Cán HDKH: TS Đào Xuân tân Học viên: Đào thÞ ngäc anh K11- Sinh häc thùc nghiƯm 1.1 Cấu trúc phân tử insulin Insulin hoocmon protein tế bào tuyến tụy sinh Phân tử protein insulin có khối lượng khoảng 6000da Cấu tạo hai chuỗi polypeptit A B Các chuỗi A B liên kết với hai cầu nói đisulfua Hầu hết lồi chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa  Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin 1.2 Vai trò sinh học insulin Insulin hoocmon điều hoà nồng độ glucoz máu 1.2.1 Insulin trao đổi hydratcacbon -Insulin tuần hoàn máu, gắn với thụ thể màng tế bào tạo phức hợp thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền thơng tin chuyển glucoz khỏi huyết tương Hình 2:Insulin gắn với thụ thể màng tế bào tuần hoàn máu - Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz dạng glycogen Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym hexokinase nhờ glucoz bị bẫy vào tế bào - Insulin ức chế hoạt động glucoz - photphatase Khi khơng có mặt insulin, q trình tổng hợp glycogen bị dừng lại enzym phân huỷ glycogen hoạt động Insulin ngăn cản lượng đường cao máu nên khơng có q nhiều insulin, enzym insulinase kiểm sốt mức độ insulin Khi lượng insulin cao enzym insulinase phân huỷ hoocmon với thời gian phút Quá trình đảm bảo cho hàm lượng insulin ổn định máu lượng glucoz khơng bị giảm xuống mức nguy hiểm Hình 3: insulin điều hoà glucoz máu   1.2.2 Insulin trao đổi lipit a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp axit béo gan Khi lượng glycogen gan cao (> 5% lượng thô gan) trình tổng hợp bị ức chế Lượng glucoz hấp thụ vào tế bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo chuyển khỏi gan dạng lipoprotein Các lipoprotein vào vịng tuần hồn, cung cấp axit béo tự cho mô khác mô mỡ để tổng hợp triglyxerit b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo mô mỡ: cách ức chế trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol axit béo tự Enzym nhạy cảm với hoocmon trở nên hoạt động photphoryl hoá Insulin làm ngăn cản kết hợp với thụ thể màng tế bào Do làm tăng tích tụ triglyxerit tế bào mô mỡ 1.2.3 Những tác động khác insulin   - Insulin làm tăng tính hấp thụ axitamin - Insulin làm tăng tính thấm ion kali, magie photphat vô tạo điều kiện cho q trình photphoryl hố sử dụng glucoz Hình 4: Insulin làm tăng tính thấm ion kali, magie photphat vô 1.3 Tổng hợp insulin thể Insulin tổng hợp tế bào β tuyến tụy Insulin tạo từ phần protein lớn để đảm bảo gấp nếp mARN dịch mã protein preproinsulin Preproinsulin gồm trình tự đầu aa để tiền chất qua lưới nội chất tham gia vào trình sau dịch mã Tại trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo thành dạng proinsulin Sau hình thành cầu đisulfua số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh hoạt động Insulin đóng gói chứa hạt tiết tích tụ tế bào chất đến kích hoạt để giải phóng Hình 5: Tổng hợp insulin thể Hình 6: Các bước cải biến sau dịch mã phân tử insulin Hiện công nghệ ADN tái tổ hợp sử dụng để sản xuất 2.1 Phương pháp Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học tạo tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh     Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen Do hầu hết mARN người có polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với polyA Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho trình dịch mã; lại loại bỏ ADN ARN khác Cắt bỏ cầu nối A - T thu mARN Hình 7: Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp - Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn Nối ADN ligase phageT4 -Thiết kế trình tự mã hố cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin tế bào chất +Nếu sử dụng mARN tách từ tiến hành sau: - Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) - Cài đoạn cADN mã hố insulin hồn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca tạo lỗ xung điện Sau trình biến nạp, cần chọn lọc dịng vi khuẩn mang gen mong muốn Hình 8: Tách biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào lên men Nuôi chúng nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, chất dinh dưỡng bổ xung thường xuyên để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm số mũ Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn nhân lên qua nguyên phân Chỉ sau thời gian ngắn, sinh khối tăng lên nhanh gen insulin tổng hợp Hình 9: Đưa vi khuẩn chuyển gen vào nồi lên men    Bước 5: Tiền tinh Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit Bằng phương pháp ly tâm lọc tách proinsulin Hình 10: Proinsulin lọc tách ... khơng có q nhiều insulin, enzym insulinase kiểm sốt mức độ insulin Khi lượng insulin cao enzym insulinase phân huỷ hoocmon với thời gian phút Quá trình đảm bảo cho hàm lượng insulin ổn định máu... kích hoạt để giải phóng Hình 5: Tổng hợp insulin thể Hình 6: Các bước cải biến sau dịch mã phân tử insulin Hiện công nghệ ADN tái tổ hợp sử dụng để sản xuất 2.1 Phương pháp Tạo chuỗi riêng biệt,... photphat vô 1.3 Tổng hợp insulin thể Insulin tổng hợp tế bào β tuyến tụy Insulin tạo từ phần protein lớn để đảm bảo gấp nếp mARN dịch mã protein preproinsulin Preproinsulin gồm trình tự đầu aa