Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội – 2010 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Lời cảm ơn! Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt, giúp đỡ thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y tập thể cán phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Sinh học thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh, trường Đại học KHTN hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin dành cho người thân gia đình bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, người thân yêu bên tôi, động viên góp ý cho suốt trình học tập hoàn thành khóa luận Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Văn Bắc Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pairs CNSH : C ng nghệ sinh học CTCLQG : Ch DNA : Acit deoxyribonucleic dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate EDR : Extensively drug resit nt Kh ng thuốc mở rộng) EMB : Ethambutol HRS : HRSE : Bốn lo i thuốc isoni zid rif mpicin streptomycin ethambutol INH : Isoniazid IPTG : Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb : Kilo base LB : Luria - Bertani MDR : Multidrugs resist nt Kh ng PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid PCR : Polymerase Chain Reaction RMP : Rifampicin RNA : Acid Ribonucleic RRDR : Rifampin resistance determining region Vùng ịnh kh ng ng tr nh chống l o quốc gi lo i thuốc isoni zid rif mpicin streptomycin thuốc rifampicin) Taq polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới V : Volume thể tích X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 ỆNH LAO 1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC 1.3 VI KHUẨN LAO 1.3.1 Cấu tạo 1.3.2 Cơ chế gây bệnh 1.3.3 Đặc điểm hệ gen 1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO 1.4.1 Kháng sinh điều trị lao 1.4.2 Nguyên nhân gây kháng thuốc 10 1.4.3 Rifampicin chế kháng 12 1.4.4 Isoniazid chế kháng 15 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC 16 1.5.1 Đặc điểm lâm sàng xét nghiệm cận lâm sàng 16 1.5.2 Xác định kiểu hình 18 1.5.3 Xác định kiểu gen 18 1.5.4 Kỹ thuật real-time PCR multiplex real-time PCR 19 Chƣơng – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.2 Vật liệu thiết bị dụng cụ nghiên cứu 23 2.1.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứu 24 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 25 2.2.2 PCR nhân đoạn gen đích 26 2.2.3 Tạo dòng gen 27 2.2.4 Multiplex real-time PCR 28 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 30 3.1.1 Kết nhân gen katG rpoB t DNA tách t vi khuẩn lao 30 3.1.2 Kết tách dòng gen 31 3.1.3 Kết phân tích trình tự gen katG 34 3.1.4 Kết phân tích trình tự gen rpoB 36 3.2 TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 41 3.2.1 Thiết kế primer probe cho phản ứng multiplex real-time PCR 41 3.2.2 Kết tối ƣu thành phần chu trình phản ứng multiplex real-time PCR phát đột biến liên quan kháng thuốc 44 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 69 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc MỞ ĐẦU ệnh l o vi khuẩn l o Mycobacterium tuberculosis kỷ n y Hiện n y tỷ lệ nhiễm l o ã ợc biết rõ từ ợc ớc tính 1/3 dân số giới khoảng triệu ng ời mắc l o h n triệu ng ời chết l o năm ệnh l o nên nghiêm trọng h n với xuất c c chủng l o kh ng ng trở thuốc Multi-Drugs Resistant - MDR tức thể l o với vi khuẩn kh ng h i lo i thuốc chống l o m nh isoni zid INH rif mpicin RMP Theo số liệu thống kê củ ch ng tr nh chống l o Quốc gi năm 2007 giới có khoảng 511.000 tr ờng hợp nhiễm l o kh ng thuốc ó có h n 130.000 tr ờng hợp tử vong Do khó khăn việc iều trị bệnh nhân m ng c c chủng l o kh ng thuốc phổ rộng kh ng mà việc ph t sớm c c chủng l o kh ng thuốc trở nên qu n trọng iều trị bệnh l o Hiện n y nhiều n i chẩn o n vi khuẩn l o kh ng thuốc dự vào ph ng ph p nu i cấy vi khuẩn làm kh ng sinh chủ yếu nhiên việc ứng dụng sinh học phân tử ng t o r ột ph ph t vi khuẩn l o kh ng thuốc C chế kh ng thuốc vi khuẩn l o qu tr nh tiến hó có nhiều ột biến xuất số gen chức tr ớc hết gen rpoB katG Thời gi n chẩn o n rút ngắn vài ngày với ộ nh y ộ ặc hiệu c o t o iều kiện cho kiểm so t bệnh l o dễ dàng h n C c nghiên cứu sinh học phân tử chẩn o n l o kh ng thuốc ã r lo i kh ng thuốc xuất c c ột biến gen t ng ứng chịu tr ch nhiệm Chính v việc x c ịnh c c tr ờng hợp nhiễm l o kh ng thuốc th ờng i kèm với chẩn o n ph t ột biến gen ối với c c chủng l o ph t ợc C c chủng vi khuẩn l o kh ng isoni zid có liên qu n tới ột biến t i codon 315 gen katG ối với c c chủng kh ng rif mpicin xuất ột biến vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm củ gen rpoB Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Xuất ph t từ lý chúng t i tiến hành ề tài: “Nghiên cứu phát vi khuẩn lao kháng đa thuốc kỹ thuật sinh học phân tử” Với mục tiêu nghiên cứu: phát nhanh chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định vị trí đột biến liên quan kháng thuốc gen katG rpoB phương pháp giải trình tự kỹ thuật multiplex real-time PCR Để t ợc mục tiêu củ ề tài chúng t i tiến hành số nội dung nghiên cứu nh s u: X c ịnh tr nh tự gen rpoB katG Phân tích ặc iểm phân tử củ c c chủng vi khuẩn l o kh ng thuốc phân lập t i Việt N m c sở tr nh tự nucleotide củ h i gen rpoB katG Tối u hó thành phần chu tr nh kit multiplex real-time PCR phát nh nh vi khuẩn l o kh ng thuốc Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Chƣơng – TỔNG QUAN 1.1 ỆNH LAO Lao (Tuberculosis) bệnh truyền nhiễm m n tính t nh tr ng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis th ờng gặp phổi nh ng ảnh h ởng ến hệ thần kinh trung kê x ng l o màng não hệ b ch huyết hệ tuần hoàn l o ng khớp ệnh l o gắn liền với ph t triển củ xã hội loài ng ời từ hàng ngàn năm n y giới ch b o kh ng quốc gi khu vực dân tộc kh ng có ng ời mắc chết v bệnh l o Trực khuẩn l o lần ầu tiên ợc b c sĩ Robert Koch ã ph t vào ngày 24/3/1882 Trong thời gi n Mỹ châu Âu ng ời th có ng ời chết v l o ph t củ Robert Koch b ớc ngoặt qu n trọng việc khống chế lo i trừ bệnh Tr ớc ây l o ợc xem bệnh truyền nhiễm nguy hiểm giới l u hành với tỷ lệ mắc bệnh kh c o ặc biệt c c n ớc thuộc châu Phi khu vực châu Á ó có Việt N m Việt N m ứng thứ 12 22 n ớc có số bệnh nhân l o c o toàn cầu Trong khu vực Tây Th i nh D ng Việt N m ứng thứ b s u Trung Quốc Philippines số bệnh nhân l o nh số bệnh nhân l o xuất năm Hiện n y nguy c nhiễm l o n ớc t năm phí N m 2% c c tỉnh phí ợc ớc tính 5% dân số c c tỉnh ắc 1% Trên thực tế số nguy c nhiễm l o hàng năm c o h n 5% nh c c số nêu lớn h n Điều ó tăng thêm khó khăn ối với c ng t c phòng chống l o kh ng c c năm tới mà thời gi n kh dài ến hàng chục năm ng y thiên niên kỷ [3, 35] 1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC ệnh l o ngày trở nên phức t p có ảnh h ởng nặng nề xuất thêm vi khuẩn l o kh ng thuốc t o nên d ng bệnh khó phòng chống C c chủng Luận văn thạc sĩ lao kháng thuốc Nguyễn Văn Bắc ợc chi làm h i thể ó l o kh ng thuốc Multi-drugs resistant - MDR l o kh ng thuốc phổ rộng Extensively drug resistant - XDR chủng vi khuẩn l o kh ng thuốc nguồn lây nhiễm mối e dọ cho sức khỏe củ cộng ồng Theo ớc tính củ Tổ chức Y tế giới WHO giới có khoảng 42 v n ng ời mắc l o kh ng nh D thuốc chiếm số l ợng lớn khu vực Tây Th i ng có 15 v n tr ờng hợp kế ến khu vực Đ ng N m Á s u ó khu vực Châu Phi Đ ng Âu Một số chủng l o vừ kh ng thuốc vừ kh ng thuốc phổ rộng coi lo i siêu kh ng thuốc [17] T nh h nh l o siêu kh ng thuốc ngày trở nên trầm trọng từ th ng 11/2004 ến 11/2005 WHO Trung tâm Kiểm so t ệnh Ho Kỳ ã phân tích 17.890 mẫu ờm gửi từ 40 quốc gi toàn giới thấy có 20% tr ờng hợp kh ng thuốc 2% tr ờng hợp kh ng thuốc phổ rộng Ở Việt N m theo nghiên cứu củ Ch ng tr nh Chống l o Quốc gi có 32,5% c c tr ờng hợp bệnh l o m ng vi khuẩn l o kh ng thuốc [1, 3] Vi khuẩn l o kh ng thuốc th ch thức lớn e dọ c ng phòng chống l o toàn cầu v c c thuốc chống l o có hiệu n y kh ng l i kh ng ng bị vi khuẩn l o thuốc [10] Thuốc chống l o có nhiều lo i t c dụng củ thuốc trực khuẩn l o kh ng giống nh u Hiện n y ng ời t chi thuốc chống l o thành h i lo i: c c thuốc chống l o chủ yếu gọi c c thuốc chống l o lo i thuốc chống l o hàng ầu c c thuốc chống l o thứ yếu gọi c c thuốc chống l o lo i h i thuốc chống l o hàng thứ h i Trong c c thuốc chống l o lo i thuốc có hiệu ộc tính th c c thuốc chống l o hàng thứ h i thuốc có t c dụng h n l i có ộc tính c o gi thành Ở New York chi phí iều trị bệnh nhân nh y với thuốc 2.000 USD ó iều trị bệnh nhân kh ng thuốc hết 250.000 USD Hiện n y số tử vong hàng năm l o giới lớn h n số tử vong HIV sốt rét c c bệnh nhiệt ới cộng l i Tổ chức Y tế Thế giới ã nhận ịnh bệnh l o n y ã qu y trở l i trở nên tồi tệ h n kh ng thuốc củ vi khuẩn l o [17] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc KẾT LUẬN Kết giải tr nh tự gen katG củ 82 chủng vi khuẩn l o kh ng thuốc ó 64 chủng kh ng isoni zid, 46 chủng kháng rifampicin cho thấy 65/82 (79,3%) mẫu xảy r ột biến gen katG ột biến xảy r iểm nhiều iểm o n gen qu n tâm 47/64 73 4% chủng kh ng INH xảy r ột biến t i codon 315 Đối với gen rpoB, 51/82 (62,2%) chủng kh ng thuốc cho thấy ột biến t i số vị trí riêng biệt vùng nóng 81 bp Trong tổng số 51 chủng kh ng thuốc xảy r ột biến t i vùng nóng 81 bp cho thấy ột biến xảy r số vị trí codon kh c nh u ó th ờng gặp t i vị trí codon 531 (37,5%) s u ó codon 526 (22,2%) C c mẫu nh y cảm với thuốc kh ng sinh chủng chuẩn quốc tế H37Rv ều kh ng ph t ột biến gen nghiên cứu Tối u hó thành c ng multiplex re l-time PCR ph t nh nh vi khuẩn l o kh ng thuốc Kết thử nghiệm phản ứng multiplex re l-time PCR phát ột biến liên qu n kh ng thuốc có ộ t ng ồng 100% so với ph pháp x c ịnh ột biến c ch giải tr nh tự gen 60 ng Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc KIẾN NGHỊ Cần nghiên cứu với số l ợng chủng vi khuẩn l o lớn h n ể x c h n tỷ lệ vị trí t nh gi ng qu n kh ng thuốc củ c c ột biến xảy r gen rpoB katG Thử nghiệm qui tr nh multiplex real-time PCR ph t ồng thời ột biến (katG315, rpoB526 rpoB531) ể ph t vi khuẩn l o kh ng thuốc isoni zid rif mpicin cho c c c sở kh c ể nâng c o hiệu chẩn o n l o n ớc 61 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh 2001 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao Luận n Tiến sĩ sinh học Nguyễn Đ nh ảng 1992 Vi sinh vật y học, Nhà xuất Học viện Quân y ộ Y tế Trung tâm phòng chống l o quốc gi 2006 Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia năm 2005, Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Thị Chính Tr ng Thị Hò 2005 Vi sinh vật y học, Nhà xuất Đ i học Quốc gi Hà Nội Hà Nội Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đ nh Quyến Ph m Văn Ty 2003 Vi sinh vật học, Nhà xuất Gi o dục Hà Nội Nguyễn Văn H ng 2001 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi Luận n Tiến sỹ Y học Trần Văn S ng 1999 Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị Nhà xuất Gi o dục Hà Nội Ph m Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh Ahm d S F res E Ar j G.F Chugh T.D Must f A.S 2002 ”Prev lence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isol tes from Dub i nd eirut” International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 6(10), pp 920-926 62 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 10 Ahm d S Mok dd s E 2009 “Recent dv nces in the diagnosis and treatment of multidrug-resist nt tuberculosis” Respir Med, 103(12), pp 1777-1790 11 Ambur, O.H., Davidsen, T., Frye, S.A., Balasingham, S.V., Lagesen, K., Rognes, T., Tønjum, T 2009 “Genome dyn mics in m jor b cteri l p thogens” FEMS Microbiol Rev, 33(3), pp 453-470 12 Ani A.E 2008 “Adv nces in the l bor tory di gnosis of Mycobacterium tuberculosis” Ann Afr Med, 7(2), pp 