổ truyền và các thuốc tân dược có nguồn gốc từ hóa học. Các thuốc tân dược thưng có tác dụng nhanh, hiệu quả nhưng thưng gây nhiều tác dụng không mong muốn, nhất là dùng lâu dài. Cây Chặc chìu (dây chiều) có tên khoa học là Tetracera scandens (L.) Merr., thuộc họ Sổ (Dilleniaceae), là cây phân bố rộng rãi Việt Nam. Theo y học dân gian Việt Nam, thân Chặc chìu được dùng nhiều làm thuốc chữa tê thấp, gân xương đau nhức, ứ huyết, phù thũng, đau bụng. Đến nay, đã có một số công trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của Chặc chìu như dọn gốc tự do, chống oxy hóa và hạ đưng huyết, nhưng vẫn chưa có một nghiên cứu khoa học nào về tác dụng chống viêm và giảm đau của cây Chặc chìu. Để đóng góp cơ s khoa học cho việc điều trị các bệnh viêm đau bằng thuốc có nguồn gốc dược liệu, nghiên cứu sinh đã thực hiện đề tài “Nghiên cu tác dng vƠ c ch chng viêm, gim đau trên thc nghim ca cây Chc chìu (Tetracera scandens (L.) Merr.)” với 2 mục tiêu chính.
GI I THI U LU N ÁN TÍNH C P THI T C A LU N ÁN Viêm triệu chứng phổ biến, kết nhiều bệnh, nhiều nguyên nhân gây Tuy nhiên, viêm nặng kéo dài dẫn đến rối loạn chức quan, phận thể, gây nhiều ảnh hư ng xấu, có nguy hiểm tới tính mạng ngư i bệnh Hiện nay, thuốc chống viêm giảm đau sử dụng đa dạng phong phú, gồm thuốc y học cổ truyền thuốc tân dược có nguồn gốc từ hóa học Các thuốc tân dược thư ng có tác dụng nhanh, hiệu thư ng gây nhiều tác dụng không mong muốn, dùng lâu dài Cây Chặc chìu (dây chiều) có tên khoa học Tetracera scandens (L.) Merr., thuộc họ Sổ (Dilleniaceae), phân bố rộng rãi Việt Nam Theo y học dân gian Việt Nam, thân Chặc chìu dùng nhiều làm thuốc chữa tê thấp, gân xương đau nhức, ứ huyết, phù thũng, đau bụng Đến nay, có số công trình nghiên cứu tác dụng sinh học Chặc chìu dọn gốc tự do, chống oxy hóa hạ đư ng huyết, chưa có nghiên cứu khoa học tác dụng chống viêm giảm đau Chặc chìu Để đóng góp s khoa học cho việc điều trị bệnh viêm đau thuốc có nguồn gốc dược liệu, nghiên cứu sinh thực đề tài “Nghiên c u tác d ng vƠ c ch ch ng viêm, gi m đau th c nghi m c a Ch c chìu (Tetracera scandens (L.) Merr.)” với mục tiêu M C TIÊU C A LU N ÁN Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau Chặc chìu thực nghiệm Tìm hiểu chế tác dụng chống viêm, giảm đau Chặc chìu NH NG ĐịNG GịP M I C A LU N ÁN Các kết nghiên cứu cho thấy dược liệu Chặc chìu đặc biệt phân đoạn EtOAc công bố có tác dụng chống viêm thực nghiệm Tác dụng chống viêm thể rõ rệt mô hình gây viêm cấp mạn tính Khi sử dụng ngày liên tục, Chặc chìu thể khả ức chế phù chân chuột gây b i carrageenan; ức chế lượng dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu hàm lượng protein dịch rỉ viêm chuột bị gây viêm carrageenan formaldehyd; ức chế u hạt thực nghiệm chuột gây viêm amiăng Do đó, hướng đến việc sử dụng dược liệu để phòng chống bệnh viêm đặc biệt viêm khớp sử dụng dân gian Luận án đánh giá tác dụng giảm đau Chặc chìu theo hướng tác dụng giảm đau ngoại vi, chủ yếu tác dụng chống viêm đem lại Đây lần có nghiên cứu khẳng định tác dụng chống viêm, giảm đau chặc chìu hướng dược lý thực nghiệm cách có hệ thống dựa chế bệnh sinh viêm đau, đưa chứng chứng minh cho công dụng chặc chìu dân gian Luận án khảo sát định hướng chế chống viêm Chặc chìu ức chế enzym có liên quan đến viêm XO, 5-LOX, COX-2, đồng th i ức chế hình thành NO, ức chế hoạt động COX-2 NF-B tế bào Ngoài ra, Chặc chìu có tác dụng hiệp đồng với chất chống viêm tuyến thượng thận chống viêm thông qua đáp ứng miễn dịch tế bào Đồng th i, thực nghiệm luận án góp phần hoàn chỉnh thêm nghiên cứu tác dụng chống viêm Chặc chìu động vật thực nghiệm, tác dụng dọn gốc tự tác dụng chống peroxy hoá lipid Luận án chứng minh hoạt chất có tác dụng chống viêm, giảm đau chống oxy hóa chặc chìu flavonoid, flavonoid thuộc nhóm flavon quercetin, kaempferol dẫn xuất Đây thành phần dược liệu chặc chìu, cho thấy flavonoid đóng vai trò quan trọng trình thể tác dụng chống viêm dược liệu Chặc chìu ụ NGHĨA C A LU N ÁN Đối tượng nghiên cứu (cây Chặc chìu) xác định giúp kết nghiên cứu hóa học, sinh học xác, tin cậy Luận án công trình nghiên cứu dược liệu Chặc chìu (Tetracera scandens) tiếp cận theo hướng dược lý thực nghiệm cách có hệ thống dựa chế bệnh sinh viêm đau Kết nghiên cứu có ý nghĩa khoa học thực tiễn, s cho nghiên cứu ứng dụng Chặc chìu y học dân gian, y học cổ truyền Luận án cung cấp thêm phương pháp tiếp cận khoa học tương đối đầy đủ, áp dụng nghiên cứu dược lý thực nghiệm, nghiên cứu in vitro tế bào dược liệu theo hướng điều trị bệnh viêm xương khớp, viêm gây sưng đau, bệnh gút chứng minh chế tác dụng dược liệu C U TRÚC LU N ÁN Luận án gồm chương, 12 bảng, 31 hình, phụ lục, 139 tài liệu tham khảo Luận án gồm 119 trang, gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (34 trang); Nguyên vật liệu, trang thiết bị phương pháp nghiên cứu (24 trang); Kết nghiên cứu (26 trang); Bàn luận (29 trang); Kết luận kiến nghị (4 trang) A N I DUNG C A LU N ÁN CH NG T NG QUAN 1.1 TH C V T H C Cây Chặc chìu có tên khoa học Tetracera scandens (L.) Merr., thuộc họ Sổ (Dilleniaceae) Cây có số tên khác dây chiều, tích diệp đằng, nha nhiêu đằng, u chạc chìu (Tày), chong co (Thái) Chặc chìu phân bố rộng rãi hầu vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Nam Á, Trung Quốc Việt Nam Chặc chìu phân bố phổ biến tất tỉnh thuộc vùng núi thấp (dưới 1000m) trung du 1.2 THÀNH PH N HÓA H C VÀ TÁC D NG SINH H C C A CH C CHÌU Một điều ngạc nhiên mọc phổ biến nước Đông nam Á, có nghiên cứu thành phần hóa học Chặc chìu (Tetracera scandens) Theo Đỗ Huy Bích cộng có ghi thành phần hóa học Chặc chìu gồm isorhamnetin, rhamnetin, azaleatin, rhamnocitrin không ghi rõ tài liệu tham khảo Dưới tổng hợp số nghiên cứu Chặc chìu Tác dụng chống đái tháo đường: dịch chiết MeOH cao Chặc chìu có tác dụng chống tăng đư ng huyết gây b i alloxan Các dẫn xuất genistein phân lập từ cao EtOAc Chặc chìu đánh giá có triển vọng hoạt động điều trị đái tháo đư ng typ 2, hợp chất thử nghiệm kích thích đáng kể hấp thu glucose, kích hoạt (AMPK) adenosin monophosphate, vận chuyển glucose protein-4 (GLUT-4) biểu ARNm GLUT-1 ức chế protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) ức chế L6 myotube Tác dụng chống oxy hóa: dịch chiết Chặc chìu có tác dụng chống oxy hóa mạnh Dịch chiết MeOH thân Chặc chìu có tác dụng loại bỏ gốc tự DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) tác dụng chống lại trình oxy hóa lipid (lipid peroxidation) mô hình in vitro Tác dụng ức chế ho t động xanthin oxidase: cao chiết MeOH - nước Chặc chìu (tỉnh Khánh hòa) thể tác dụng ức chế hoạt động xanthin oxidase (XO) mạnh với giá trị IC50 < 20µg/ml, nên thể tác dụng điều trị gút triệu chứng liên quan bệnh thấp khớp viêm khớp Gần đây, nhóm phân lập số chất có tác dụng ức chế enzym XO từ Chặc chìu Ngoài ra, dịch chiết Chặc chìu dùng điều trị sốt cảm cúm, điều trị rối loạn tiết niệu CH NG NGUYÊN V T LI U, TRANG THI T B VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 NGUYÊN V T LI U NGHIÊN C U 2.1.1 Đ ng v t thí nghi m Chuột cống trắng, hai giống đực cái, trọng lượng 120-150g Chuột cống trắng non, hai giống đực cái, trọng lượng 60-70g, Học viện Quân Y cung cấp Chuột nhắt trắng, đực cái, trọng lượng 18-20g, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp 2.1.2 Nguyên li u nghiên c u Cao chiết toàn phần methanol (MeOH), phân đoạn etylacetat (EtOAc), butanol (BuOH), cao nước (H2O), n-Hexan Chặc chìu Các chất gồm quercetin, quercitrin, afzelin, kaempferol đuợc phân lập từ phân đoạn EtOAc Chặc chìu 2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Ph ng pháp chi t xu t phân l p h p ch t Dược liệu chiết MeOH, phân đoạn dung môi có độ phân cực tăng dần Phân lập chất sắc ký cột HPLC 2.2.2 Nghiên c u tác d ng d c lý 2.2.2.1 Nghiên cứu tác dụng chống viêm gi m đau Đánh giá tác dụng chống viêm cao chiết MeOH phân đoạn Chặc chìu mô hình chống viêm thực nghiệm: gây phù chân chuột carrageenan, mô hình gây viêm màng bụng, mô hình u hạt amiăng Đánh giá tác dụng giảm đau cao chiết MeOH phân đoạn Chặc chìu mô hình mâm nóng, mô hình mâm nóng có sử dụng thêm tác nhân gây tăng nhận cảm đau mô hình gây tăng đau viêm (Randall Selitto test) 2.2.2.2 Sơ đánh giá chế tác dụng chống viêm Đánh giá tác dụng Chặc chìu mô hình cắt tuyến thượng thận, mô hình teo tuyến ức Đánh giá tác dụng ức chế số enzym có liên quan đến trình viêm, gồm xanthin oxidase, lipoxygenase cyclooxygenase (COX-1, COX-2) Đánh giá tác dụng Chặc chìu mô hình kích thích đại thực bào Raw 264.7 ức chế biểu NO, COX-2, NF-B Đánh giá tác dụng chống oxy hoá Chặc chìu mô hình dọn gốc tự DPPH, peroxy hoá lipid ức chế MDA gan chuột 2.3 Ph ng pháp x lý s li u Kết biểu diễn dạng giá trị trung bình ± SE (SE: sai số chuẩn) So sánh giá trị trung bình lô thử với lô chứng nghiệm pháp t-test student phần mềm Microsoft-Excel Sự khác biệt coi có ý nghĩa p < 0,05 Trong thí nghiệm in vitro, kết biểu diễn dạng giá trị trung bình ± SD từ lần làm thí nghiệm độc lập với CH NG K T QU NGHIÊN C U 3.1 K T QU TÁC D NG CH NG VIÊM C A CH C CHÌU 3.1.1 K t qu chi t cao toàn ph n vƠ phơn đo n Ch c chìu B TD Dựa mô C LI U (15kg) tả vào phuơng pháp chiết phương pháp nghiên + MeOH D ch MeOH cứu, kết chiết cao toàn phần phân đoạn Chặc Thu hồi MeOH thể Cao MeOH (1080g) chìu hình + Nước 3.1 D ch n c + n-Hexan D ch n-hexan D ch n c + EtOAc Thu hồi n-Hexan Cao n-hexan (105g) D ch EtOAc D ch n c + BuOH Thu hồi EtOAc Cao EtOAc (195g) D ch BuOH D ch n Cô Thu hồi BuOH Cao BuOH (414g) Hình 3.1 Kết qu chiết xuất dược liệu c Cao n c 3.1.2 K t qu tác d ng ch ng viêm c p th c nghi m 3.1.2.1 Kết tác dụng chống viêm cấp mô hình gây phù bàn chân chuột carrageenan Kết cho thấy cao MeOH liều 600mg/kg có tác dụng ức chế 28,99% độ phù chân chuột so với lô chứng th i điểm gi sau gây viêm (p < 0,05) Phân đoạn EtOAc liều 300mg/kg 600mg/kg có tác dụng ức chế phù chân chuột th i điểm gi sau gây viêm 27,43% (p < 0,05) 42,92% (p < 0,01) độ phù chân chuột so với lô chứng Như vây, phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế phù chân chuột mạnh so với cao MeOH Hình 3.2 nh hưởng Chặc chìu lên mức độ phù chân chuột (n = 8) Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg;Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg;Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05; ** p< 0,01 3.1.2.2 Kết tác dụng chống viêm mô hình gây viêm màng bụng Kết qu tác dụng chống viêm mô hình gây viêm màng bụng chuột cống Kết thu cho thấy cao MeOH liều 600mg/kg, cao EtOAc liều 300mg 600mg/kg làm giảm số lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm chuột cống rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05) Các mẫu Dic-5, MeOH 600, EtOAc 300, EtOAc 600 làm giảm lượng dịch rỉ viêm so với lô chứng 31,87; 24,94; 27,02; 30,25 (%); làm giảm hàm lượng protein so với lô chứng 10,12; 6,44; 6,13; 7,98 (%); làm giảm số lượng bạch cầu so với lô chứng 35,49; 25,71; 21,83; 28,84 %; đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Hình 3.3 Tỷ lệ gi m (%) lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein, số lượng b ch cầu so với chứng chuột cống Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; MeOH 300: Cao methanol: 300mg/kg; MeOH 600: Cao MeOH 600mg/kg; EtOAc 300: Cao ethylacetat 300mg/kg; EtOAc 600: Cao ethylacetat 600mg/kg; *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001 Tác dụng chống viêm mô hình gây viêm màng bụng chuột nhắt trắng Cao MeOH liều 600mg/kg, cao phân đoạn EtOAc liều 300mg 600mg/kg làm giảm số lượng dịch rỉ viêm, giảm hàm lượng protein số lượng bạch cầu dịch rỉ viêm chuột nhắt rõ rệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05) Hình 3.4 Tỷ lệ gi m (%) lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein, số lượng b ch cầu so với chứng chuột nhắt Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; MeOH 300: Cao methanol: 300mg/kg; MeOH 600: Cao meOH 600mg/kg; EtOAc 300: Cao ethylacetat 300mg/kg; EtOAc 600: Cao ethylacetat 600mg/kg; *: p< 0,05; **: p< 0,01; ***: p< 0,001 Các mẫu Dic 5, MeOH 600, EtOAc 300, EtOAc 600 làm giảm lượng dịch rỉ viêm so với lô chứng 39,74; 34,62; 25,52; 36,60 (%); làm giảm hàm lượng protein 35,14; 17,39; 15,63; 19,37 (%); làm giảm số lượng bạch 49,05; 25,57; 18,83; 34,47 (%); đạt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 3.1.3 K t qu tác d ng ch ng viêm m n chu t c ng Cao MeOH phân đoạn EtOAc liều 300mg; 600mg/kg có tác dụng giảm trọng lượng u hạt có ý nghĩ thống kê so với lô chứng, tỷ lệ giảm trọng lượng u hạt tương ứng 18,79%, 25,66%, 19,72% 30,49% Trọng lượng u hạt lô uống chất đối chiếu dương prednisolon liều 5mg/kg giảm 34,18% so với lô chứng Hình 3.5 nh hưởng Chặc chìu lên khối lượng u h t chuột cống (n = 8) Pred: prednisolon 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; ** p< 0,01, *** p < 0,001 M c đ phù chân chu t (%) 3.2 K T QU ĐÁNH GIÁ C CH CH NG VIÊM C A CH C CHÌU 3.2.1 K t qu đánh giá c ch ch ng viêm in vivo 3.2.1.1 Tác dụng chống viêm mô hình cắt tuyến thượng thận 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 Ch ng Me-600 Dic-5 Et-300 * Me-300 Et-600 * * giờ Hình 3.6 nh hưởng Chặc chìu lên độ phù chân chuột cắt tuyến thượng thận (n= 10) Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300mg/kg;Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg;Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; *: p< 0,05; **: p< 0,01 Kết cho thấy chuột uống cao MeOH phân đoạn EtOAc với liều 300 mg/kg 600 mg/kg có xu hướng ức chế độ phù chân chuột mô hình cắt tuyến thượng thận ý nghĩa thống kê Trong diclofenac liều 5mg/kg thể tác dụng ức chế phù chân chuột tốt từ gi kéo dài đến gi thứ 3.2.1.2 Tác dụng chống viêm thông qua hormon vỏ thượng thận Chuột uống cao MeOH liều 600mg/kg/ngày, phân đoạn EtOAc liều 300 mg/kg 600 mg/kg có tác dụng làm giảm khối lượng tuyến ức so với lô chứng 36,70%, 38,26%, 45,12% (p < 0,001) Chuột uống prednisolon 5mg/kg /ngày có khối lượng tuyến ức giảm tới 70,37% (p < 0,001) Hình 3.7 nh hưởng cao Chặc chìu trọng lượng tuyến ức (n = 8) Dic-5: diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg;Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; ***: p< 0,001 3.2.2 K t qu kh o sát c ch ch ng viêm m t s enzym 3.2.2.1 Tác dụng ức chế xanthin oxidase (XO), lipoxygenase (5-LOX) in vitro Kết cho thấy cao MeOH có tác dụng ức chế XO với giá trị IC50 21,39 g/ml, cao n-Hexan cao nước có tác dụng yếu coi tác dụng (IC50 > 100 g/ml), cao EtOAc BuOH cho tác dụng Tuy nhiên, phân đoạn BuOH (IC50 = 28,23 g/ml) cho tác dụng cao chiết MeOH, phân đoạn EtOAc (IC50 = 9,38 g/ml) có tác dụng mạnh cao chiết MeOH Trong số hợp chất phân lập từ dược liệu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 1,01 μg/ml, mạnh so với catechin (IC50 = 2,34 μg/ml) kaempferol (IC50 = 1,85 μg/ml), mạnh nhiều so với flavone glycosid quercitrin (IC50 = 11,25 μg/ml) afzelin ((IC50 >100 μg/ml) Kết thí nghiệm cho thấy cao MeOH có tác dụng ức chế 5-LOX (IC50 = 18,6 g/ml), mạnh cao phân đoạn dịch chiết Hx, H2O BuOH (đều có (IC50 > 30 g/ml), có tác dụng yếu cao phân đoạn EtOAc (IC50 = 9,3 g/ml); giống tác dụng ức chế XO, phân đoạn EtOAc có tác dụng mạnh cao chiết MeOH cao phân đoạn khác Hợp chất quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 1,66 μg/ml, mạnh 10 NF-B -actin Hình 3.10 nh hưởng Chặc chìu lên biểu NF-B Cột 1: Cont (chỉ có môi trường); Cột 2: Lipopolysaccharid (LPS); Cột 3: LPS + EtOAc 10 µg/ml; Cột 4: LPS + EtOAc 50 µg/ml; Cột 5: LPS + MeOH 10 µg/ml; Cột 6: LPS + MeOH 50 µg/ml; Cột 7: LPS + BuOH 10 µg/ml; Cột 8: LPS + BuOH 50 µg/ml 3.3 K T QU ĐÁNH GIÁ TÁC D NG GI M ĐAU 3.3.1 K t qu đánh giá tác d ng gi m đau trung ng Tác dụng gi m đau mô hình mâm nóng (ảot plate) B ng 3.4 Tác dụng gi m đau Chặc chìu lên mô hình mâm nóng Lô Thời gian ph n ng đau (giơy) n Tr c u ng thu c Sau u ng thu c Đối chứng 10 19,90 ± 2,27 20,10 ± 1,29 Morphin 10 20,30 ± 2,29 48,20 ± 9,27** Me-300 10 20,44 ± 2,43 20,60 ± 3,61 Me-600 10 20,70 ± 2,25 21,00 ± 1,58 Et-300 10 20,10 ± 2,15 20,70 ± 2,46 Et-600 10 21,30 ± 2,29 28,30 ± 6,05 Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; ** p < 0,01 Chuột uống cao MeOH phân đoạn EtOAc hai liều thử 300 mg/kg 600 mg/kg có th i gian phản ứng đau th i điểm sau uống thuốc gi khác ý nghĩa thống kê so với lô chứng Lô chuột dùng morphin liều 10mg/kg có tác dụng kéo dài th i gian phản ứng với nhiệt độ rõ rệt so với lô chứng 16 3.3.2 K t qu đánh giá tác d ng gi m đau ngo i vi 3.3.2.1 Tác dụng giảm đau mô hình mâm nóng sử dụng chất tăng nhận cảm đau Cao MeOH liều 300 mg/kg; 600 mg/kg phân đoạn EtOAc 300 mg/kg tác dụng giảm đau mô hình mâm nóng sử dụng chất tăng nhận cảm đau Tuy nhiên, chuột uống phân đoạn EtOAc liều 600 mg/kg tác dụng giảm đau thông qua việc rút ngắn th i gian phản ứng đau, tỷ lệ phần trăm ức chế phản ứng đau tương ứng 57,61% Tác dụng diclofenac liều 5mg/kg với phần trăm ức chế phản ứng đau 63,34% B ng 3.5 Tác dụng gi m đau Chặc chìu chuột có sử dụng chất tăng nhận c m đau Lô (n = 12) Thời gian ph n ng đau (giây) Thời gian % c rút ngắn ph n ng ch so v i lô ch ng Bình th ờng Sau đau (giơy) Đ i ch ng 22,45 ± 2,89 14,02 ± 1,06 8,43 ± 2,10 Dic-5 22,32 ± 2,90 19,24 ± 2,51 3,09 ± 1,25* 63,34 Me-300 22,96 ± 1,87 16,91 ± 1,12 6,05 ± 1,19 28,15 Me-600 22,85 ± 2,56 17,85 ± 1,50 5,00 ± 1,49 40,67 Et-300 22,46 ± 2,17 17,35 ± 1,45 5,11 ± 1,46 39,38 18,95 ± 2,01 * 57,61 Et-600 22,52 ± 2,35 3,57 ± 0,95 Dic-5: Diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg;Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05 3.3.2.2 Tác dụng giảm đau mô hình gây tăng đau viêm Chuột uống cao MeOH liều 600mg/kg có tăng ngưỡng phản ứng đau th i điểm gi sau uống thuốc có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 49,22% Chuột uống phân đoạn EtOAc liều 600mg/kg hay liều thấp 300mg/kg có tác dụng làm tăng ngưỡng phản ứng đau chuột sau uống thuốc gi , phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 59,30% 44,51% Diclofenac có tác dụng tốt thí nghiệm này, làm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 78,97% 17 Hình 3.11 nh hưởng Chặc chìu lên phần trăm đ o ngược ngưỡng ph n ứng đau chuột sau uống thuốc (n =8) Dic: diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05; ** p < 0,01 Hình 3.12 nh hưởng Chặc chìu lên ngưỡng ph n ứng đau chuột cống (n = 8) Dic: diclofenac 5mg/kg; Me-300: cao MeOH 300 mg/kg; Me-600: cao MeOH 600 mg/kg; Et-300: cao EtOAc 300 mg/kg; Et-600: cao EtOAc 600 mg/kg; * p < 0,05; ** p < 0,01 3.4 K T QU ĐÁNH GIÁ TÁC D NG CH NG OXY HOÁ 3.4.1 K t qu tác d ng d n g c t DPPH, ch ng peroxy hoá lipid c a Ch c Chìu Kết cho thấy phân đoạn dịch chiết, phân đoạn Hx nước 18 có tác dụng yếu, hai phân đoạn EtOAc BuOH cho tác dụng mạnh Tuy nhiên, phân đoạn BuOH cho tác dụng cao chiết MeOH, phân đoạn EtOAc có tác dụng mạnh cao chiết MeOH Trong số hợp chất chiết từ Chặc chìu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 SADPPH 1,26 g/ml Tác dụng quercetin mạnh catechin (giá trị IC50 2,17 g/ml) kaempferol (giá trị IC50 2,43 g/ml) Hai flavonoid glycosid cho tác dụng chống oxy hóa aglycon quercetin, kaempferol chất đối chiếu catechin Kết cho thấy phân đoạn dịch chiết, phân đoạn Hx nước có tác dụng yếu Hai phân đoạn EtOAc BuOH cho tác dụng mạnh Tuy nhiên, phân đoạn BuOH cho tác dụng cao chiết MeOH Phân đoạn EtOAc có tác dụng mạnh cao chiết MeOH Trong số hợp chất dược liệu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 LPIA 9,26 g/ml Tác dụng quercetin mạnh catechin (IC50 = 13,47 g/ml) kaempferol (giá trị IC50 = 18,48 g/ml) B ng 3.6 Tác dụng dọn gốc tự DPPH, chống peroxy hóa lipid Chặc Chìu M u th Tác d ng d n g c t DPPH (IC50, µg/ml) Ho t tính ch ng peroxy hoá lipid (IC50, µg/ml) Cao n-Hexan > 20 > 100 Cao MeOH 11,87 ± 0,41 37,90 ± 0,94 Cao EtOAc 9,29 ± 0,35 32,39 ± 0,83 Cao BuOH 17,10 ± 0,26 99,07 ± 4,09 Cao nước > 20 > 100 Quercetin 1,26 ± 0,08 9,26 ± 0,07 Quercitrin 5,24 ± 0,13 > 100 Afzelin > 20 > 100 2,43 ± 0,28 18,48 ± 2,98 2,17 ± 0,28 13,47 ± 5,09 Kaempferol a Catechin a: chất đối chứng dương 3.4.3 Tác d ng ch ng oxy hoá mô hình in vivo Từ kết sàng lọc chống oxy hóa in vitro, cao chiết MeOH phân đoạn EtOAc, BuOH cho tác dụng mạnh Các cao chiết phân đoạn 19 hơp chất quercetin tiếp tục thử mô hình in vivo chuột để đánh giá tác dụng chống oxy hóa Chặc chìu liều thử 200mg; 400mg 600mg/kg, phân đoạn EtOAc ức chế 9,66; 36,04; 48,55% tạo thành MDA gan chuột, giá trị của phân đoạn BuOH 12,74; 14,67; 23,47% Đối với cao chiết MeOH cho tác dụng ức chế hình thành MDA gan chuột 29,16; 40,21; 36,32 % có ý nghĩ thống kê so với nhóm đối chứng thử liều 600mg; 1000mg; 1500mg/kg liều 200mg 400mg/kg, cao MeOH tác dụng hay cho tác dụng kém, khó phát Như vậy, phân đoạn EtOAc có tác dụng chống oxy hóa mạnh mô hình in vivo liều 100 mg/kg, hợp chất Chặc chìu quercetin có tác dụng ức chế 29,28% hình thành MDA gan chuột, có ý nghĩa thống kê Còn liều 100 UI/kg, vitamin E ức chế 67,10% hình thành MDA gan chuột B ng 3.12 Kết qu tác dụng chống oxy hoá in vivo Tác d ng ch ng oxy hoá Li u Lô thí nghi m (mg/kg) N ng đ MDA (nmol/ml) HTCO (%) p Ch ng sinh lý (1) - 36,42 ± 2,33 - p1,2< 0,001 Ch ng b nh lý (2) - 58,93 ± 5,15 - 600 41,75 ± 6,03 29,16 p3,2< 0,05 1000 35,24 ± 2,40 40,21 p3,2< 0,001 1500 37,53 ± 3,62 36,32 p3,2< 0,01 200 53,24 ± 3,24 9,66 p4,2> 0,05 400 37,69 ± 2,90 36,04 p4,2< 0,01 600 30,32 ± 1,75 48,55 p4,2< 0,001 200 51,42 ± 5,61 12,74 p5,2> 0,05 400 50,29 ± 4,82 14,67 p5,2> 0,05 600 45,10 ± 4,02 23,47 p5,2< 0,05 100 41,68 ± 3,48 29,28 p6,2 < 0,05 100 UI/kg 19,39 ± 1,27 67,10 p7,2< 0,001 Cao MeOH (3) Cao EtOAc (4) Cao BuOH (5) Quercetin (6) a α-Tocopherol (7) a: chất đối chiếu dương 20 CH NG BÀN LU N 4.1 TÁC D NG CH NG VIÊM, GI M ĐAU C A CH C CHÌU 4.1.1 Tác d ng ch ng viêm 4.1.1.1 Tác dụng chống viêm cấp phù thực nghiệm carrageenan Cao chiết từ Chặc chìu dùng đư ng uống chuột cống trắng gồm cao MeOH có tác dụng liều cao 600 mg/kg (phù giảm 29,0%, p > 0,05); cao EtOAc liều 300 mg/kg mức độ phù giảm 27,4% (p > 0,05), liều 600 mg/kg (mức độ phù giảm 42,9%, p < 0,01) Tuy mức độ tác dụng có so với diclofenac mg/kg (phù giảm 64,6%, p < 0,01), chứng tỏ Chặc chìu có tác dụng chống viêm cấp chất có tác dụng chống viêm cấp nằm nhiều phân đoạn EtOAc Có thể suy luận rằng, cao MeOH có tác dụng chống viêm cao toàn phần, cao bao hàm phân đoạn EtOAc; tác dụng cao EtOAc có chứa nhiều thành phần khác có tác dụng chống viêm cao EtOAc 4.1.1.2 Tác dụng chống viêm mô hình gây viêm màng bụng Trong công trình này, đánh giá thêm thông số số lượng bạch cầu hàm lượng protein dịch rỉ viêm thông số dễ tiến hành có giá trị Trên mô hình dùng chuột cống trắng, lượng dịch rỉ viêm nhiều, nên th i gian lấy dịch rỉ viêm cần 24 gi sau gây viêm Kết cho thấy, lô đối chứng, thể tích dịch rỉ viêm 3,61 ml Lô cho chuột uống cao MeOH liều 300 mg/kg, thể tích dịch rỉ viêm 2,96 ml, giảm 18,0% (p > 0,05), liều 600 mg/kg 2,71 ml, giảm 24,9% (p < 0,05); cao EtOAc liều 300 mg/kg, thể tích dịch rỉ viêm 2,63 ml, giảm 27,0% (p < 0,05), liều 600 mg/kg, 2,52 ml, giảm 30,3% (p < 0,05); diclofenac liều mg/kg, thể tích dịch rỉ viêm 2,46 ml, giảm 31,9% (p < 0,05) Hàm lượng protein lô đối chứng 51,97% g/L Liều cao MeOH liều 300 mg/kg, hàm lượng protein 50,79 g/L, giảm 2,3% (p > 0,05); liều 600 mg/kg 48,62 g/L, giảm 6,4% (p < 0,05) Cao EtOAc liều 300 mg/kg, hàm lượng protein 48,78 g/L, giảm 6,1%, (p 0,05), 14,04 (giảm 25,7%, p < 0,05), 14,78 ( giảm 21,8%, p > 0,05), 13,45 (giảm 28,8%, p < 0,01) 12,19 (giảm 35,5%, p < 0,01) 21 Như vậy, cao MeOH liều 300 mg/kg có xu hướng làm giảm thông số nghiên cứu so với lô chứng, ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cao MeOH liều 600 mg/kg có tác dụng xấp xỉ cao EtOAc liều 300 mg/kg, liều 600 mg/kg Cao EtOAc liều 600 mg/kg có tác dụng mạnh nhất, xấp xỉ, so với diclofenac liều mg/kg Như thấy kết nghiên cứu mô hình dùng chuột nhắt trắng không khác nhiều so với mô hình dùng chuột cống trắng, so sánh tác dụng mẫu với Kết nghiên cứu mô hình rỉ dịch màng bụng chuột nhắt trắng chuột cống trắng có mức độ diễn biến viêm cấp tương tự, tác dụng mẫu thử từ Chặc chìu tương đồng so sánh với nghiên cứu mô hình viêm cấp chân chuột carrageenan Đây lần mô hình gây dịch rỉ màng bụng áp dụng chuột nhắt trắng để đánh giá tác dụng chống viêm mẫu thử (thuốc) đem lại gợi ý việc thay chuột cống trắng chuột nhắt trắng mô hình gây dịch rỉ màng bụng đáp ứng yêu cầu khoa học 4.1.1.3 Tác dụng mô hình gây viêm mạn tính amiăng Cao MeOH 300 mg/kg có làm giảm khối lượng u hạt ý nghĩa thống kê Các lô khác cho tỷ lệ ức chế u hạt từ 19,7% đến 30,5% so với lô chứng với p < 0,01 Riêng prednisolon liều mg/kg ức chế u hạt rõ rệt Điều lần khẳng định thuốc chống viêm steroid chất ức chế miễn dịch, có tác dụng chống tăng sinh, làm giảm tạo thành khối u hạt mạnh mô hình gây viêm mạn tính 4.1.2 Tác d ng gi m đau c a Ch c chìu 4.1.2.1 Tác dụng giảm đau trung ương mô hình mâm nóng Kết cho thấy: Lô chuột dùng morphin liều 10 mg/kg có tác dụng kéo dài th i gian phản ứng đau rõ rệt so với lô chứng; th i gian phản ứng đau chuột với lô sử dụng morphin cao hẳn so với lô lại Các lô chuột uống cao MeOH liều 300 mg/kg, 600 mg/kg; phân đoạn EtOAc liều 300 mg/kg, 600 mg/kg, có th i gian phản ứng đau th i điểm sau uống thuốc gi , khác ý nghĩa thống kê so với lô chứng Như vậy, cao MeOH EtOAc với mức liều 300 mg/kg 600 mg/kg tác dụng giảm đau theo chế trung ương 4.1.2.2 Tác dụng giảm đau ngoại vi mô hình mâm nóng có sử dụng tác nhân gây đau Trong mô hình này, kết cho thấy th i gian phản ứng đau chuột uống MeOH liều 300 mg/kg, 600 mg/kg phân đoạn EtOAc 300 mg/kg không khác 22 biệt so với chứng Tuy nhiên, chuột uống phân đoạn EtOAc liều 600 mg/kg có rút ngắn th i gian phản ứng thấp so với lô chứng, tỷ lệ phần trăm ức chế đau tương ứng 57,61% Chuột uống diclofenac liều mg/kg có tỷ lệ phần trăm ức chế đau 63,34% Kết chứng tỏ, cao EtOAc liều 600 mg/kg diclofenac liều mg/kg có khả giảm đau theo chế ngoại vi 4.1.2.3 Tác dụng giảm đau mô hình gây đau viêm Kết thể tác dụng Chặc chìu mô hình Randall Selitto để đánh giá tác dụng giảm đau mô viêm Chuột uống cao MeOH liều 300 mg/kg có ngưỡng phản ứng đau th i điểm gi sau uống thuốc có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau tăng không khác biệt so với lô chứng Tuy nhiên, chuột uống cao MeOH liều 600 mg/kg có tăng ngưỡng phản ứng đau th i điểm gi sau uống thuốc có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 49,22% Chuột uống phân đoạn EtOAc liều 300 mg/kg 600 mg/kg có tác dụng làm tăng ngưỡng phản ứng đau chuột sau uống thuốc gi , phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 44,51% 59,30% Như vậy, cao MeOH liều 600 mg/kg EtOAc liều 300 mg/kg, 600 mg/kg, thể tác dụng giảm đau mô viêm rõ rệt, hai thông số trực tiếp gián tiếp mô hình thay đổi có ý nghĩa thống kê so sánh với lô chứng 4.2 C CH TÁC D NG CH NG VIÊM C A CH C CHÌU 4.2.1 C ch ch ng viêm in vivo 4.2.1.1 Tác dụng chống viêm cấp chuột cắt bỏ tuyến thượng thận Theo kết thực nghiệm, tác dụng chống viêm Chặc chìu mô hình chuột bị cắt tuyến thượng thận, mô hình tuyến thượng thận tác dụng chống viêm rõ rệt Như vậy, Chặc chìu chứa thành phần có tác dụng hiệp đồng với chất chống viêm tuyến thượng thận Các nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập triterpenoid Chặc chìu thuộc nhóm lupan (acid betulinic), ursan (acid ursolic) nhóm olean (acid oleanolic), có sterol khác -sitosterol daucosterol Các chất tác dụng mạnh thuốc steroid, chất đem lại tác dụng hiệp đồng đáp ứng viêm 4.2.1.2 Tác dụng chống viêm thông qua hormon vỏ thượng thận Cao MeOH liều 300 mg/kg có xu hướng làm giảm khối lượng tuyến ức ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Cao MeOH liều 600 mg/kg cao EtOAc liều 300 600 mg/kg làm giảm khối lượng tuyến ức từ 36,7 đến 45,1% (p kaempferol > catechin > cao EtOAc > quercitrin > cao MeOH > cao BuOH > afzelin, cao n-hexan cao nước Điều cho thấy chất quercetin, kaempferol, quercitrin hoạt chất cho tác dụng ức chế XO Chặc chìu Điều dẫn đến tác dụng làm giảm nguyên nhân gây bệnh gút giúp giải thích cho việc chặc chìu dùng dân gian để chữa bệnh thống phong (bệnh gút) 4.2.2.2 Tác dụng chống viêm mô hình ức chế lipoxygenase Kết nghiên cứu cho thấy, cao n-hexan có tác dụng yếu (IC50 = 51,25 g/ml), đến cao nước (IC50 = 33,54 g/ml) cao BuOH (IC50 = 30,66 g/ml) Cao MeOH có tác dụng (IC50 = 18,60 g/ml), cao EtOAc (IC50 = 9,30 g/ml) có tác dụng mạnh, quercetin (IC50 = 1,66 g/ml) có tác dụng mạnh So sánh với chất dùng làm chứng dương, quercetin có tác dụng tương đương catechin (IC50 = 1,65 g/ml) hai chất có cấu trúc tương tự Cả hai chất có tác dụng ức chế 5-LOX tương tự với prednisolon (IC50 = 1,64 g/ml), thuốc điển hình loại thuốc chống viêm steroid Hai chất chứng dương thuộc loại thuốc chống viêm không steroid aspirin (IC50 = 2,60 g/ml) diclofenac (IC50 = 2,08 g/ml) có tác dụng ức chế 5-LOX quercetin Như chế chống viêm chất cao chiết từ Chặc chìu thông qua ức chế 5-LOX dẫn đến làm giảm leucotrien - chất trung gian hóa học trình viêm, leucotrien chất gây viêm quan trọng đặc biệt viêm có co thắt bệnh lý đư ng hô hấp hen, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính 4.2.2.3 Tác dụng chống viêm mô hình ức chế cyclooxygenase Nhìn chung, thứ tự tác dụng mẫu cao chiết cao phân đoạn nghiên cứu COX-1 COX-2 không khác nhiều, cao nước BuOH mẫu có tác dụng nhất, cao MeOH có tác dụng rõ rệt hơn, cao EtOAc có tác dụng ức chế mạn Điều phù hợp với kết thử tác 24 dụng ức chế enzym XO 5-LOX trình bày Kết cho thấy nhiều khả chất có tác dụng ức chế enzym nằm phân đoạn EtOAc, nghiên cứu thành phần hóa học chứng minh điều Các flavonoid thuộc nhóm flavon quercetin kaempferol phân lập từ phân đoạn EtOAc, hai hợp chất có hàm lượng cao Chặc chìu So sánh chất phân lập từ Chặc chìu quercetin với flavonoid catechin thuốc chống viêm không steroid diclofenac COX-1, thấy quercetin tác dụng hai chất Nhưng tác dụng COX-1 quercetin lại tương đương với hai chất này, gợi ý dùng quercetin cho tác dụng tốt ức chế “enzym giữ nhà” hơn, gây tác dụng không mong muốn hơn; COX-2 enzym thúc đẩy trình viêm quercetin lại có tác dụng ức chế mạnh hơn, tức ức chế viêm mạnh Kết chứng minh quercetin hoạt chất có tác dụng ức chế COX-1 COX-2 Chặc chìu Tuy tác dụng quercetin COX-2 mạnh so với chất đối chứng dương, tác dụng ức chế Chặc chìu quercetin lại tính chọn lọc cho tác dụng mạnh COX1 Từ kết thu mô hình thử tác dụng ức chế enxym in vitro, kết luận Chặc chìu có tác dụng chống viêm cấp thông qua việc ức chế enzym XO, 5-LOX, COX-2 4.2.3 Tác d ng ch ng viêm c a Ch c chìu mô hình t bào 4.2.3.1 Tác dụng ức chế tạo thành Nitric oxid (NO) Kết cho thấy, tế bào không ủ với LPS, hàm lượng NO sinh ít; có chất kích thích viêm cấp kháng nguyên LPS, hàm lượng NO tế bào đạt 10,8 M Cao EtOAc nồng độ 10 g/ml làm giảm hàm lượng NO 7,8 M Đặc biệt, nồng độ 50 g/ml hàm lượng NO xuống 1,7 M Cao MeOH nồng độ 10 g/ml cho hàm lượng NO 9,2 M; Nồng độ 50 g/ml cho hàm lượng NO 4,8 M Cao BuOH 10 g/ml gần ảnh hư ng đến hàm lượng NO nồng độ 50 g/ml hàm lượng NO mức 8,7 M, chứng tỏ cao BuOH có tác dụng ức chế sản sinh NO yếu Tóm lại, Chặc chìu có tác dụng ức chế sản sinh NO phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế tạo thành NO mạnh nhất, tức có tác dụng ức chế tế bào bị kích thích (viêm) gây b i LPS Điều chứng tỏ thành phần phân đoạn EtOAc đóng góp phần quan trọng, chí định đến tác dụng chống viêm cấp mẫu Chặc chìu 25 4.2.3.2 Tác dụng ức chế biểu COX-2 Trong thí nghiệm này, dùng kháng nguyên LPS (thành phần kháng nguyên vỏ vi khuẩn) làm tác nhân kích thích làm mẫn cảm đại thực bào chuột Raw 264.7 để đánh giá tác dụng chống viêm cấp Chặc chìu thông qua mức độ ức chế biểu COX-2 tế bào Kết cho thấy, dịch ly giải tế bào lô chứng (cột 1, tế bào nuôi cấy bình thư ng) gần không thấy có biểu COX-2 (không có vết), kích thích LPS (cột 2), biểu COX-2 rõ ràng (vết to đậm), tức nồng độ COX-2 tế bào tăng lên nhiều cột 3, có LPS thêm cao EtOAc 10 g/ml, vết COX2 thay đổi đáng kể Nồng độ EtOAc 50 g/ml (cột 4) vết COX-2 giảm hẳn độ lớn độ đậm, chứng tỏ nồng độ COX-2 tế bào giảm nhiều Điều có nghĩa cao EtOAc nồng độ có tác dụng ức chế hoạt hóa COX-2 rõ rệt, mẫu thử Chặc chìu điều kiện có viêm cấp LPS gây thể tác dụng chống viêm thông qua biểu COX-2 tế bào Raw 264.7 Trư ng hợp có LPS cao MeOH (cột 6) BuOH (cột 8) nồng độ 10 g/ml 50 g/ml, vết COX-2 thay đổi rõ rệt so với cột (lô chứng), chứng tỏ mẫu có tác dụng ức chế hoạt hóa COX-2 4.2.3.3 Tác dụng ức chế biểu NF-B Kết nghiên cứu cho thấy vết NF-B rõ nét, có nghĩa tế bào thư ng có yếu tố Lô có thêm LPS (cột 2), vết NF-B đậm hẳn cột 1, tức hàm lượng NF-B tăng lên tế bào bị kích thích (viêm) Các lô có LPS mẫu thử gồm cao EtOAc (cột 3), cao MeOH (cột 5) cao BuOH (cột 7) nồng độ 10 g/ml, vết NF-B có độ đậm không khác nhiều, có nghĩa nồng độ mẫu thử có tác dụng không rõ rệt Nồng độ 50 g/ml, lô thử cao EtOAc (cột 4) cao MeOH (cột 6) cho vết (sự biểu hiện) NF-B m nhất, chứng tỏ hai mẫu có tác dụng chống viêm Mẫu cao BuOH (cột 8) cho vết NF-B đậm so với cột cột không khác nhiều so với mẫu chứng Điều chứng tỏ tác dụng ức chế biểu NF-B cao BuOH so với hai cao 4.2.4 Tác dụng chống oxy hóa Chặc chìu 4.2.4.1 Tác dụng dọn gốc tự DPPH in vitro Kết cho thấy, phân đoạn dịch chiết Chặc chìu, phân đoạn cao n-hexan cao nước có tác dụng yếu (IC50 > 20 g/ml); phân đoạn cao 26 EtOAc (IC50 = 9,29 g/ml) phân đoạn cao BuOH (IC50 = 17,10 g/ml) có tác dụng mạnh; nhiên, phân đoạn cao BuOH cho tác dụng cao toàn phần chiết MeOH (IC50 = 11,87 g/ml); phân đoạn cao EtOAc có tác dụng mạnh cao MeOH Như vậy, cao BuOH cao EtOAc có thành phần có tác dụng đánh dọn gốc tự DPPH, thành phần cao EtOAc có tác dụng dọn gốc DPPH mạnh Cao MeOH có tác dụng mạnh rõ rệt cao BuOH cao MeOH cao toàn phần, có thành phần cao EtOAc Sắp xếp tác dụng cao theo thứ tự giảm dần cao EtOAc > cao MeOH > cao BuOH > cao nước cao n-hexan Trong số hợp chất chiết từ Chặc chìu đưa vào thử quercetin có tác dụng mạnh (IC50 = 1,26 g/ml), tiếp kaempferol (IC50 = 2,43 g/ml), đến quercitrin (IC50 = 5,24 g/ml), afzelin có tác dụng yếu (IC50 > 20 g/ml) Quercetin aglycon nên có tác dụng mạnh, quercitrin (flavonoid glycosid) quercetin-3-O--L-rhamnopyranoid tác dụng yếu nhiều Kaempferol aglycon nên có tác dụng khá, afzelin (flavonoid glycosid) kaempferol-3-O-rhamnozid tác dụng Như vậy, tác dụng dọn gốc tự DPPH chủ yếu aglycon có nhóm OH phenol, phần đư ng tác dụng mà ngược lại, làm giảm nhiều tác dụng glycon Catechin, chất sử dụng làm đối chứng dương (IC50 = 2,17 g/ml) có tác dụng dọn gốc tự DPPH mạnh, mạnh tất chất nghiên cứu, quercetin, chất phân lập từ Chặc chìu Từ kết nghiên cứu hoạt tính dọn gốc tự DPPH aglycon phân lập từ Chặc chìu quercetin, kaempferol chất dùng làm đối chứng dương catechin Sắp xếp theo thứ tự hoạt tính giảm dần: quercetin > catechin > kaempferol chứng tỏ vòng B (vòng catechol) có nhóm –OH (catechin quercetin) hoạt tính mạnh kaempferol chất có nhóm – OH vị trí 4’ Hai chất có nhóm –OH vị trí 3’ 4’ vòng B, quercetin có hoạt tính mạnh catechin, chứng tỏ liên kết đôi C2-C3 quercetin làm tăng hoạt tính Kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu tác giả khác trước 4.2.4.2 Tác dụng chống peroxy hóa lipid in vitro Kết cho thấy, phân đoạn dịch chiết Chặc chìu, phân đoạn cao n-hexan cao nước có tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào não yếu (IC50 > 100 g/ml); phân đoạn cao EtOAc (IC50 = 32,39 g/ml) phân 27 đoạn cao BuOH (IC50 = 99,07 g/ml) có tác dụng Phân đoạn cao BuOH cho tác dụng kém, cao toàn phần chiết MeOH (IC50 = 37,90 g/ml) có tác dụng tương đương phân đoạn cao EtOAc Sắp xếp tác dụng chống peroxy hoá lipid màng tế bào não chuột cao theo thứ tự giảm dần cao EtOAc > cao MeOH > cao BuOH > cao nước cao n-hexan Như vậy, thấy tác dụng cao toàn phần MeOH chủ yếu thành phần cao EtOAc Trong số hợp chất phân lập từ Chặc chìu đưa vào nghiên cứu quercetin có tác dụng mạnh (IC50 = 9,26 g/ml), tiếp kaempferol (IC50 = 18,48 g/ml) Các hợp chất flavonoid glycosid quercitrin afzelin không thấy biểu tác dụng (IC50 > 100 g/ml) Catechin, chất đối chứng dương (IC50 = 13,47 g/ml) có tác dụng chống peroxy hoá lipid rõ rệt Đặc biệt quercetin, chất phân lập từ Chặc chìu thể tác dụng chống peroxy hoá lipid rõ rệt, mạnh chất chứng dương catechin 4.2.4.3 Tác dụng peroxy hóa lipid in vivo CCl4 gan chuột nhắt trắng Kết cho thấy, cao MeOH liều 600, 1000 1500 mg/kg, hoạt tính chống peroxy hoá lipid gan chuột theo thứ tự 29,2% (p < 0,05), 40,2% (p < 0,001) 36,3% (p < 0,01); cao EtOAc liều 200, 400, 600 mg/kg, hoạt tính theo thứ tự 9,7% (p > 0,05), 36,0% (p < 0,01) 48,6% (p < 0,001); cao BuOH liều 200, 400 600 mg/kg, hoạt tính 12,7% (p > 0,05), 14,7% (p > 0,05) 23,5% (p < 0,05); quercetin liều 100 mg/kg cho hoạt tính chống peroxy hoá lipid 29,3% (p < 0,05); -tocopherol liều 100 IU/kg, chất đối chứng dương cho hoạt tính 67,1% (p < 0,001) liều 600 mg/kg, cao MeOH thể hoạt tính tương đương mạnh so với cao BuOH, so với cao EtOAc Như vậy, cao BuOH thể hoạt tính cao EtOAc mô hình in vivo in vitro chất có hoạt tính chống oxy hoá phân đoạn EtOAc thể tác dụng rõ rệt Điều flavonoid quercetin, quercitrin, kaempferol afzelin chủ yếu phân lập từ phân đoạn EtOAc K T LU N ĐÃ CH NG MINH Đ C TÁC D NG CH NG VIÊM, GI M ĐAU C A CH C CHÌU Cao MeOH liều 600 mg/kg có tác dụng giảm phù 29,0%, cao EtOAc liều 28 300 mg/kg có tác dụng giảm phù 27,4%, cao EtOAc liều 600 mg/kg có tác dụng giảm phù 42,9% mô hình gây phù chân chuột carrageenan Cao MeOH liều 600 mg/kg, cao EtOAc liều 300 mg/kg 600 mg/kg có tác dụng: làm giảm lượng dịch rỉ viêm 24,9%, 27,0%, 30,3%; có tác dụng làm giảm hàm lượng protein 6,4%, 6,1%, 8,0%; có tác dụng làm giảm số lượng bạch cầu là: 14,04%, 21,8%, 28,8% mô hình gây viêm màng bụng chuột cống trắng; làm giảm lượng dịch rỉ viêm, hàm lượng protein số lượng bạch cầu có ý nghĩa thống kê mô hình gây viêm màng bụng chuột nhắt trắng Cao MeOH liều 600 mg/kg làm giảm khối lượng u hạt 25,7%, cao EtOAc liều 300 mg/kg làm giảm khối lượng u hạt 19,7%, cao EtOAc liều 600 mg/kg làm giảm khối lượng u hạt 30,5%, mô hình gây u hạt thực nghiệm amiăng Cao EtOAc liều 600 mg/kg có th i gian rút ngắn phản ứng đau thấp so với chứng tỷ lệ phần trăm ức chế đau 57,61% Cao EtOAc liều 600 mg/kg có tác dụng giảm đau ngoại vi Cao MeOH EtOAc tác dụng giảm đau trung ương mô hình mâm nóng Cao MeOH liều 600 mg/kg làm tăng ngưỡng phản ứng đau th i điểm gi sau uống thuốc có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 49,22%; cao EtOAc liều 300 mg/kg 600 mg có tác dụng làm tăng ngưỡng phản ứng đau chuột sau uống thuốc gi phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng 44,51% 59,30%, mô hình giảm đau mô viêm KH O SÁT Đ C C CH C A TÁC D NG CH NG VIÊM, GI M ĐAU VÀ HO T CH T CÓ TÁC D NG C A CH C CHÌU Các cao MeOH, EtOAc, BuOH thể tác dụng: ức chế enzym xanthin oxidase (XO), flavonoid (quercetin kaempferol) phân lập từ Chặc chìu thể tác dụng ức chế xanthin oxidase mạnh (IC50 = 1,01 1,85g/ml); ức chế lipoxygenase (5-LOX); ức chế COX-1 COX-2 mô hình in vitro Hoạt chất quercetin thể tác dụng ức chế lipoxygenase mạnh (IC50 = 1,66 g/ml); ức chế COX-2 (IC50 = 2,22 g/ml), mạnh chất đối chứng dương catechin diclofenac Tuy nhiên, cao chiết quercetin ức chế COX-1 nên tác dụng ức chế chọn lọc COX-2 mô hình thử tế bào Raw 264.7 bị kích thích b i LPS, cao EtOAc liều 50 g/ml có tác dụng ức chế mạnh biểu 29 COX-2 yếu tố NF-B tế bào Cao chiết từ Chặc chìu thể tác dụng hiệp đồng với chất chống viêm tuyến thượng thận Chặc chìu thể tác dụng chống viêm thông qua đáp ứng miễn dịch tế bào mô hình làm thu teo tuyến ức Chặc chìu thể tác dụng giảm đau ngoại vi mô hình gây tăng đau viêm cấp, tức tác dụng giảm đau chủ yếu tác dụng chống viêm đem lại Chứng minh cao MeOH, EtOAc, BuOH có tác dụng dọn gốc tự (DPPH) Các hoạt chất có tác dụng flavonoid: quercetin, kaempferol, quercitrin Cao MeOH, EtOAc, BuOH thể hoạt tính chống peroxy hoá lipid màng tế bào não in vitro Các hoạt chất có tác dụng gồm quercetin kaempferol Trên mô hình in vivo, cao MeOH, EtOAc BuOH có hoạt tính chống peroxy hoá lipid gan chuột, hoạt chất quercetin Đ XU T Từ kết nghiên cứu thu đề tài cho thấy, phân đoạn Etylacetat Chặc chìu có tác dụng chống viêm, giảm đau thực nghiệm, chế tác dụng ban đầu xác định ức chế enzym, protein có liên quan đến viêm (COX-2, 5-LOX, XO, NF-B) Nguồn dược liệu Chặc chìu nước dồi dào, dễ thu hái Để khai thác sử dụng Chặc chìu có hiệu thực tiễn, đề tài xin đề xuất: Đánh giá mức độ an toàn động vật thực nghiệm: độc tính bán trư ng diễn cao MeOH phân đoạn etylacetat Nghiên cứu theo hướng phát triển thành thực phẩm chức sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh viêm xương khớp, bệnh gút, viêm gây sưng đau 30 [...]... có tác dụng ức chế COX-1 và COX-2 của Chặc chìu Tuy tác dụng của quercetin đối với COX-2 rất mạnh so với các chất đối chứng dương, nhưng tác dụng ức chế của cả Chặc chìu và quercetin lại không có tính chọn lọc khi cũng cho tác dụng mạnh trên cả COX1 Từ các kết quả thu được trên các mô hình thử tác dụng ức chế các enxym in vitro, có thể kết luận Chặc chìu có tác dụng chống viêm cấp thông qua việc ức chế. .. 4.2.2.3 Tác dụng chống viêm trên mô hình ức chế cyclooxygenase Nhìn chung, thứ tự tác dụng của các mẫu cao chiết và cao phân đoạn nghiên cứu trên COX-1 và COX-2 không khác nhau nhiều, các cao nước và BuOH vẫn là những mẫu có tác dụng kém nhất, cao MeOH có tác dụng rõ rệt hơn, cao EtOAc có tác dụng ức chế mạn Điều này cũng phù hợp với kết quả thử các tác 24 dụng ức chế các enzym XO và 5-LOX đã trình bày trên. .. vậy, các cao chiết từ Chặc chìu làm thu teo tuyến ức rõ rệt và 23 có thể là các thành phần triterpenoid và phytosterol trong Chặc chìu đã đóng góp vào tác dụng này 4.2.2 Tác dụng đánh giá cơ chế chống viêm in vitro (trên các enzym oxy hoá) 4.2.2.1 Tác dụng chống viêm trên mô hình ức chế xanthin oxidase Quercetin và kaempferol là những chất được chiết từ Chặc chìu có tác dụng ức chế XO mạnh hơn cả chất... vitro Các hoạt chất có tác dụng này gồm quercetin và kaempferol Trên mô hình in vivo, cao MeOH, EtOAc và BuOH có hoạt tính chống peroxy hoá lipid gan chuột, hoạt chất là quercetin Đ XU T Từ các kết quả nghiên cứu thu được trong đề tài này cho thấy, phân đoạn Etylacetat Chặc chìu có tác dụng chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm, cơ chế tác dụng ban đầu được xác định là do ức chế các enzym, protein... COX-1 nên không có tác dụng ức chế chọn lọc trên COX-2 mô hình thử trên tế bào Raw 264.7 bị kích thích b i LPS, cao EtOAc liều 50 g/ml có tác dụng ức chế mạnh sự biểu hiện 29 của COX-2 và yếu tố NF-B trong tế bào Cao chiết từ Chặc chìu thể hiện tác dụng hiệp đồng với các chất chống viêm của tuyến thượng thận Chặc chìu thể hiện tác dụng chống viêm thông qua đáp ứng miễn dịch tế bào trên mô hình làm... mg có tác dụng làm tăng ngưỡng phản ứng đau của chuột sau uống thuốc 3 gi và phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau so với lô chứng lần lượt là 44,51% và 59,30%, trên mô hình giảm đau trên mô viêm 2 KH O SÁT Đ C C CH C A TÁC D NG CH NG VIÊM, GI M ĐAU VÀ HO T CH T CÓ TÁC D NG C A CH C CHÌU Các cao MeOH, EtOAc, BuOH thể hiện tác dụng: ức chế enzym xanthin oxidase (XO), các flavonoid (quercetin và kaempferol)... mg/kg, 600 mg/kg, thể hiện tác dụng giảm đau trên mô viêm rõ rệt, cả hai thông số trực tiếp và gián tiếp của mô hình này đều thay đổi có ý nghĩa thống kê khi so sánh với lô chứng 4.2 C CH TÁC D NG CH NG VIÊM C A CH C CHÌU 4.2.1 C ch ch ng viêm in vivo 4.2.1.1 Tác dụng chống viêm cấp trên chuột cắt bỏ tuyến thượng thận Theo kết quả thực nghiệm, tác dụng chống viêm của Chặc chìu rất kém mô hình chuột... TÁC D NG CH NG VIÊM, GI M ĐAU C A CH C CHÌU 4.1.1 Tác d ng ch ng viêm 4.1.1.1 Tác dụng chống viêm cấp trên phù thực nghiệm bằng carrageenan Cao chiết từ cây Chặc chìu dùng đư ng uống trên chuột cống trắng gồm cao MeOH chỉ có tác dụng liều cao 600 mg/kg (phù giảm 29,0%, p > 0,05); cao EtOAc liều 300 mg/kg mức độ phù giảm 27,4% (p > 0,05), liều 600 mg/kg (mức độ phù giảm 42,9%, p < 0,01) Tuy mức độ tác. .. Hx và nước 18 có tác dụng rất yếu, còn hai phân đoạn EtOAc và BuOH đều cho tác dụng mạnh Tuy nhiên, phân đoạn BuOH cho tác dụng kém cao chiết MeOH, còn phân đoạn EtOAc thì có tác dụng mạnh hơn cao chiết MeOH Trong số các hợp chất chiết được từ Chặc chìu, quercetin cho tác dụng mạnh với giá trị IC50 của SADPPH là 1,26 g/ml Tác dụng của quercetin mạnh hơn của catechin (giá trị IC50 là 2,17 g/ml) và. .. mg/kg có khả năng giảm đau theo cơ chế ngoại vi 4.1.2.3 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau do viêm Kết quả thể hiện tác dụng của Chặc chìu trên mô hình Randall Selitto để đánh giá tác dụng giảm đau trên mô viêm Chuột uống cao MeOH liều 300 mg/kg có ngưỡng phản ứng đau tại th i điểm 3 gi sau uống thuốc và có phần trăm đảo ngược ngưỡng phản ứng đau tăng không khác biệt so với lô chứng Tuy nhiên, chuột .. .nghiên cứu khẳng định tác dụng chống viêm, giảm đau chặc chìu hướng dược lý thực nghiệm cách có hệ thống dựa chế bệnh sinh viêm đau, đưa chứng chứng minh cho công dụng chặc chìu dân... teo tuyến ức Chặc chìu thể tác dụng giảm đau ngoại vi mô hình gây tăng đau viêm cấp, tức tác dụng giảm đau chủ yếu tác dụng chống viêm đem lại Chứng minh cao MeOH, EtOAc, BuOH có tác dụng dọn gốc... tính chống peroxy hoá lipid gan chuột, hoạt chất quercetin Đ XU T Từ kết nghiên cứu thu đề tài cho thấy, phân đoạn Etylacetat Chặc chìu có tác dụng chống viêm, giảm đau thực nghiệm, chế tác dụng