BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… TÊN NCS: BÙI ĐÌNH THẠCH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CÂY BẠCH HOA XÀ (Plumbago zeylanica L.) VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO PLUMBAGIN TRONG NUÔI CẤY IN VITRO Chuyên ngành: Sinh lý học Thực Vật Mã số: 62.42.01.12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2016 Công trình hoàn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS NGUYỄN HỮU HỔ Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TSKH NGÔ KẾ SƯƠNG Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) thuộc họ Plumbaginaceae, dược liệu phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Australia, Châu Á Châu Phi (Vijver Looter, 1971) Nhiều kết nghiên cứu cho thấy, Plumbagin chiết từ Bạch hoa xà có khả kháng ung thư (Mohana Purushothoma, 1980), kháng khuẩn (Duraga cs, 1990; Didery cs, 1994), kháng ký sinh trùng sốt rét (Parimala Sachdanandam, 1993), ức chế hoạt động phân chia tế bào (Bhargava, 1994), kháng sâu, kháng đột biến (Kubo cs, 1983) có khả làm giảm cholesterol (Ram, 1996) Vai trò Plumbagin chất kháng ung thư ghi nhận nhiều tác giả (Parimala Sachdanandam, 1993; Naresh cs, 1996; Sugie cs, 1998; Hazra cs, 2002) kháng ung thư tuyến tiền liệt (Powolny Singh, 2008), ung thư phổi (Hsu cs, 2006; Gomathinayagam cs, 2008), ung thư quản (Nair cs, 2008), ung thư buồng trứng (Srinivas cs, 2004) ung thư da (Wang cs, 2008) Hoạt tính kháng tế bào ung thư Plumbagin biểu qua khả ngăn chặn chu kỳ phân chia tế bào S-G2/M thông qua kích thích p12 –yếu tố kìm hãm enzyme cyclin-dependent kinase (Jaiswal cs, 2002; Kuo Cho, 2006) ung thư ruột; kìm hãm enzyme NAD(P)H oxidase (Ding cs, 2005) tế bào khối u não thận; kìm hãm enzyme liên quan đến hoạt động kháng ung thư (Hazra cs, 2002; Jaiswal cs, 2002) ức chế hoạt động yếu tố phiên mã NFKB (NF-KB: nuclear factor-kappaB) sản phẩm gen điều hòa NF-KB, kết làm tăng chết theo chương trình ức chế phát triển tế bào khối u (Aggarwal, 2004) Ngoài tác động kháng ung thư¸ Plumbagin kích thích tính nhạy cảm tế bào ung thư xạ qua thí nghiệm với tế bào khối u chuột tế bào khối u in vitro (Devi cs, 1998; Ganasoundari cs, 1997) Cho đến nay, nước ghi nhận số công trình công bố kết nghiên cứu BHX, chủ yếu khảo sát hoạt chất thứ cấp tác dụng dược lý, chưa ghi nhận công trình công bố kết nghiên cứu thu hoạt chất thứ cấp từ nuôi cấy rễ BHX in vitro Do có tác dụng dược lý nêu, song việc trồng BHX điều kiện tự nhiên để thu hoạt chất đòi hỏi nhiều thời gian, nên việc nghiên cứu tìm nguồn nguyên liệu chứa Plumbagin cao thông qua kỹ thuật công nghệ nuôi cấy rễ tơ BHX đề xuất thông qua việc thực đề tài: “Nghiên cứu tạo rễ tơ Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) khảo sát khả tạo Plumbagin nuôi cấy in vitro” Mục đích luận án: - Nghiên cứu tạo rễ tơ Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) - Khảo sát khả tạo Plumbagin nuôi cấy rễ tơ Bạch hoa xà in vitro Các nội dung nghiên cứu luận án - Tạo chọn nguồn vật liệu in vitro câyBạch hoa xà dùng cho chuyển gen - Ảnh hưởng số yếu tố đến hình thành rễ tơ - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tích lũy hoạt chất Plumbagin - Định tính định lượng hoạt chất Plumbagin rễ tơ - Khảo sát khả kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin Chương TỔNG QUAN 1.1 Thông tin đối tượng nghiên cứu 1.1.1.Đặc điểm hình thái Bạch hoa xà thuộc họ Plumbaginaceae, có nguồn gốc từ vùng Tây Bắc Châu Á Họ Plumbaginaceae có 10 chi 280 loài, nhiều loài thuộc chi Plumbago phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới (Vijver cs., 1971; Aditi cs., 1999; Vishnukanta cs., 2010; Lubaina cs., 2011) Ở Việt Nam, Bạch hoa xà có nhiều tên khác (Bạch tuyết hoa, Chiến, Đuôi công (Đỗ Tất Lợi, 2003), Đuôi công trắng, Bươm bướm trắng) hoang dại, phân bố tỉnh miền Trung đồng trung du Bắc bộ, trồng vườn gia đình sở khám chữa bệnh y học cổ truyền Vị trí phân loại sau: Giới Thực vật Phân giới Plantae Lớp Magnoliopsida Phân lớp Caryophyllidae Bộ Plumbaginales Họ Plumbaginaceae Chi Plumbago Loài Plumbago zeylanica L 1.1.2.Thành phần hóa học Hoạt chất thành phần hóa học Bạch hoa xà chất Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1, 4-naphthoquinone), có dạng đơn (hydro plumbagin, dihydro plumbagin, hydroxyl plumbagin (droseron), dihydroxy hydro plumbagin (idoshinanolon), chloro plumbagin, plumbagin acid), dạng ghép đôi (hai phân tử nối với tạo thành biplumbagin: chitanon, zeylanon, isozeylanon maritinon), có hai phân tử plumbagin zeylanon ghép lại với thành plumbazeylanon làm thành triplumbagin 1.1.3.Hoạt tính Plumbagin - Phản ứng oxy hóa chuyên biệt - Tế bào chết theo chương trình - Gây lỗi chu kỳ tế bào - Cảm ứng xạ kích thích kìm hãm Plumbagin - NF-kB - Bcl-2 - Akt - Topoisomerase-II - STAT-3 - NMPs - uPA - Phát triển vi sinh vật (Padhye cs, 2010) 1.2 Các nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ thu nhận Plumbagin thực vật Loài thực Nguồ vật n Môi Chất Nguồn thu Tài liệu trường ĐHSTTV nhận trích dẫn số chất Plumbagin mẫu bổ sung P indica Lá MS Thân MS 6,7 μM BA + 1,4 μM IAA + 370 μM Ads Chồi Das Rout (2002) Mô sẹo Satheesh Kumar Bhavananda 1,5 mg/L kinetin+ 2,5 Chồi MS ½ B5 mg/L 2,4-D n (1988) Chồi Chanprame cs (2003) mg/L BA Rễ tơ Rễ tơ Tatreerod cs (2003) Plumbago Thân non zeylanica P indica Rễ MS 0,49mmol/L IBA Rễ tơ Verma cs (2001) MS 0,2 mg/L Dịch huyền Petcharut NAA, 0,2 Phù tế bào Chuntaratin mg/L 2,4-D + Thân MS 0,5 mg/L (2006) Mô sẹo kinetin Lá MS 0,2 mg/L NAA, 0,2 mg/L 2,4(2,4-D), 0,5 mg/L kinetin Rễ tơ 30 g/l sucrose Plumbago Lá MS zeylanica 1,0 mg/L Rễ bất định Sivanesan IBA 0,5 rễ tơ Jeong mg/L NAA Plumbago Chồi indica (2009) Rễ tơ MS Gangopadh yay cs (2010) Plumbago Chồi MS 2,0 mg/L IAA – 0,02 Mô sẹo Villarrea scandens L P rosea Rễ tơ MS mg/L BAP – 0,5 mg/L GA3 cs (2015) Rễ tơ L Pillai cs (2015) Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp thực nghiệm 2.1.1.Tạo chọn nguồn vật liệu in vitro câyBạch hoa xà dùng cho chuyển gen 2.1.1.1 Khảo sát điều kiện khử trùng mẫu Mẫu sử dụng nghiên cứu đoạn thân chứa chồi bên thu nhận từ Bạch hoa xà tự nhiên, xử lý vô trùng nuôi cấy theo bước sau: Rửa vòi nước máy 10-15 phút; rửa tiếp 3-4 lần nước khử ion vô trùng, lắc 10 phút cồn 70%, rửa cồn nước khử ion vô trùng Mẫu khử trùng tiếp dung dịch Javel (2-8%); tiếp mẫu rửa nước khử ion vô trùng 3-4 lần, loại bỏ đoạn tế bào chết cấy mẫu lên môi trường MS Thí nghiệm lặp lại lần với 30 mẫu/nghiệm thức Các tiêu theo dõi sau tuần nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu cấy vô trùng (%) = (số mẫu cấy vô trùng/tổng số mẫu) x 100; Tỷ lệ mẫu cấy có khả phát triển (%) = (số mẫu cấy có khả phát triển/tổng số mẫu vô trùng) x 100; Tỷ lệ mẫu nảy chồi 2.1.1.2 Khảo sát môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ Các đoạn thân (chứa chồi bên) tạo từ nghiệm thức 2.2.1.1 nuôi cấy tiếp môi trường MS có bổ sung BA 1,0 – 2,5 mg/L IBA 0,1 – 0,5 mg/L Thí nghiệm bố trí mẫu/bình, bình/nghiệm thức, lặp lại lần Các tiêu theo dõi sau tuần nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi (%) = (số mẫu cấy tạo chồi/tổng số mẫu cấy) x 100; Số chồi trung bình/mẫu cấy; Chiều cao chồi (cm) 2.1.1.3 Phát triển hoàn chỉnh từ chồi in vitro Các chồi in vitro tạo từ nghiệm thức 2.2.1.2 nuôi cấy tiếp môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 – 0,5 mg/L Thí nghiệm bố trí mẫu/bình, bình/nghiệm thức, lặp lại lần Các tiêu theo dõi sau tuần nuôi cấy: Tỷ lệ mẫu cấy tạo rễ (%) = (số mẫu cấy tạo rễ/tổng số mẫu cấy) x 100; Số rễ trung bình/mẫu cấy; Số trung bình/mẫu cấy; Chiều dài rễ (cm) 2.1.1.4 Khảo sát khả tạo rễ bất định từ đoạn thân Bạch hoa xà in vitro Các mẫu (lá đoạn thân) in vitro nuôi cấy môi trường MS có bổ sung NAA, IBA 0,1 – 1,5 mg/L Thí nghiệm bố trí mẫu/bình, bình/nghiệm thức, lặp lại lần Các tiêu theo dõi sau tuần nuôi cấy: Trọng lượng rễ trung bình (gTLT/nghiệm thức) Hình 3.15 Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ tơ BHX nuôi cấy Bảng 3.11 Ảnh hưởng trọng lượng ban đầu đến khả sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Nghiệm Trọng lượng Trọng lượng sau Chỉ số sinh thức ban đầu (g tuần nuôi cấy trưởng TLT) (gTLT) 1,05 2,13 1,03a 2,02 2,98 0,48b 3,02 3,99 0,42b 4,00 5,68 0,32b LSD 0,01 0,25 CV 16,33 Các số trung bình tiêu khảo sát với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p=0,01 z: Các chữ a, b, c, d, e, f cột biểu thị khác biệt nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng t Tests (LSD) 33 3.3.6.Ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng elicitor lên sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy elicitor khảo sát mức độ ảnh hưởng chúng đến khả sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Dựa vào mức ảnh hưởng chúng để sàng lọc yếu tố có ảnh hưởng đến thông số cần quan tâm Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lên khả sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Các nghiệm thức thiết lập theo thiết kế Plackett-Burman, dựa thông số thực tế, ma trận Plackett-Burman thu trọng lượng tươi 4,02-4,78 g, trọng