Đang tải... (xem toàn văn)
Định lượng coliforms bằng phương pháp MPN_Trường đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM...................................................................................................................................................................................................................................
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN GVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 10/2016 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN DANH SÁCH NHÓM HỌ VÀ TÊN MÃ SỐ SINH VIÊN Nguyễn Thị Kim Loan Lê Thị Mỹ Duyên 2006140062 Nguyễn Phạm Thị Mỹ Duyên 2006140059 Nguyễn Thị Kiều Em THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 10/2016 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN VỀ COLIFORMS Coliforms trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí kị khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 24 – 48 Coliforms định nghĩa vi khuẩn có khả lên men sinh khoảng 48 ủ 370C môi trường lỏng Lauryl Sunfate môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt Coliforms tiêu thông dụng dụng để đánh giá mức an toàn vi sinh thực phẩm, áp dụng Mỹ 1920 Nhóm Coliforms diện rộng rãi tự nhiên, ruột người, động vật Sự diện lượng lớn Coliforms thực phẩm điều không mong muốn, nhiên rõ rang loại bỏ chúng hoàn toàn nhiều thực phẩm động lạnh tươi sống Nhóm Coliforms gồm giống là: E.Coli; Citrobacter; Klebsiella Enterrobacter Hình : Coliforms II.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 4882 : 2007 ( ISO 4831 : 2006) dùng để phát định lượng Coliforms thực phẩm Nguyên tắc Cấy vào ống nghiệm chứa môi trường tăng sinh chọn lọc lỏng nồng độ kép lượng mẫu thử xác định ( sản phẩm ban đầu chất lỏng) với lượng huyề phù ban đầu xác định ( có sản phẩm dạng khác) Sau đó, điều kiện, cấy ống chứa môi trường với dịch pha loãng thập phân phần mẫu thử huyền phù ban đầu Ủ ống chứa môi trường tăng sinh chon lọc nồng độ kép 37 0C 24 ống chứa môi trường nồng độ đơn 24 48 sau kiểm tra sinh khí mờ đục ống Từ ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ kép ống chứa môi trường tăng sinh chọn lọc nồng độ đơn có sinh khí mờ đục, cấy dịch cấy vào loạt ống chứa môi trường khẳng định Ủ ẩm ống 370C 24h đến 48h sau kiểm tra tất ống sinh khí Tính xác xuất lớn Coliforms có mililit gram mẫu ( tức số MPN) từ số ống có sinh khí loạt ống thử Dùng bảng để xác định số có xác xuất lớn 3.1 Hóa chất, môi trường, dụng cụ thiết bị Hóa chất môi trường Hóa chất- môi trường Dung dịch Saline Qui cách Số lượng/ đơn vị tính 120ml đến 140ml Peptone Water (SPW) Lauryl Suflate Tryptone 90ml Broth (LSB) Brilliant Green Lactpse 90ml Bile Salt ( BGBL) Cồn 900 700 0,5 lít NaCl NaOH 10% 10% 3-5 giọt 3.5 giọt Môi trường tăng sinh chọn lọc: ( Lauryl Suflate Tryptone Broth ( LSB) Môi trường nồng Môi trường nồng độ kép Tryptose 40 g Lactose 10 g Natri Clorua ( NaCl) 10 g Dikali hidrophotphat 5,5 g độ đơn 20 g 5g 5g 2,75 g (K2HPO4) Natri lauryl sulfat 0,2 g Nước cất 1000 ml Kali hidrophotphat 5,5 g 0,1 g 1000 ml 2,75 g (KH2PO4) Môi trường khẳng định: Brilliant green lactose bile broth ( BGBL) gồm : + Pepton : 10 g + Lactose : 10 g + Mật khô bò: 20 g + Briliiant green: 0,0133 g + Nước cất: 1000 ml 3.2 Dụng cụ ( sử dụng cho mẫu phân tích) Ống nghiệm Cốc thủy tinh Cốc thủy tinh Ống Durham Bình tam giác bao