57-61 13 Argekar, A.P., Kunjir, S.S., Purandare, K.S (1996), “Simultaneous determination of rifampicin, isoniazid and pyrazinamid by high performance thin layer chromatography” J Pharm Biomed Anal., 14, pp 1645-1650 14 Asgh rz deh M K fil H.S 2007 ”Current trends in molecul r epidemiology studies of Mycobacterium tuberculosis”, Biotechnol Mol Biol Rev., 2(5), pp 108-115 15 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G 2008 ”Genotypic n lysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isol tes in southern Tukey” Jpn J Infect Dis., 61(4), pp 255-60 16 Bahrmand, A.R., Titov, L.P., Tasbiti, A.H., Yari, S., Graviss, E.A (2009), “Highlevel rifampin resistance correlates with multiple mutations in the rpoB gene of pulmon ry tuberculosis isol tes from the Afgh nist n border of Ir n” J Clin Microbiol., 47(9), pp 2744-2750 17 lg nesh T.S Alz ri P.M Cole S.T 2008 “Rising st nd rds for tuberculosis drug development” Trends Pharmacol Sci., 29(11), pp 576-581 18 Barry, C.E., Boshoff, H.I., Dartois, V., Dick, T., Ehrt, S., Flynn, J., Schnappinger, D Wilkinson R.J Young D 2009 63 “The spectrum of l tent tuberculosis: Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc rethinking the biology and intervention str tegies” Nat Rev Microbiol., 7(12), pp 845-855 19 orrell S G gneux S 2009 “Infectiousness reproductive fitness nd evolution of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis” Int J Tuberc Lung Dis., 13(12), pp 1456-1466 20 Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., D rst S.A 2001 ”Structur l mech nism for rif mpicin inhibition of b cteri RNA polymer se” J Cell 104, pp 901-912 21 Caws M., Duy, P.M., Tho, D.Q., Lan, N.T.N., Hoa, D.V., Farrar, J (2006), ”Mut tions prev lent mong rif mpicin nd isoni zid resist nt Mycobacterium tuberculosis isol tes from hospit l in Vietn m” J Clin Microbiol., 44, pp 2333-2337 22 Cavusoglu, C., Hilmioglu, S., Guneri, S., Bilgic, A 2002 ”Ch r cterization of rpoB mutations in rifampin – resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from Turkey by DNA sequencing nd line probe ss y” J Clin Microbiol 40, pp 4435-4438 23 Chan, E.D., Bai, X., Kartalija, M., Orme, I.M., Ordway, D.J (2010 “Host immune response to rapidly-growing mycobacteria, an emerging cause of chronic lung dise se” Am J Respir Cell Mol Biol., [Epub ahead of print] 24 Cooksey R Morlock G Glickm n S Cr wford J 1997 “Ev lu tion of line probe assay kit for characterization of rpoB mutations in refampin resistant Mycobacterium tuberculosis isol tes from New York city” J Clin Microbiol., 35(5), pp 1281-1283 64 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 25 Dale, J.W., Nor, R.M., Ramayah, S., Tang, T.H., Zainuddin, Z.F (1999), “Molecul r epidemiology of tuberculosis in M l ysi ” J Clin Microbiol., 37(5), pp 1265-1268 26 de Viedma, D.G., Infantes, S.M.D., Lasala, F., Chaves, F., Alcala, L., Bouza, E 2002 “New re l-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis” J Clin Microbiol., 40, pp 988-995 27 Espasa, M., González-Martín J., Alcaide, F., Aragón, L.M., Lonca, J., Manterola, J.M., Salvadó, M., Tudó, G., Orús, P., Coll, P 2005 clinical samples of multiple gene mutations “Direct detection in causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes” J Antimicrob Chemother., 55(6), pp 860-865 28 Espitia, C., Laclette, J.P., Mondragón-Palomino, M., Amador, A., Campuzano, J., Martens, A., Singh, M., Cicero, R., Zhang, Y., Moreno, C (1999 “The PEPGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding protein” Microbiology, 145, pp 3487-3495 29 H hn Y Shin S 2001 “Electrochemic l beh vior nd diffenrenti l pulse polarographic determination of rif mpicin in ph rm ceutic l prep r tions” Arch Pharma Res., 24(2), pp 100-104 30 Hillemann, D., Weizenegger, M., Kubica, T., Richter, E., Niemann, S 2005 “Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isol tes” J Clin Microbiol., 43(8), pp 3699-3703 31 Marín, M., García de Viedma D., Ruíz-Serrano, M.J., Bouza, E 2004 “R pid Direct Detection of Multiple Rifampin and Isoniazid Resistance Mutations in 65 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Mycobacterium tuberculosis in Respiratory Samples by Real-Time PCR” Antimicrob Agents Chemother., 48(11), pp 4293-4300 32 Matsiota- ern rd P Vrioni G nd M rinis E 1998 “Ch r cteriz tion of rpoB Mutations in Rifampin-Resistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates from Greece” J Clin Microbiol., 36, pp 20–23 33 Miotto, P., Piana, F., Penati, V., Canducci, F., Migliori, G.B., Daniela Maria Cirillo, D.M 2006 “Use genotype MTBDR assay for molecular detection of refampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical strains isol tes in It ly” J Clin Microbiol., 44, pp 2485-2491 34 Mokrousov, I., Otten, T., Vyshnevsky, B., Narvskaya, O 2003 “Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum sme rs” Antimicrob Agents Chemother, 47, pp 22312235 35 Musser J.M 1995 “Antimicrobi l gent resist nce in Mycob cteri : Molecul r Genetic Insights” Clinical Microbiology Review, 8(4), pp 496-514 36 Naga, S., Urvashi, B.S., Jyoti, A., Jitendra, N.P., Pradeep, S., Jyotish, C.S (2006), “Rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis by inhouse reverse line blot ss y” Diagn Microbio Infect Dis., 56(2), pp 133140 37 Noordhoek, G.T., Kaan, J.A., Mulder, S., Wilke, H., Kolk, A.H 1995 “Routine application of the polymerase chain reaction for detect of Mycobacterium tuberculosis in clin l s mples” J Clin Pathol., 48, pp 810-814 38 Palomino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V (2007), Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care www.tubercuosistextbook.com 66 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 39 Qian, L., Abe, C., Lin, T.P., Lin, T.P., Yu, M.C., Cho, S.N., Wang, S., Douglas, J.T 2002 “rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isol tes from E st Asi n countries” J Clin Microbiol., 40, pp 1091-1094 40 R m sw my S nd Musser J.M 1998 “Molecul r genetic b sis of nti- microbial agent resistance in Mycobacterium Tuberculosis” Tuber Lung Dis., 79(1), pp 3-29 41 R tt n A K li A Ahm d 1998 ”Multidrug - resistant Mycobacterium tuberculosis” Emerg Infect Dis., 4(2), pp 195-209 42 Sajduda, A., Brzostek, A., Poplawska, M., Augustynowicz-Kopee, E., Zwolska, Z., Niemann, S., Dziadek, J., Hillemann, D (2004), ”Molecul r Ch r creriz tion of Rifampin and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated in Pol nd” J Clin Micobiol, pp 2425-2431 43 Schecter, G.F., Scott, C., True, L., Raftery, A., Flood, J., Mase, S (2010), “Linezolid in the tre tment of multidrug-resist nt tuberculosis” J Clin Infect Dis 50(1), pp 49-55 44 Scholossberg, D (2006), Tuberculosis and nontuberculus Mycobacteria infections, Fifth edition McGraw-Hill, Medical Publishing Division 45 Shin, S.S., Naroditskaya, V., Sloutsky, A., Werner, B., Timperi, R., Bayona, J., Farmer, P.E., Becerra, M.C (2005 ”rpoB gene mutations in clinical isolates of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Northern Lim Peru” Microb Drug Resist, 11(1), pp 26-30 46 Shitrit D Vertenshtein T Shitrit A Shlomi D Kr mer M.R 2005 “The role of routine culture for tuberculosis during bronchoscopy in a nonendemic re : n lysis of 300 c ses nd review of the liter ture” Infect Control 33(10), pp 602-605 67 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 47 Telenti, A., Imboden, P., Marchesi, F., Lowrie, D., Cole, S., Colston, M.J., Matter, L., Schopfer, K., Bodmer, T 1993 ”Detection of rif mpicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis” Lancet 341, pp 647-650 48 W.H.O 2004 “Anti-tuberculosis drug resist nt in the world” WHO Report No 2, http://www.who.int/tb/piblication/who_htm_tb_2004_343/en/ 49 W.H.O., (2007 “Glob l tuberculosis control surveill nce pl nning fin ncing” WHO Report 2007 50 Wada, T., Maeda, S., Tamaru, A., Imai, S., Hase, A., Kobayashi, K 2004 “Du lProbe Assay for Rapid Detection of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis by Real-Time PCR” J Clin Microbiol, 42(11), pp 5277-5285 51 Woodford N Ellington M.J 2007 “The emergence of ntibiotic resist nce by mut tion” J Clin Microbiol Infect., 13(1), pp 5-18 52 Zh ng Y Yew W.W 2009 “Mech nisms of drug resist nce in Mycobacterium tuberculosis”, Tuberc Lung Dis., 13(11), pp 1320-1330 53 Zhu, X., Chang, S., Fang, K., Cui, S., Liu, J., Wu, Z., Yu, X., Gao, G.F., Yang, H., Zhu, B., W ng J 2009 “My ASE: d t b se for genome polymorphism nd gene function studies of Mycobacterium”, BMC Microbiol, pp 9: 40 68 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc PHỤ LỤC Phụ lục Các công trình khoa học có liên quan tới luận văn đ công bố Nghiêm Ngọc Minh Nguyễn Văn ắc Nguyễn Hữu C ờng Nguyễn Trung N m Chu Hoàng Hà Nguyễn Th i S n 2009 Chẩn o n c c chủng vi khuẩn l o kh ng rif mpicin ph ng ph p x c ịnh ột biến gen rpoB Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2): 251-256 Nguyễn Văn ắc Nguyễn Hữu C ờng Chu Hoàng Hà Lã Duy Anh Nguyễn Th i S n Nghiêm Ngọc Minh 2009 X c ịnh c c chủng vi khuẩn l o kh ng isoni zid ph ng ph p x c ịnh ột biến gen katG Hội nghị C ng nghệ sinh học toàn quốc 749-752 Nguyễn Văn ắc Cung Thị Ngọc M i Nghiêm Ngọc Minh 2010 Đặc iểm phân tử củ c c chủng vi khuẩn l o kh ng isoni zid phân lập t i miền N m – Việt N m Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A): 741-745 Nghiêm Ngọc Minh Nguyễn Văn ắc 2010 Vi khuẩn l o kh ng thuốc c c ph ng ph p ph t Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(2): 133-144 69 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Phụ lục Danh sách mẫu DNA tách t chủng vi khuẩn lao Học viện Quân Y cung cấp DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO - ỆNH VIỆN LAO- ỆNH PHỔI TRUNG ƯƠNG Các chủng kháng đơn thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ Mã chủng 10 11 12 13 14 15 ĐO1-02 ĐO2-02 ĐO3-02 ĐO4-02 ĐO5-02 ĐO6-02 ĐO7-02 ĐO8-02 ĐO9-02 ĐO10-02 ĐO11-02 ĐO12-02 ĐO13-02 ĐO14-02 ĐO15-02 H H H H H H H S S S S S S S S TB02-53 TB02-54 TB02-56 TB02-51 TB02-52 TB02-55 TB02-57 TB02-68 TB02-71 TB02-75 TB02-76 TB02-77 TB02-79 TB02-80 TB02-81 Các chủng kháng đa thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ ĐA1-02 ĐA2-02 ĐA3-02 ĐA4-02 ĐA5-02 ĐA6-02 ĐA7-02 ĐA8-02 ĐA9-02 HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS Mã chủng TB02-101 TB02-105 TB02-107 TB02-110 TB02-111 TB02-112 TB02-113 TB02-115 TB02-116 70 Nồng ộ DNA (ng/ul) 9,8 13,0 34,8 6,0 20,7 30,8 10,4 11,7 18,5 20,0 19,7 20,7 9,3 22,8 32,3 OD260/280 Nồng ộ DNA (ng/ul) 44,0 7,2 6,8 18,5 8,2 8,0 36,3 5,7 5,2 OD260/280 1,83 2,06 1,70 2,79 1,67 1,64 1,65 1,84 1,79 1,72 1,80 1,79 1,91 1,76 1,74 1,89 2,1 2,06 1,94 1,8 2,1 1,76 1,89 1,98 Luận văn thạc sĩ ĐA10-02 ĐA11-02 ĐA12-02 ĐA13-02 ĐA14-02 ĐA15-02 10 11 12 13 14 15 Nguyễn Văn Bắc HRS HRS HRS HRS HRSE HRSE TB02-117 TB02-118 TB02-122 TB02-124 TB02-130 TB02-133 6,9 14,0 7,2 10,1 9,8 6,8 1,91 1,85 1,80 1,92 2,06 1,77 DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO- ỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG HUẾ Các chủng kháng đơn thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ Mã chủng Nồng ộ OD260/280 DNA (ng/ul) ĐO1-05 S TB05-49 15.19 1.64 ĐO2-05 H TB05-79 16,9 1,84 ĐO3-05 S TB05-84 6,5 1,39 ĐO4-05 S TB05-109 39,5 1,71 ĐO5-05 S TB05-110 33,3 1,75 ĐO6-05 S TB05-116 41,5 1,74 ĐO7-05 H TB05-130 12.0 1.79 ĐO8-05 H TB05-214 20.1 1.91 ĐO9-05 S TB05-223 38.4 1.79 10 ĐO10-05 H TB05-231 84.2 1.69 11 ĐO11-05 S TB05-237 129.7 1.52 12 ĐO12-05 S TB05-243 53.2 1.75 13 ĐO13-05 H TB05-266 30.0 1.58 14 ĐO14-05 S TB05-278 22.0 2.14 15 ĐO15-05 S TB05-283 74.8 1.83 71 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Các chủng kháng đa thuốc STT Mã DNA KQ KSĐ 10 11 12 13 14 15 ĐA1-05 ĐA2-05 ĐA3-05 ĐA4-05 ĐA5-05 ĐA6-05 ĐA7-05 ĐA8-05 ĐA9-05 ĐA10-05 ĐA11-05 ĐA12-05 ĐA13-05 ĐA14-05 ĐA15-05 HS HS HRSE HRS HRS HS HRSE HRSE HRSE HS HS HRS HS HRSE HR Mã chủng TB05-1 TB05-77 TB05-97 TB05-108 TB05-117 TB05-138 TB05-146 TB05-147 TB05-172 TB05-199 TB05-213 TB05-220 TB05-221 TB05-225 TB05-254 Nồng ộ DNA (ng/ul) 46,3 5.21 3,6 49,2 24,3 28.93 110,4 77,6 10.86 7.75 18.7 28.9 73.3 26.4 28.2 OD260/280 1,55 2.02 1,37 1,69 1,60 1.41 1,59 1,59 1.52 2.11 1.59 2.01 2.00 2.06 1.68 DANH SÁCH MẪU DNA TÁCH TỪ CHỦNG VI KHUẨN LAO- ỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH Các chủng nhạy cảm với thuốc kháng sinh Stt Mã DNA N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 KQ Kháng sinh Mã chủng TB06-140 TB06-143 TB06-144 TB06-145 TB06-146 TB06-147 TB06-148 72 Nồng ộ DNA (ng/ul) 66.9 82.3 67.8 60.9 38.5 32.7 4.7 OD260/280 1.72 1.89 1.96 2.0 1.85 1.94 1.79 Luận văn thạc sĩ 10 Nguyễn Văn Bắc N8 N9 N10 Các chủng kháng đơn thuốc Stt Mã KQ Kháng DNA sinh 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ĐO1 ĐO2 ĐO3 ĐO4 ĐO5 ĐO6 ĐO7 ĐO8 ĐO9 ĐO10 ĐO11 ĐO12 ĐO13 ĐO14 ĐO15 S H S S H S R S H S H H S S S Các chủng kháng đa thuốc Stt Mã KQ Kháng DNA sinh 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 ĐA1 ĐA2 ĐA3 ĐA4 ĐA5 ĐA6 ĐA7 ĐA8 ĐA9 ĐA10 ĐA11 HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSR TB06-149 TB06-150 TB06-151 19.1 57.8 62.0 1.96 1.86 1.98 Mã chủng Nồng ộ DNA (ng/ul) 52.8 50.6 10.8 3.6 13.0 304 4.5 6.1 8.2 120.6 6.7 57.4 31.4 3.5 66.5 OD260/280 Nồng ộ DNA (ng/ul) 13.4 8.9 4.9 5.0 12.0 3.8 3.4 4.5 10.3 72.9 7.7 OD260/280 TB06-105 TB06-107 TB06-113 TB06-115 TB06-121 TB06-128 TB06-133 TB06-134 TB06-141 TB06-142 TB06-157 TB06-161 TB06-162 TB06-164 TB06-165 Mã chủng TB06-22 TB06-23 TB06-26 TB06-27 TB06-28 TB06-31 TB06-33 TB06-35 TB06-36 TB06-37 TB06-38 73 1.74 1.59 1.76 2.25 1.68 1.85 2.89 2.36 2.2 1.91 2.01 1.85 1.90 1.46 1.91 1.89 1.82 1.86 1.8 1.8 2.08 1.56 1.75 1.99 1.77 1.98 Luận văn thạc sĩ 37 38 39 40 ĐA12 ĐA13 ĐA14 ĐA15 Nguyễn Văn Bắc HSRE HSRE HSRE HSRE TB06-39 TB06-41 TB06-51 TB06-82 Các chủng siêu kháng thuốc Stt Mã KQ Kh ng sinh DNA Kháng dòng Kháng dòng 8.0 36.8 43.9 5.5 1.9 1.73 1.74 1.91 Mã chủng Nồng ộ DNA (ng/ul) OD260/280 41 42 43 S1 S2 S3 HSRE HSRE HSRE 44 S4 HSRE Ofx,Eto TB06-30 103.2 1.85 45 S5 HSRE Ofx, Th TB06-32 12.9 1.52 46 S6 HSRE TB06-34 14.0 1.83 47 48 S7 S8 HSRE HSRE TB06-40 TB06-204 26.7 18.9 1.57 1.83 49 S9 HSRE TB06-205 19.7 1.92 50 S10 HSRE TB06-217 4.7 2.12 51 S11 HSRE TB06-218 4.8 2.88 52 S12 HSRE TB06-219 19.3 2.07 53 S13 HSRE TB06-221 17.3 1.84 54 S14 HSRE TB06-222 28.2 1.85 55 S15 HSRE Ofx,Eto,Km, PAS Ofx Ofx,Cs,Eto, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, PAS Ofx,Cs,Km, PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Th,Cs,K m,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS TB06-223 14.4 2.07 PAS Ofx Cs TB06-24 TB06-25 TB06-29 88.1 14.1 3.8 1.83 1.95 1.75 74 [...]... vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium tr ớc hết là củ vi khuẩn l o M tuberculosis và vi khuẩn phong (M leprae) có tầm qu n trọng ặc biệt trong nghiên cứu ặc iểm sinh học phân tử hỗ trợ dịch tễ học di truyền học và nghiên cứu kh ng thuốc số liệu ã t i một số trung tâm và có thể sử dụng một số ch ợc l u giữ ng tr nh ể truy cập kh m ph và sử dụng [11, 53] 1.4 CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO 1.4.1 Kháng sinh. .. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu C c chủng vi khuẩn l o nh y cảm với thuốc kháng sinh kh ng kh ng một lo i thuốc INH hoặc RIF kh ng n thuốc thuốc kh ng ít nhất h i lo i thuốc dòng thứ nhất là INH và RIF và siêu kh ng thuốc kh ng tất cả c c thuốc chống l o hiện t i ợc thu thập từ c c vùng miền kh c nh u nh TP Hồ Chí Minh ệnh vi n Trung ng C c chủng l o ệnh vi n Ph... trung nghiên cứu c chế kh ng thuốc tức là tr ờng hợp vi khuẩn l o kh ng ồng thời h i thuốc chống l o m nh nhất hiện n y là isoniazid và rifampicin các ột biến trên gen rpoB với katG 11 iều ó ồng nghĩ với vi c nghiên cứu Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Hình 1.4 Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis) 1.4.3 Rifampicin và cơ chế kháng Rifampicin tên kho học. .. khi c c chủng vi khuẩn l o kh ng ồng thời h i thuốc chống l o m nh nhất hiện n y là isoni zid và rif mpicin 2 C c chủng l o kh ng thuốc phổ rộng XDR – T kh ng : Là tr ờng hợp khi vi khuẩn l o ã ở t nh tr ng thuốc và có thêm tính kh ng một trong b lo i thuốc chống l o là capreomycin, kanamycin, amikacin [49] Ngày n y khi nghiên cứu về sinh học phân tử ng ời t kh ng l i nhiều lo i kh ng sinh có liên qu... thuốc b o gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính: - Thuốc hoặc c c gen ích bị làm biến ổi trong c c chủng kh ng thuốc do ó c c thuốc kh ng còn t c dụng nữ trong vi c tiêu diệt vi khuẩn - Sản phẩm củ gen mà ho t tính củ nó bị ức chế bởi thuốc ợc vi khuẩn sản xuất thừ r do ó l ợng thuốc mà bệnh nhân uống vào kh ng ủ ể ức chế hoàn toàn vi khuẩn l o - Những th y ổi xảy r ở mức ộ phân tử và c chế xâm nhập củ thuốc. .. nhập củ thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng ộ thuốc bên trong tế bào kh ng t tới nồng ộ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh Hiện t ợng kh ng thuốc củ vi khuẩn l o có thể xảy r tr ớc khi xâm nhập tiên ph t hoặc s u khi nhập vào c thể ng ời bệnh thứ ph t Vi khuẩn l o kh ng thuốc tiên ph t là hiện t ợng lây nhiễm bởi một chủng ã kh ng thuốc mà vi khuẩn này ã có sự ề kh ng tự nhiên... lây nhiễm này ng y từ ầu vi khuẩn l o xâm nhập vào c thể ã có sự ề kh ng với thuốc kh ng thuốc thứ ph t xảy r ng sử dụng Còn hiện t ợng ối với c c chủng vi khuẩn l o ở bệnh nhân nào ó dùng 10 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc thuốc chống l o kh ng úng quy ịnh kh ng úng liều l ợng thời gi n sử dụng thuốc do ó ã chọn lọc vi khuẩn l o kh ng thuốc [1, 38] C c chủng vi l o kh ng thuốc thuốc MDR – T ợc chi làm... tổng hợp từ rif mpicin một kh ng sinh ợc chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có ho t tính diệt khuẩn m nh tiệt khuẩn thuốc diệt vi khuẩn l o trong và ngoài tế bào Rif mpicin kh ng có hiện t ợng kh ng thuốc chéo với c c lo i thuốc chữ l o kh c Nồng ộ ức chế tối thiểu minimum inhibitory concentration - MIC ối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in vitro Đây là thuốc ức chế RNA polymer se m... protein C c thuốc rif mpicin và eth mbutol có t c dụng ức chế sự tổng hợp nucleic cid Thuốc p r minos licylic cid có t c dụng chống chuyển hó [7, 35, 37, 38] 1.4.2 Nguyên nhân gây kháng thuốc Vi khuẩn l o kh ng thuốc là khi chúng kh ng chịu sự t c ộng củ c c lo i kh ng sinh dùng iều trị chúng Th ờng nói tới vi khuẩn l o kh ng thuốc là nói tới những tr ờng hợp vi khuẩn l o kh ng với một trong những thuốc. .. vi khuẩn nh y với thuốc Khuẩn l c củ vi khuẩn kh ng thuốc có thể kh ng iển h nh khi nu i cấy mọc cằn cỗi [7] + Về số l ợng vi khuẩn khi soi kính và nu i cấy: những bệnh nhân kh ng thuốc thứ ph t có số l ợng vi khuẩn khi soi kính c o h n nhiều so với bệnh nhân th ng th ờng Kh ng có sự kh c nh u nhiều giữ bệnh nhân kh ng thuốc tiên ph t và bệnh nhân th ng th ờng Khi nu i cấy trên m i tr ờng ặc số khuẩn ... Nghiên cứu phát vi khuẩn lao kháng đa thuốc kỹ thuật sinh học phân tử Với mục tiêu nghiên cứu: phát nhanh chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định vị trí đột biến liên quan kháng thuốc. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh học thực... o Hiện n y nhiều n i chẩn o n vi khuẩn l o kh ng thuốc dự vào ph ng ph p nu i cấy vi khuẩn làm kh ng sinh chủ yếu nhiên vi c ứng dụng sinh học phân tử ng t o r ột ph ph t vi khuẩn l o kh ng thuốc