lượng khô 0,36-0,56 g hàm lượng Plumbagin 0,169-1,154 mg 60 ml môi trường nuôi cấy (Bảng 3.12) Giá trị ảnh hưởng yếu tố lên trọng lượng tươi, trọng lượng khô hàm lượng Plumbagin tính toán phần mềm Design expert® 7.0.0 (Bảng 3.13) yếu tố có giá trị ảnh hưởng lớn (giá trị dương) thông số trọng lượng tươi, trọng lượng khô hàm lượng Plumbagin (p < 0,05) rễ tơ BHX nuôi cấy chọn là: nước dừa, chitosan, salicylic acid pepton Kết cho thấy nước dừa có tác động mạnh đến tăng trưởng trọng lượng tươi trọng lượng khô rễ, pepton chitosan có ảnh hưởng mạnh đến tích lũy Plumbagin 34 Bảng 3.12 Ảnh hưởng số yếu tố lên sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Nghiệm Trọng lượng tươi thức Trọng lượng khô Hàm lượng (g) Plumbagin (mg) (g) Thí Mô Thí nghiệm hình nghiệm 4,82 4,78 0,54 0,56 1,184 1,154 4,22 4,02 0,403 0,36 0,899 0,731 4,41 4,78 0,415 0,47 0,956 0,591 3,37 4,02 0,253 0,36 0,945 1,154 4,25 4,02 0,427 0,45 0,008 0,169 3,61 4,02 0,439 0,36 0,380 0,591 5,14 4,78 0,557 0,45 0,221 0,169 5,28 4,78 0,559 0,56 0,860 0,731 4,4 4,78 0,423 0,47 0,351 0,731 10 5,32 4,02 0,563 0,45 1,42 1,154 11 4,62 4,78 0,585 0,56 0,353 0,591 12 3,34 4,02 0,346 0,45 0,361 0,169 35 Mô hình Thí Mô hình nghiệm Bảng 3.13 Ảnh hưởng số yếu tố dinh dưỡng elicitor lên sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Yếu tố Giá trị khảo sát Mức tác động Trọng Trọng Hàm lượng lượng lượng khô Plumbagin tươi Nước dừa (%) 10 30 0,76 0,108 -0,014 Peptone (mg/L) 100 500 0,34 -0,00467 0,563 men (mg/L) 100 1000 0,277 0,020 0,005 Chitosan(mg/L) 100 300 -0,08 0,013 0,422 Casein(mg/L) 100 500 0,01 0,003 -0,119 SA (mg/L) 10 100 0,067 0,009 0,107 Đường (g/L) 10 50 -0,413 -0,088 -0,072 Dịch trích nấm Tối ưu hóa giá trị yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng tích lũy Plumbagin Sau sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng tích lũy Plumbagin, kế hoạch hóa thực nghiệm thực theo đáp ứng bề mặt (RSM-DOD), xử lý Design expert® 7.0.0 Giá trị hàm đáp ứng theo thực nghiệm tiên đoán theo mô hình trình bày Bảng 3.14 36 Bảng 3.14 Ảnh hưởng yếu tố lên sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Hàm lượng N T Nư Chitos SA Pepto ớc an ne dừa Trọng Trọng Hàm lượng lượng tươi lượng khô plumbagin Thí Thí Thí Mô Mô nghiệ hình nghiệ hình nghiệ m m Mô hình m 23 175 42 249 2,92 3,00 0,38 0,38 10,59 10 100 100 500 2,95 2,79 0,35 0,34 10,59 10,28 30 264 100 100 2,94 2,87 0,37 0,37 10,57 11,38 20 300 42 100 2,90 3,01 0,38 0,36 10 100 43 292 3,10 3,24 0,36 0,35 10,92 10,29 10 278 53 290 4,97 4,89 0,51 0,50 5,06 5,74 10 300 10 500 2,69 2,75 0,43 0,44 6,71 7,46 30 100 84 100 2,52 2,74 0,34 0,35 7,97 6,91 30 100 100 426 2,66 2,58 0,38 0,35 14,70 14,56 10 20 300 42 100 3,10 3,12 0,29 0,31 11 30 196 43 500 2,57 2,53 0,34 0,35 12,46 12,10 12 10 300 100 100 3,1 2,94 0,45 0,43 10,35 10,42 13 20 100 10 500 2,99 2,96 0,34 0,39 13,68 11,86 14 30 100 100 426 3,32 3,04 0,38 0,37 9,92 10,77 15 30 196 43 500 2,24 2,25 0,28 0,27 8,33 7,61 16 30 300 100 500 3,66 3,81 0,47 0,47 