PE vô trùng Ống đong Que cấy vòng Đầu típ Pipetman Đầu típ Pipetman Đèn cồn Ống hút nhỏ giọt Bút lông đầu 18mm 100ml 250ml 250ml or kg 100ml 1000 microlit 5000 microlit 18 ống cái 18 ống cái cái cái cái Bông thấm ướt Bông không thấm ướt 3.3 0,3 kg 0,3 kg Thiết bị ( dung cho mẫu phân tích) Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Tủ ấm 300C-370C Máy dập mẫu (Stomacher) Máy trộn mẫu vortex mixer) Cân phân tích pH kế Bể ổn nhiệt Pipetman 1000 microlit Pipetman 5000 microlit Lò viba cái cái cái cái cái Chuẩn bị dung dịch pha loãng môi trường nuôi cấy 4.1 Chuẩn bị dung dich pha loãng Dung dịch pha loãng tham chiếu theo TCVN 6507-1 : 2005 (ISO 6887-1 : 2003) Dung dịch muối pepton (SPW): Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Phân phối 90ml dịch pha loãng vào bình (hoặc lọ có nắp vặn) 9ml vào ống nghiệm Đậy nắp bình ống nghiệm, hấp khử trùng 4.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Môi trường tăng sinh chọn lọc: Lauryl sulfate tryptose broth (LSB) Hòa tan thành phần nước cất, đun nóng cần Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham úp ngược Hấp khử trùng, ống Durham không chứa bọt khí sau hấp Môi trường khẳng định: Brilliant green lactose bile broth (BGBL) Hòa tan thành phần nước cất, đun nóng cần Phân phối 10ml môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham úp ngược Ống Durham không chứa bọt khí sau hấp Quy trình định lượng coliforms 5.1 Quy trình định lượng Coliforms 10g/25g mẫu rắn 10ml/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone Water(SPW) Đồng mẫu Stomacher 60 giây Pha loãng Mẫu chất lỏng/ huyền phù ban đầu Dịch mẫu 10-1/10-2 1ml 1ml 10ml Ba ống nghiệm LSB nồng độ kép Ba ống nghiệm LSB nồng độ đơn Ba ống nghiệm LSB nồng độ đơn Ủ 30oC 37oC 24 – 48 Ghi nhận ống LSB (+) độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, ủ 30oC 37oC 24 – 48 Số ống (+) độ pha loãng Tra bảng MPN Biểu thị kết 10 5.2 Các bước thực quy trình định lượng Coliforms Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử huyền phù ban đầu Cân xác 10g/25g mẫu rắn 10ml/25ml mẫu lỏng cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu Đồng mẫu máy dập mẫu phút lắc bình tam giác 2-3 phút Bước 2: Pha loãng mẫu Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dịch dịch pha loãng SPW vô trùng nhiệt độ thích hợp Để có độ xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu 1cm Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng Trộn máy vortex – 10 giây để thu dung dịch pha loãng 10-2 (đối với mẫu nguyên chất thu dung dịch pha loãng 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác để có dung dịch pha loãng 10 -3,10-4,10-5,… thu độ pha loãng thích hợp Hình 2: Kỹ thuật pha loãng mẫu Bước 3: Cấy ủ mẫu 11 Lấy ống nghiệm môi trường tăng sinh LSB có nồng độ kép Dùng pipet vô trùng chuyển 10ml mẫu thử chất lỏng 10ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác vào ống Lấy ống nghiệm môi trường tăng sinh LSB có nồng đô đơn Dùng pipet vô trùng khác chuyển 1ml mẫu thử chất lỏng 1ml huyền phù ban đầu sản phẩm dạng khác vào ống nói Lấy ống môi trừng tăng sinh LSB có nồng độ đơn lại Dùng pipet vô trùng khác chuyển 1ml dịch mẫu loãng vào ống nghiệm nói Trộn dịch cấy vào môi trường Đặt ống môi trường LSB có nồng độ kép đơn vào tủ ấm 370C 24 2h Nếu giai đoạn ống môi trường LSB có nồng độ đơn không thấy sinh khí mờ đuc ủ thêm 24 2h Bước 4: Thử nghiệm khẳng định Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy từ ống môi trường LSB nồng độ kép đơn có biểu mờ đục sinh khí sang ống môi trường thử khẳng định BGBL Đặt vào tủ ấm 370C 24 2h, không sinh khí giai đoạn ủ tiếp 24 2h Đọc kết Tính số có xác suất lớn từ số ống dương tính độ pha loãng Tra bảng MPN, suy số lượng vi khuẩn Coliforms gram ml sản phẩm Ví dụ 1: Độ pha loãng N/chất 10-1 10-2 Số ống (+) LSB Số ống (+) BGBL 2 12 Chỉ số dương tính môi trường BGBL 220, dựa vào bàng 4.2 tra số vi khuẩn Coliforms 1ml (g) mẫu 2MPN/ml (g) Ví dụ 2: Trong trường hợp pha loãng nhiều lần kết tra bảng nhân với số nghịch số pha loãng ban đầu Độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 Số ống (+) LSB Số ống (+) BGBL 2 Chỉ số dương tính môi trường BGBL 220, dựa vào bảng 4.2 có kết Vậy ta có số vi khuẩn Coliforms 1ml (g) mẫu 103 vi khuẩn/ml (g) Bảng 4.2 Tra bảng MPN loạt ống nghiệm 13 Số ống dương Chỉ số Nguyên chất 1/10 1/100 0 0 0 MPN Chỉ số Số ống dương MPN Nguyên chất 1/10 1/100 0,0 2 3,5 0,2 2 4,0 0,3 3,0 1 0,6 2,5 0,5 4,0 0 0,4 0 2,5 1 0,7 4,0 1,1 6,5 1 0,7 4,5 1 1,1 1 7,5 1,1 11,5 1,5 3 10,5 1,6 9,5 0 0,9 15 1,1 2 20 2 2,0 3 30 1,5 3 25 1 2,0 3 45 2 3,0 3 110 2 2,0 3 140 2 3,0 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 [...]... Thử nghiệm khẳng định Dùng que cấy vòng cấy dịch cấy từ các ống môi trường LSB ở nồng độ kép và đơn có biểu hiện mờ đục và sinh khí sang các ống môi trường thử khẳng định BGBL Đặt vào tủ ấm ở 370C trong 24 2h, nếu không sinh khí ở giai đoạn này thì ủ tiếp 24 2h 6 Đọc kết quả Tính số có xác suất lớn nhất từ số ống dương tính đối với mỗi độ pha loãng Tra bảng MPN, suy ra số lượng vi khuẩn Coliforms trên...5.2 Các bước thực hiện quy trình định lượng Coliforms Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu Cân chính xác 10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác) Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml/225ml vô trùng vào bao PE (hoặc bình tam giác) chứa mẫu Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong... bàng 4.2 tra được số vi khuẩn Coliforms trong 1ml (g) mẫu là 2MPN/ ml (g) Ví dụ 2: Trong trường hợp pha loãng nhiều lần thì kết quả tra bảng sẽ nhân với số nghịch của số pha loãng ban đầu Độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 Số ống (+) trên LSB 3 2 1 Số ống (+) trên BGBL 2 2 0 Chỉ số dương tính trên môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 có kết quả là 2 Vậy ta có số vi khuẩn Coliforms trong 1ml (g) mẫu là... môi trường BGBL là 220, dựa vào bảng 4.2 có kết quả là 2 Vậy ta có số vi khuẩn Coliforms trong 1ml (g) mẫu là 2 103 vi khuẩn/ml (g) Bảng 4.2 Tra bảng MPN loạt 3 ống nghiệm 13 Số ống dương Chỉ số Nguyên chất 1/10 1/100 0 0 0 0 0 0 MPN Chỉ số Số ống dương MPN Nguyên chất 1/10 1/100 0,0 2 2 2 3,5 1 0,2 2 2 2 4,0 1 0 0,3 2 3 0 3,0 0 1 1 0,6 2 3 1 2,5 0 2 0 0,5 2 3 2 4,0 1 0 0 0,4 3 0 0 2,5 1 0 1 0,7 3 0... dịch pha loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích hợp Để có độ chính xác tối ưu, không nhúng pipet vào huyền phù ban đầu sâu hơn 1cm Không để pipet chứa chất cấy tiếp xúc với dịch pha loãng vô trùng Trộn đều bằng máy vortex trong 5 – 10 giây để thu được dung dịch pha loãng 10-2 (đối với các mẫu nguyên chất thì thu được dung dịch pha loãng là 10 -1) Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng