bộ giáo dục và đào tạo trờng đại học s phạm hà nội ii ***************** Đào thị ngọc anh Bài tiểu luận phơng pháp nghiên cứu khoa học " đề cơng luận văn thạc sĩ " Tên đề tài: tìm hiểu khả năng tái sinh cây ngô từ phôi non và noãn cha thụ tinh của một số dòng ngô bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào Chuyên ngành đào tạo: Sinh học thực nghiệm Mã số: hà nội - 2008 1 1. lý do chọn đề tài 1.1. Ngô là cây lơng thực giàu dinh dỡng; các sản phẩm từ ngô có nhiều ứng dụng trong thực tiễn: sản xuất bánh kẹo, đờng, sợi tổng hợp, xà phòng, sơn keo chất dẻo, chất cách điện, thuốc chữa bệnh . 1.2. Xuất phát từ thực trạng của việc lấy hạt là giống theo phơng pháp cổ truyền có nhiều điểm gây lãng phí: mỗi hạt chỉ phát triển thành một cây, còn những hạt không đủ khả năng nảy mầm thì hỏng. Do vậy, đã gây tổn thất lớn cho ngời nông dân nói riêng và cho ngành nông nghiệp nói chung. 1.3. Xuất phát từ thực tế của việc nuôi cấy mô trên thực vật trong những năm gần đây đã đem lại nhiều lợi ích to lớn trong việc tạo ra các cây giống chỉ từ mảnh mô thực vật: nhóm tế bào sinh dỡng; mô phân sinh hoặc bao phấn và noãn trong môi trờng nuôi cấy thích hợp để phát triển thành cây hoản chỉnh chỉ từ một tế bào. Nh vậy, đã hạn chế đợc những lãng phí trong việc tạo cây ngô giống từ hạt theo phơng pháp truyền thống. Đồng thời tạo ra đợc những cây giống sạch bệnh. Xuất phát từ những lí do trên và căn cứ vào đặc điểm u thế của phơng pháp nuôi cấy mô chúng tôi đã chọn đề tài: "Tìm hiểu khả năng tái sinh cây ngô từ phôi non và noãn cha thụ tinh của một số dòng ngô bằng phơng pháp nuôi cấy mô". 2. Mục đích nghiên cứu + Nghiên cứu khả năng thích nghi của giống ngô trên các môi trờng nuôi cấy khác nhau. Nhằm xác định đợc khả năng tạo callus, embryo và tái sinh cây của noãn ngô cha thụ tinh trong những loại môi trờng nào là tốt nhất. + Nghiên cứu sự hình thành callus và tái sinh của noãn đã thụ tinh và phôi non trong giai đoạn phôi sớm ( 3 - 4 ngày sau thụ tinh); trong giai đoạn 14 - 24 ngày sau thụ tinh. Để xác định đợc phôi non ở giai đoạn nào có khả năng tái tạo tốt nhất, khắc phục khả năng già về mặt sinh lý của chồi cây ngô trong môi trờng nuôi cấy, tức là cây ngô trổ cờ ngay trong ống nghiệm. 3. Đối tợng nghiên cứu 3.1 Đối tợng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 10 giống ngô bao gồm: LVN5, LVN8, LVN10, LVN9, LVN4, SW2, CV1, D1, D2, D3. Các giống ngô đem nghiên cứu đợc tạo ra từ Viện Di Truyền Nông Nghiệp, giống nhập nội từ Nhật Bản và từ Trung tâm ngô mì thế giới (CYMMY). Chúng có đặc điểm chung là phát triển tốt trong điều kiện bình thờng, đã đợc gieo trồng đại trà, thích hợp với khí hậu miền Bắc Việt Nam. 2 3.2 Vật liệu nghiên cứu Dùng phôi non và noãn cha thụ tinh. 4. Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu xác định khả năng tạo callus, embryo và tái sinh cây ngô từ phôi non và noãn cha thụ tinh trong loại môi trờng nuôi cấy nào là thích nghi nhất. 5. Phơng pháp nghiên cứu 5.1 Phơng pháp nghiên cứu lý thuyết Nghiên cứu xác định cơ sở lý thuyết của đề tài: các tài liệu về nuôi cấy mô, thông tin từ trang web những t liệu về nuôi cấy mô về ngô trên thế giới và ở Việt Nam; những thành tựu đã đạt đợc về nuôi cấy mô trên cây ngô. Trên cơ sở của mục đích là tạo ra những giống ngô tốt, những giống sạch bệnh, đồng đều về di truyền giữ nguyên đặc tính tốt của cây mẹ ban đầu. 5.2 Phơng pháp tiến hành thực nghiệm 5.2.1 Xác định thành phần của môi trờng nuôi cấy - Các nguyên tố đa lợng - Các nguyên tố vi lợng - Nguồn Cacbon - Các vitamin - Các chất tự nhiên - Các chất điều tiết sinh trởng - Chất làm đông cứng môi trờng - Agar - Độ pH của môi trờng. 