10,03 11,06 37 7,61 9,35 9,93 8,79 8,29 17 17 100 11 100 3,29 3,31 0,39 0,36 6,86 7,72 18 10 203 10 100 2,98 2,97 0,36 0,38 6,78 7,39 19 30 300 10 310 2,85 2,94 0,40 0,40 9,19 7,60 20 30 100 10 100 2,92 2,84 0,38 0,39 8,66 10,3 21 30 300 10 310 2,83 2,94 0,43 0,43 11,59 10,42 22 10 300 92 500 2,58 2,79 0,34 0,34 10,67 10,73 23 10 100 100 500 3,32 3,01 0,34 0,36 24 18 222 100 344 2,90 3,04 0,35 0,37 11,14 10,38 25 14 100 100 100 3,06 2,96 0,44 0,39 10,60 11,91 8,27 8,19 Phân tích phương sai (ANOVA) phương trình hồi quy dùng mô hình để tiên đoán cho hàm mục tiêu thu Thông giá trị phân tích, ảnh hưởng mức tương quan ảnh hưởng yếu tố đến khả sinh trưởng tích lũy Plumbagin thể Bảng 3.15 Bảng 3.15 Phân tích phương sai phương trình hồi quy theo mô hình D-Optimal Thông số Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Hàm lượng Plumbagin R2 (R- 0,927 0,864 0,994 C.V% 7,852 6,988 10,510 Phương Y1 = 3,278– 0,352x1- Y2 = 0,35– Y3 = trình tuyến 0,536x2-0,144x3 + 0,031x2 7,03+1,31x1- Squared) 38 tính tương 0,426x1x2 + 0,439x1x3 +0,036x1x3- 0,75x3- quan – 0,983x1x4- 0,044x1x4 – 0,97x1x2 + yếu tố 0,526x2x3+ 0,038x2x3 + 1,21x1x3 + 0,240x3x4+ 0,386x12 – 0,025x3x4 – 0,95x2x3– 1,310x22-0,714x32 0,068x32+ 0,1x42- 1,41x2x4 – +1,265x42- 0,029x1x2x3+ 0,90x3x4 0,813x1x2x3+0,266x1x 0,023x1x2x4+ +2,22x22 + 2x4+ 0,048x1x3x4+ 1,48x32– 1,156x1x3x4+0,669x12 0,065x12x2 2,00x1x3x40,73x12x2 x2 x1, x2, x3, x4 lầnlượt tương ứng: nước dừa, chitosan, salicylic acid peptone Từ kết nhận được, mô hình đáp ứng bề mặt (D-Optimal) dự đoán điểm tối ưu cho sinh trưởng tích lũy Plumbagin nước dừa: 14,33%, chitosan 100 mg/l, salicylic acid 19,40 mg/l peptone 500 g/l, với kết nhận tương ứng: trọng lượng tươi 4,968 g/ 60 ml MT, trọng lượng khô: 0,451 g/ 60 ml MT hàm lượng plumbagin:11,135 mg/ 60 ml MT Từ ghi nhận có cho thấy, có nhiều yếu tố tác động đến sinh trưởng tích lũy plumbagin rễ tơ Bạch hoa xà Kết góp phần khẳng định vai trò số yếu tố trình sinh trưởng tích lũy hoạt chất nuôi cấy mô thực vật Putalun cs (2010), Thaweesak cs (2011) Naha´lka cs (1998) 39 3.4 Khảo sát khả kháng tế bào ung thư biểu mô gan Plumbagin Ảnh hưởng plumbagin lên tăng sinh tế bào HepG2 Plumbagin chứng minh có khả ức chế tăng sinh nhiều loại tế bào ung thư tế bào ung thư phổi (Gomathinayagam cs, 2008), ung thư biểu bì (Hazra cs, 2002),…thông qua chết theo chương trình cảm ứng làm thay đổi mật độ tế bào Trong nghiên cứu này, tế bào HepG2 Plumbagin nồng độ khác cảm ứng Sau ba ngày nuôi cấy, mật độ tế bào HepG2 giảm dần nồng độ Plumbagin gây cảm ứng tăng dần (Bảng 3.16; Hình 3.16) Bảng 3.16 Tế bào HepG2 sau ngày cảm ứng Plumbagin nồng độ khác Nồng độ Plumbagin (µM) Đối chứng 2,5 10 20 Mật độ tế 137,67 bào ±1,76a 115,33±1,45b 58,00±1,00c 57,33±1,20c 23,33±0,88d (x104) a,b,c,d: Khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤0,05) 40 Hình 3.16 Hình thái tế bào HepG2 A: Đối chứng B, C, D, E: HepG2 cảm ứng Plumbagin nồng độ 2,5, 5, 10, 20 µM Để xác định biến đổi nhân trình apoptosis, phương pháp nhuộm đơn với thuốc nhuộm Acridine Orange áp dụng việc đánh giá hình thái nhân (Steve cs, 2006) Kết nhuộm nhân cho thấy nhóm tế bào đối chứng có hình thái nhân bình thường - đều, màng nhân liên tục không thấy nhân bị phân mảnh (Hình 3.17A) Trong nhóm tế bào xử lý Plumbagin xuất phân mảnh nhân Nhân tế bào HepG2 cảm ứng plumbagin bị phân mảnh phân tán tế bào chất Quá trình phân mảnh nhân tế bào HepG2 diễn mạnh nồng độ Plumbagin cảm ứng tăng (Hình 3.17) 41 Hình 3.17 Sự phân mảnh nhân tế bào HepG2 A: HepG2 không xử lý Plumbagin B, C, D, E: HepG2 xử lý Plumbagin nồng độ tương ứng 2,5, 5, 10, 20 µM Phần trăm DNA đuôi comet thể lượng DNA đứt gãy tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet thể mức độ đứt gãy DNA nhân tế bào Kết cho thấy, nồng độ cao, lượng DNA đứt gãy nhân tế bào HepG2 lớn (Bảng 3.17) Kết phù hợp với kết đánh giá phân mảnh nhân tế bào HepG2 cảm ứng Plumbagin (Hình 3.18) Đây đặc điểm quan trọng liên quan tới chết theo chương trình tế bào HepG2 42 Bảng 3.17 Tỷ lệ đứt gãy DNA đuôi tỉ lệ chiều dài đuôi comet/chiều dài comet Nồng độ Plumbagin (µM) Đối chứng Phần trăm DNA 12,46± 2,5 10 32,96± 46,99± 48,66± 20 65,32± đuôi comet 0,72a 1,47b 3,64c 3,12c 2,56d Tỉ lệ chiều dài đuôi 0,19± 0,41± 0,55± 0,63± 0,76± comet/chiều dài 0,01a 0,03b 0,03c 0,02c 0,04d comet Hình 3.18 Sự đứt gãy DNA nhân tế bào HepG2 cảm ứng plumbagin A, B, C, D, E: Ảnh huỳnh quang tế bào HepG2 nhuộm với Acridine Orange A1, B1, C1, D1, E1: Ảnh comet tế bào HepG2 phân tích DNA đứt gãy Kết phân tích biểu gene kháng apoptosis bcl-2 gene tiền apoptosis bax mức phiên mã cho thấy sản phẩm phiên mã mRNA gene bax biểu tăng theo nồng độ xử lý Plumbagin 43 biểu mRNA gene bcl-2 gần không thay đổi nồng độ Plumbagin (Hình 3.19) Hình 3.19 Sự biểu gene Bcl-2 Bax tế bào HepG2 cảm ứng Plumbagin Quá trình giảm biểu sản phẩm phiên mã gene kháng apoptosis bcl-2 tăng biểu gene tiền apoptosis bax diễn tương ứng với việc số đặc điểm biến đổi hình thái trình apoptosis phân mảnh tế bào chất, cô đặc nhiễm sắc chất phân mảnh nhân diễn mạnh Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Chồi in vitro Bạch hoa xà phát triển tối ưu điều kiện môi trường MS bổ sung 1,5 mg/L BA 0,1 mg/L IBA; phát triển hoàn chỉnh từ chồi môi trường MS bổ sung 0,1 mg/L IBA; Lá nguồn nguyên liệu cho khả tạo rễ bất định cao với môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L IBA 0,1 mg/L NAA 44 - Tạo dòng rễ tơ mang gen rolB, có dòng mang gen rolB rolC Qua mô hình thuật toán điều kiện acetosyringone 134,09 µM 3,47 ngày ủ chung mẫu với vi khuẩn Agrobacterium rhisogenis ATCC 11325 cho tỉ lệ mẫu chuyển gen cao (0,025%) - Elicitor dinh dưỡng yếu tố cần thiết cho trình sinh trưởng tích lũy hoạt chất rễ tơ Bạch hoa xà (nước dừa: 14,30%, chitosan 100 mg/L, salicylic acid 19,40 mg/L peptone 500 g/L thu kết trọng lượng tươi 5,268 g, trọng lượng khô: 0,46 g hàm lượng Plumbagin: 13,135 mg) - Plumbagin cảm ứng biểu đặc điểm hình thái thay đổi cân biểu số gene liên quan tới trình chết tế bào HepG2, thông qua mật độ trung bình tế bào HepG2 giảm nồng độ Plumbagin µM (58x104 tế bào/ml) 10 µM (57,33x104 tế bào/ml) giảm mạnh nồng độ 20 µM (23,33x104 tế bào/ml); phân mảnh nhân biểu gene liên quan đến trình apoptosis gene bax bcl-2 4.2 Đề nghị - Khảo sát số yếu tố tác động đến trình chuyển gen (chủng vi khuẩn, nhiệt độ, pH, chất phenol, ) nhằm tăng hiệu chuyển gen - Nghiên cứu số elicitor khác (ion kim loại, vi sinh vật, ) đến khả sinh trưởng tích lũy Plumbagin rễ tơ Bạch hoa xà 45 - Kiểm tra độc tính Plumbagin để có sở khoa học cho việc ứng dụng hoạt chất vào thực tế NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Xác định điều kiện khử trùng, môi trường tạo chồi, tạo rễ Bạch hoa xà in vitro Tạo rễ tơ bạch hoa xà điều kiện in vitro nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 11325 - Xác định số yếu tố ảnh hưởng trình sinh trưởng tích lũy hợp chất Plumbagin rễ tơ DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ Bùi Đình Thạch, Nguyễn Minh Hiếu, Nguyễn Phương Uyên, Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ (2012): Tạo nguyên liệu in vitro bước đầu khảo sát khả tạo rễ tơ Bạch hoa xà- Plumbago zeylanica L., Tạp chí sinh học, 34(3SE): 161-169 Bùi Đình Thạch, Hoàng Nghĩa Sơn, Đoàn Chính Chung, Đỗ Minh Sĩ, Lê Thành Long, Nguyễn Hữu Hổ, Ngô Kế Sương (2014): Plumbagin cảm ứng số đặc điểm apoptosis tế bào HepG2, Tạp chí sinh học, 36(2): 247-252 Bui Dinh Thach, Le Nguyen Tu Linh, Nguyen Thi Thuy Van, Trinh Thi Ben, Nguyen Pham Ai Uyen, Ngo Ke Suong & Nguyen Huu Ho (2014): Investigation on the accumulation of plumbagin in 46 Plumbago zeylanica L hairy roots, European Journal of Advanced Research in Biological and Life Sciences, 2(2): 14-21 47 [...]... l p l i 3 l n, mỗi l n 3 bình erlen (250 ml) chứa 60 ml môi trường l ng kết quả được ghi nhận thông qua: xác định trọng l ợng tươi (TLT), trọng l ợng khô (TLK) và hàm l ợng Plumbagin trong mỗi nghiệm thức sau 4 tuần nuôi cấy 2.1.4 Định tính và định l ợng hoạt chất Plumbagin ở rễ tơ Nghiền 1 g mẫu rễ khô và ly trích với chloroform trong máy ly trích soxhlet ở nhiệt độ phòng 48 giờ Cho bay hơi dịch ly... khả năng phát triển rễ tơ cây Thanh hao hoa vàng tối ưu khi l ợng oxy trao đổi trong môi trường bằng hoặc cao hơn l ợng oxy rễ hấp thu 32 Hình 3.15 Ảnh hưởng trọng l ợng ban đầu đến khả sinh trưởng triển rễ tơ BHX nuôi cấy Bảng 3.11 Ảnh hưởng trọng l ợng ban đầu đến khả năng sinh trưởng rễ tơ BHX nuôi cấy Nghiệm Trọng l ợng Trọng l ợng sau 4 Chỉ số sinh thức ban đầu (g tuần nuôi cấy trưởng TLT) (gTLT)... 3.1 2) Kết quả này cũng phù hợp với ghi nhận của Sivanesan và Jeong (200 9) khi nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà được tạo ra bởi dòng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 532 (MTCC) Kết quả ghi nhận được cho phép chọn điều kiện tối để nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà Hình 3.12 Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây BHX 27 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chiếu sáng đến khả năng sinh trưởng rễ tơ cây. .. hàm l ợng Plumbagin 0,169-1,154 mg trong 60 ml môi trường nuôi cấy (Bảng 3.1 2) Giá trị ảnh hưởng của từng yếu tố l n trọng l ợng tươi, trọng l ợng khô và hàm l ợng Plumbagin được tính toán bằng phần mềm Design expert® 7.0.0 (Bảng 3.1 3) 4 yếu tố có giá trị ảnh hưởng l n (giá trị dương) ở các thông số trọng l ợng tươi, trọng l ợng khô và hàm l ợng Plumbagin (p < 0,0 5) của rễ tơ BHX nuôi cấy được chọn l :... Duncan's Multiple Range Tests 3.1.2 Khảo sát tìm môi trường tối ưu để tạo chồi trực tiếp từ chồi ngủ Kết quả khảo sát khả năng tạo chồi từ chồi bên trong nuôi cấy mô cây Bạch hoa xà sau 4 tuần nuôi cấy nhận thấy: Nghiệm thức A1 (1,0 mg /L BA và 0,1 mg /L IBA) cho chiều cao trung bình của chồi l 1,57 cm với số l ợng chồi trung bình l 4,49 chồi/mẫu, còn ở nghiệm thức B1 (1,5mg /L BA và 0,1 mg /L IBA) - chiều... thức (Bảng 3. 3) Ở nghiệm thức có bổ sung IBA l n l ợt l 0,1 mg /L; 0,15 mg /L; 0,3 mg /L đều nhiều rễ Trong đó, nghiệm thức có bổ sung 0,1 mg /L IBA cho chiều dài rễ tốt nhất (2,28 cm) 17 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA l n sự phát triển cây Bạch hoa xà từ chồi in vitro NT IBA(mg /L) Tỷ l Số rễ Chiều Số l tạo rễ trung dài rễ trung ( %) bình/mẫu (cm) bình/mẫu E0 0,00 100 4,31 g 2,92 a 4,03g E1... rễ tơ cây Ipomoea aquatic nuôi cấy ở điều kiện sáng kích thích sinh khối tăng gấp 2 l n và hàm l ợng peroxidase tăng gấp 4 l n so với điều kiện tối (Taya và cs, 199 4); Ngược l i, ánh sáng kìm hãm sự phát triển sinh khối và hàm l ợng thiophene khi nuôi cấy rễ tơ cây Tagetes patula (Mukundan và Hjortsø, 199 1) Kết quả nuôi cấy rễ tơ cây Bạch hoa xà cho thấy ở điều kiện tối sinh khối thu được cao hơn so... triển của rễ tơ được ghi nhận sau 0, 1, 2, 3,4, 5, 6 tuần nuôi cấy, với chỉ tiêu theo dõi: Trọng l ợng tươi (gTLT/bình); Hàm l ợng Plumbagin (µg/g TLT) 10 2.1.3.3 Ảnh hưởng một số yếu tố dinh dưỡng và elicitor l n sự sinh trưởng của rễ tơ - Thí nghiệm được thiết l p với 12 nghiệm thức, cho 7 yếu tố: Nước dừa (10-30 %), chitosan (10-100 mg /L) , salicylic acid (100-300 mg /L) , đường (10-50 g /L) , dịch chiết... nhận của Sivanesan và Jeong (200 9) khi nuôi cấy rễ tơ 30 cây Bạch hoa xà được tạo ra nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes MTCC 532 nuôi trên 3 môi trường MS, SH và B5, trong đó môi trường MS l tốt nhất (6,3 g TLT; 0,99 gTLK) Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và cs (200 9) thì rễ tơ cây Angelica gigas phát triển tốt nhất trong môi trường SH so với MS và B5; trong môi trường ON rễ tơ cây Neem tăng trưởng... bằng sắc ký l p mỏng (TLC) Dịch ly trích từ rễ tơ cây Bạch hoa xà được định tính cùng với chất chuẩn Plumbagin bằng sắc ký l p mỏng như sau: 12 - Sử dụng bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 20 x 20cm - Dung dịch ly giải: Ether dầu hỏa: ethyl acetate = 7:3 - Thuốc thử: NaOH 10% trong cồn 2.1.4.2 Định l ợng Plumbagin bằngHPLC (Gopinath và cs, 200 9) HPLC được tiến hành trên cột pha đảo C-18, (250×4. 6), kích thước