5.2.2 Môi trờng nuôi cấy noãn và phôi non của ngô Vì ngô là cây thuộc họ hoà thảo nên môi trơng thích hợp chủ yếu cho nuôi cấy mô ở ngô đó là môi trờng cơ bản(MS) và môi trờng Chu(N6). Bảng 1: Thành phần môi trờng dùng trong nuôi cấy mô của noãn và phôi non của ngô Thành phần (mg/l) MS N6 Thành phần (mg/l) MS N6 Các nguyên tố đa lợng Các chất hữu cơ và vitamin KNO 3 1900 2830 Glyxin 2,0 2,0 KH 2 PO 4 170 - Thiamin.HCl 0,4 1,0 MgSO 4 .7H 2 O 370 90,35 Mio - Inositol 100 100 CaCl 2 .2H 2 O 440 125,3 Pyridoxin.HCl 0,5 0,5 Các nguyên tố vi lợng Nicotinic axit 0,5 0,5 3 H 3 PO 4 6,2 1,6 Chất điều hoà sinh trởng MnSO 4 .4H 2 O 22,3 - Edamin 1000 - FeSO 4 .H 2 O 27,8 27,8 Đờng saccaroza 30000 20000 NaEDTA.2H 2 O 37,3 37,3 UYK 2,0 - CoCl 2 .6H 2 O 0,025 - Kinetin 0,2 - CuSO 4 .5H 2 O 0,025 - Agar 8,0 8,0 ZnSO 4 .7H 2 O 8,6 1,5 pH 5,6 5,8 Na 2 MO 4 .2H 2 O 0,25 - KI 0,83 0,8 5.2.3 Các bớc tiến hành + Chọn mẫu và xử lý mẫu: Các giống ngô đem nghiên cứu đợc bố trí thí nghiệm trồng ngoài đồng ruộng sau đó thu mẫu và nuôi cấy trong ống nghiệm. Các dòng đợc bối trí theo hàng, mỗi giống gieo thành 3 hàng. Mỗi hàng gieo cách nhau 3 ngày tránh hiện tợng hạt phấn trên các cây chín cùng một lúc. - Chọn những noãn to đều khi râu phun đợc 5 - 7cm, bóc vỏ ngoài của noãn, cắt đoạn khoảng 2-2,5cm, rửa sạch bằng cồn etanol 70 o C. Sau đó đa vào buồng vô trùng, dùng H 2 O 2 10% để diệt trùng trong khoảng thời gian vài phút. - Chọn những phôi non của noãn đã thụ tinh đợc 3 - 4 ngày cắt đoạn có kích thớc 2-3mm, phôi non của noãn đã thụ tinh 14 - 24 ngày cắt đoạn 0,5 - 2mm. Cũng làm sạch thao tác nh trên. Nhằm tạo giống sạch bệnh. + Môi trờng nuôi cấy: Môi trờng nuôi cấy đợc sử dụng là môi trờng khoáng MS và môi trờng N6. + Môi trờng tái sinh: Sau khi nuôi cấy các callus hình thành đem chuyển sang môi trờng tái sinh. + Môi trờng ra rễ: Sau khi cây đợc tái sinh đa ra môi trờng ra rễ. Đó là môi trờng MS bổ sung thêm 1mg/1NAA. + Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ 26 o C trong tối với thời gian 2 - 4 tuần ánh sáng: 2000 - 3000 lux với thời gian chiếu sáng 14/24h. Độ ẩm bình thờng Trớc khi chuyển cây ra vờn ơm chúng tôi chuyển các bình ra nhiệt độ bình thờng bên ngoài, để ở mái hiên nơi có mái che hoặc phủ cót. Tránh ánh nắng trực tiếp mục đích để cây quen dần với nhiệt độ ngoài trời trong thời gian 1-2 tuần tuỳ thuộc vào độ cứng của cây. 4 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô trên một số dòng ngô 5.3 Phơng pháp thống kê toán học Kết quả thu đợc đem khảo sát, thống kê, phân tích và đối chiếu kết quả giữa các giống trong môi trờng thực nghiệm và giống đối chứng để làm rõ hiệu quả của việc tạo cây giống bằng phơng pháp nuôi cấy mô. Xác định giống nào thích nghi với môi trờng nuôi cấy nào và cho kết quả tạo cây giống đảm bảo năng suất nh thế nào. 6. Những đóng góp mới của luận văn Xác định đợc quy trình và kỹ thuật tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô của một số dòng ngô. Xác định đợc môi trờng nuôi cấy thích nghi với từng thời kỳ của noãn và phôi non của một số dòng ngô. Vận dụng vào quy trình sản xuất tạo ngô giống bằng phơng pháp nuôi cấy mô. 7. Triển vọng và kết quả của đề tài Một trong những vấn đề khó khăn trong thực tiễn hiện nay là làm thế nào để tạo đợc giống ngô cho năng suất cao và phẩm chất tốt mà không lãng phí hạt để làm giống. Chính vì vậy, những kết quả nghiên cứu về lý luận và thực tiễn của đề tài góp phần giải quyết hiệu quả vấn đề khó khăn trên. 8. Nơi thực hiện đề tài - Phòng nuôi cấy mô của Viện Di truyền Nông nghiệp - Vờn thực nghiệm khoa Sinh - Trờng ĐHSP Hà Nội II . 9. Dự kiến kết quả nghiên cứu 9.1 Khả năng tạo callus, embryo và tái sinh cây của noãn cha thụ tinh 9.1.1 ảnh hởng của môi trờng nuôi cấy đối với các giống khác nhau trong quá trình tạo callus 5 Các môi trờng khác nhau có khả năng tạo callus hoàn toàn khác nhau. Dự kiến kết quả thí nghiệm ở bảng sau: Bảng 2: ảnh hởng của môi trờng nuôi cấy đối với các giống khác nhau STT Nguồn giống Tần suất callus hình thành cấy khác nhau(%) trong các môi trờng nuôi MS N6 1 LVN5 16,1 7,0 2 LVN8 21,8 12,2 3 LVN10 9,0 2,1 4 LVN4 5,1 - 5 SW2 2,4 - 6 CV1 15,4 8,2 7 LVN9 6,2 5,2 8 D1 4,1 - 9 D2 14,4 12,4 10 D3 2,2 0,9 9.1.2 Khả năng tạo embryo và tái sinh của noãn ngô Nhiều callus đợc tạo thành mà không tái sinh đợc callus thứ cấp và không hình thành đợc embryo. Do đó không phải tất cả các giống ngô đem nghiên cứu đều có khả năng tạo cây con thông qua tạo callus và embryo. Dự kiến khả năng tái sinh callus và tái sinh cây của noãn ở các giống ngô khác nhau Bảng 3: Khả năng tạo embryo và tái sinh của noãn ngô đối với các giống khác nhau STT Nguồn giống Số callus ban đầu Số callus tái sinh Số cây tái sinh tạo đợc embyo 1 LVN5 127 16 14 2 LVN8 167 31 11 3 LVN10 42 - - 4 LVN4 218 42 26 5 SW2 14 6 1 6 CV1 8 - - 7 LVN9 121 11 2 8 D1 30 3 - 9 D2 181 24 14 10 D3 190 60 35 9.2 Sự hình thành callus và tái sinh của noãn đã thụ tinh và phôi non 9.2.1 Giai đoạn phôi non 14 - 24 ngày tuổi Sau khi thụ phấn đợc 14 - 24 ngày tuổi, dự kiến sẽ lấy những phôi có kích thớc 1 - 1,5mm thì tạo đợc callus dạng khối có khả năng tái sinh cây. Dự kiến kết quả thăm dò khả năng tạo callus của một số giống ngô đợc thống kê Bảng 4: Khả năng tạo embryo và tái sinh của noãn ngô 6 đối với các giống khác nhau STT Nguồn giống Số callus ban đầu Số callus tái sinh Số cây tái sinh tạo đợc embyo 1 LVN5 140 56 24 2 LVN8 185 35 19 3 LVN10 150 15 2 4 LVN4 220 40 36 9.2.2 Giai đoạn nuôi cấy phôi non Tiến hành nuôi cấy phôi sớm (noãn đã thụ tinh sau 3 - 4 ngày) . Dự kiến kết quả thí nghiệm ở bảng sau. Bảng 5: Tần suất tạo callus và tái sinh của embryo từ nuôi cấy phôi sớm đối với một số giống khác nhau STT Nguồn giống Số callus tạo đợc /100 noãn Số callus taisinh tạo ra embryo/100 noãn 1 LVN5 24,5 6,6 2 LVN8 18,6 11,0 3 LVN10 21,2 18,6 4 LVN4 24,1 4,6 5 SW2 2,2 - 6 CV1 11,1 9,0 7 LVN9 18,5 12,2 8 D1 20,6 9,5 10. Dự kiến tiến độ thực hiện đề tài 1. Từ tháng 9 đến tháng 12/2008: Thu thập và nghiên cứu những tài liệu có liên quan. Viết phần mở đầu và tổng quan. 2. Từ tháng 1 đến tháng 5/2009: Tiến hành thí nghiệm và xử lý số liệu. Viết kết quả nghiên cứu và thảo luận. 3. Từ tháng 6 đến tháng 8/2009: Xây dựng đề cơng chi tiết. 4. Từ tháng 9 đến tháng 10/2009: Viết tổng kết và kết luận đề nghị. 5. Từ tháng 10 đến tháng 11/2009: Hoàn chỉnh bản thảo và bảo vệ luận văn. 7 . đào tạo trờng đại học s phạm hà nội ii ***************** Đào thị ngọc anh Bài tiểu luận phơng pháp nghiên cứu khoa học " đề cơng luận văn thạc sĩ ". trờng nuôi cấy nào là thích nghi nhất. 5. Phơng pháp nghiên cứu 5.1 Phơng pháp nghiên cứu lý thuyết Nghiên cứu xác định cơ sở lý thuyết của đề tài: các tài