ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HÀ ĐĂNG CHIẾN NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ VĂN SƠN Thái Nguyên, 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Lê Văn Sơn Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS LÊ VĂN SƠN tận tình bảo hƣớng dẫn suốt trình triển khai, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy, Cô giáo – Các nhà khoa học trực tiếp giảng dạy truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô, đồng nghiệp bạn bè tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Tôi trân trọng biết ơn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn anh, chị cán nghiên cứu thuộc Viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở đào tạo thuộc Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Hà Đăng Chiến Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu bp Tên tiếng Anh Base pairs Tên tiếng Việt Cặp bazơ nitơ Cộng CS DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium bromide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GP5 Glycoprotein IPTG IsoPropylThio-β-Galactoside kb Kilo base kDa Kilodalton LB Luria Bertami Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy vi khuẩn MES 2-(N-morpholino)etansulfonic acid OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PRRS Porcine Reproductive and Hội chứng rối loại hô hấp Respiratory Syndrome sinh sản lợn Porcine Reproductive and Virus gây hội chứng rối loại Respiratory Syndrome virus hô hấp sinh sản lợn PRRSV RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v TAE Tris-acetate-EDTA TBS Tris-buffered saline TTBS Tween tris-buffered saline v/p X-gal Vòng/ phút 5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galacto-pyranoside Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC vi DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu: 3.Nội dung nghiên cứu: Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan PRRS 1.1.1 Khái niệm PRRS 1.1.2 Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn 1.1.3 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRSV) 10 1.2 Protein tái tổ hợp 15 1.2.1 Giới thiệu 15 1.2.2 Glycoprotein (GP5) 15 1.2.3 Sản xuất protein tái tổ hợp dựa ORF5 16 1.2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp 17 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii 1.2.5 Vector biểu pET 32a(+) chủng biểu BL21 17 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hóa chất môi trƣờng 22 2.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 23 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Tạo dòng gen GP5 24 2.2.2 Tạo vector tái tổ hợp mang gen GP5 25 2.2.3 Phƣơng pháp biểu tinh protein GP5 28 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 34 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 37 3.3 Biểu tinh protein GP5 E.coli 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 Kết luận 44 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen virus PRRS 13 Hình 1.2 Cấu tạo phân tử virion 15 Hình 2.1 Vector tách dòng pBT 20 Hình 2.2 Cấu trúc vector biểu pET 32a(+) 21 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc mang plasmid pBT-GP5 35 Hình 3.2 Kết qủa điện di sản phẩm colony- PCR khuẩn lạc mang gen GP5 35 Hình 3.3 Kết cắt kiểm tra tinh pBT-GP5 36 Hình 3.4 Kết cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) với enzyme cắt giới hạn 38 Hình 3.5 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn39 Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE 40 Hình 3.7 Kết phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag 41 Hình 3.8 Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sản phẩm 42 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra GP5 tinh sắc ký lực Ni-NTA 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tên thiết bị thí nghiệm 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pBT mang gen GP5 26 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt pET 32a(+) 26 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối gen 27 Bảng 2.7 Thành phần gel điện di protein (SDS-PAGE) 31 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), Việt Nam gọi bệnh “lợn tai xanh” (Blue Ear), đƣợc xem bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lợn đƣợc ghi nhận giới đƣợc ghi nhận lần Bắc Mỹ năm 1987 [23], lợn mắc bệnh thƣờng bị xung huyết tai, lúc đầu đỏ sẫm sau tím xanh Đặc trƣng bệnh, với lợn nái, PRRS gây hậu nghiêm trọng nhƣ sảy thai, đẻ non, lợn sinh yếu ớt, chết non, tình trạng bệnh âm ỉ gây rối loạn sinh sản nhƣ động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lƣợng tinh dịch, chất lƣợng tinh dịch kém, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thụ thai chất lƣợng đàn [3] “Lợn tai xanh” bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, Nidovirales gây Bệnh lây lan nhanh làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh [1] Hiện nay, PRRS trở thành dịch nhiều nƣớc giới, gây tổn thất nặng nề cho kinh tế PRRS lần đƣợc phát Hoa Kỳ vào năm 1987 [31], châu Âu (tại Đức năm 1990, Hà Lan năm 1991) châu Á vào đầu năm 1990 Tại Việt Nam, PRRSV đƣợc phát đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 phản ứng huyết học Gần đây, từ tháng năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy đợt dịch bệnh nhiều địa phƣơng nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm [8] Virus PRRS có tính thích ứng cao đại thực bào phổi Hệ gen PRRSV phân tử RNA sợi đơn dƣơng, cấu trúc tƣơng tự khung đọc mở (open reading frame, ORF) Coronavirus, gồm khung đọc mở gối lên nhau, mã hóa cho protein virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 35 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc mang plasmid pBT-GP5 Sản phẩm colony – PCR đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0.8% đệm TAE 1X, nhuộm gel ethidium 1% chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím (Hình 3.2) Hình 3.2 Kết qủa điện di sản phẩm colony- PCR khuẩn lạc mang gen GP5 Từ kết colony-PCR (Hình 3.2) cho thấy hai khuẩn lạc trắng đƣợc lựa chọn dƣơng tính với băng 650 bp điều chứng tỏ tiến hành Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 36 tạo dòng thành công vector tạo dòng pBT mang gen mã hóa cho GP5 Tiến hành tách plasmid để thu plasmid tái tổ hợp pBT-GP5 Trƣớc tiên, tế bào dịch nuôi cấy đƣợc thu nhận cách ly tâm thu tủa tiếp chúng đƣợc xử lý dung dịch Sol I (có tác dụng rửa tế bào), sau màng tế bào đƣợc phá dung dịch Sol II Khi DNA plasmid đƣợc giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn tiếp tục sử lý dung dịch Sol III pH môi trƣờng trở khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện DNA Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa cồn đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0.8% ( hình 3.3 (A) giếng 1) Cắt pBT-GP5 enzyme cắt giới hạn thu DNA GP5 tinh Tiến hành phản ứng cắt pBT-GP5 với enzyme SacI HindIII thành phần hỗn hợp sau đƣợc trộn lẫn vào đƣợc để tủ ổn nhiệt nhiệt độ 37oC thời gian để phản ứng cắt xảy hoàn toàn Hỗn hợp sau đƣợc tiến hành điện di gel agrose 1% (Hình 3.3 (A), (B)) (A) (B) Hình 3.3 Kết cắt kiểm tra tinh pBT-GP5 M: thang chuẩn 1kb hãng Thermo (A): cắt pBT enzyme giới hạn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37 (Giếng 1(A): plasmid pBT-GP5 gốc Giếng 2: plasmid pBT-GP5 sau sử lý enzymme cắt giới hạn) 1(B): điện di tinh sản phẩm DNA GP5 Qua hình 3.3(A) cho thấy giếng số có băng đậm sáng chiều dài pBT-GP5 Có hai băng plasmid tồn hai dạng xoắn siêu xoắn, siêu xoắn tốc độ di chuyển nhanh Ở giếng số có thêm băng so với giếng 1, điều sau sử dụng enzyme cắt xuất đoạn gen Kích thƣớc đoạn gen khoảng 650bp, đoạn gen mã hóa GP5 Tuy nhiên, để thu đƣợc đoạn gen cần tiến hành tinh từ gel agarose (Hình 3.3 (B)) Trên hình 3.3(B) kết sau tiến hành tinh GP5 từ gel agarose kít hãng “Thermo scientific’’ Kết cho thấy băng 650 bp trùng khớp với kích thƣớc GP5 có độ tinh cao, đảm bảo cho thí nghiệm 3.2 Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5 Mở vòng vector pET 32a(+) Vector biểu pET 32a(+) đƣợc xử lý enzyme cắt giới hạn SacI HindIII tạo đầu dính bổ sung với gen GP5 Hỗn hợp đƣợc ủ 370C sau tiến hành điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết hình 3.4 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 38 Hình 3.4 Kết cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) với enzyme cắt giới hạn Giếng 1, pET 32a(+) gốc Giếng pET 32a(+) sau đƣợc cắt enzyme giới hạn Ở hình 3.4 giếng có hai băng sáng plasmid có cấu trúc dạng xắn siêu xoắn, giếng thứ có băng sau xử lý enzyme SacI HindIII plasmid chuyển thành dạng thẳng Nhƣ vậy, việc cắt vector pET 32a(+) thành công Tiến hành tinh để loại bỏ thành phần phụ phản ứng cắt mở vòng pET 32a(+) để thực thí nghiệm  Ghép nối plasmid pET 32a(+) với gen GP5 tạo vector tái tổ hợp Để thu đƣợc vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa protein GP5 tiến hành phản ứng nối vector pET 32a(+) mở vòng với DNA GP5 Hỗn hợp phản ứng nối đƣợc tủ ổn nhiệt với nhiệt độ 220C thời gian Sau biến nạp vào chủng biểu E.coli BL21 để tạo chủng biểu mang vector tái tổ hợp Plasmid sau đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E.coli đƣợc cấy chải môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng sinh carbecicilin (100mg/ml) nuôi 370C 16 tiếng, lựa chọn khuẩn lạc đơn môi trƣờng LB đặc chuyển sang nuôi môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbecicilin (100mg/ml) nuôi 370C 16 tiếng Tiến hành tách plasmid tái tổ hợp tiến hành phản ứng cắt kiểm tra  Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pET 32a(+)-GP5 enzyme cắt giới hạn Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) có mang gen GP5 hay không Chúng tiến hành cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) enzyme cắt giới hạn SacI HindIII kết đƣợc kiểm tra gel agarose 0.8% (hình 3.5) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 Hình 3.5 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme cắt giới hạn M: thang chuẩn 1kb hãng Thermo Giếng 1: pET 32a(+)-GP5 đƣợc xử lý enzyme cắt giới hạn SacI HindIII Từ hình 3.5 (giếng 1) thấy sau xử lý enzyme cắt giới hạn SacI HindIII tạo đƣợc băng sáng kích thƣớc xấp xỉ 6kb chứng tỏ plasmid pET 32a(+) đƣợc cắt cắt giới hạn SacI HindIII chuyển thành mạch thẳng Một băng có kích thƣớc xấp xỉ 0,65 kb kích thƣớc GP5 sau cắt enzyme giới hạn SacI HindIII Nhƣ việc tạo vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5 thành công Chúng tiến hành biểu protein GP5 tế bào E.coli chủng BL21 3.3 Biểu tinh protein GP5 E.coli Biểu protein GP5 Quy trình nuôi cấy biểu gen đƣợc tiến hành theo mô tả phần vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 liệu, phƣơng pháp Theo lý thuyết GP5 đƣợc biểu số lƣợng lớn dƣới dạng protein dung hợp với Trx (gọi tắt TrxGP5) protein tạo thành có khối lƣợng phân tử khoảng 43 kDa Dịch nuôi chứa E.coli BL21 mang vector pET 32a(+)/GP5 đƣợc nuôi 16 tiếng sau tiếp tục nuôi biểu môi trƣờng LB lỏng 30oC có bổ sung chất cảm ứng IPTG nồng độ 0.5 mM Kết sau điện di SDS-PAGE (hình 3.6) cho thấy phân đoạn 43 kDa, Phân đoạn không xuất mẫu đối chứng cảm ứng IPTG Hình 3.6 Kết điện di SDS-PAGE M: Thang chuẩn hãng Thermo Giếng 1: E.coli BL21mang plasmid tái tổ hợp pET32/TrxGP5 Giếng DC: E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) (đối chứng) Tế bào E coli BL21 mang vector pET 32a(+) không chứa gen ngoại lai nên protein tái tổ hợp (đối chứng âm) Trên điện di (Hình 3.6) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 giếng (E coli BL21 mang pET32/TrxGP5) có vạch protein khối lƣợng khoảng 43 kDa đậm tƣơng ứng với kích thƣớc TrxGP5 mà đƣờng chạy đối chứng Trong giếng số E.coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET 32a(+) không mang gen GP5 nên không thấy xuất vạch vị trí có kích thƣớc 43 kDa Do đó, khẳng định protein tái tổ hợp TrxGP5 đƣợc tổng hợp tế bào E coli có kích thƣớc với kích thƣớc lý thuyết có hàm lƣợng lớn Để tiến hành tinh chế protein cần phải phá vỡ lƣợng lớn tế bào nhằm thu protein tổng số loại bỏ thành phần không cần thiết Kiểm tra biểu protein tái tổ hợp Western blot Để xác định protein, biểu tinh đƣợc GP5/His-tag, tiến hành kỹ thuật lai Western blot sử dụng kháng thể kháng trình tự His-tag với nồng độ pha loãng 1:1000 lần Kết cho thấy dịch chiết tế bào thu đƣợc băng protein có kích thƣớc 43kDa (hình 3.7) Chứng tỏ GP5 đƣợc biểu thành công tế bào E.coli BL21 Kết việc sử dụng cột sắc ký lực Ni-NTA cho phép tinh đƣợc protein tái tổ hợp GP5 Hình 3.7 Kết phân tích Western blot với kháng thể anti-His-tag (pha loãng 1:1000 lần) M: thang chuẩn hãng Thermo 1: phân đoạn thu mẫu Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 (-) đối chứng âm Khảo sát nồng độ imidazol để tinh chế protein tái tổ hợp Cột tinh chế protein đƣợc thiết kế có giá thể gắn với ion kim loại Ni2+ nhờ phức hợp cua, ion có lực lớn với vòng imidazol histidine Khi cho protein tổng số qua cột, protein có chứa amino acid histidine đƣợc giữ lại cột tƣơng tác imidazol - Ni2+, protein không chứa vòng imidazol histidine khỏi cột Ái lực ion kim loại protein mạnh hay yếu phụ thuộc vào protein có nhiều histidine không histidine có nằm sát hay không Nếu protein có nhiều histidine histidine nằm gần liên kết chúng với ion kim loại mạnh Vector biểu pET 32a(+) đƣợc thiết kế cho sau dịch mã protein tái tổ hợp có mang histidine (hexa histidine) nên chúng có lực cao với ion Ni2+ Khi cho mẫu chứa protein tổng số qua cột protein chứa histidine khỏi cột, lúc cột protein có histidine liên kết với ion Ni2+ Nhƣng mức độ liên kết lại khác protein chứa nhiều amino acid histidine liên kết với ion kim loại mạnh ngƣợc lại Hình 3.8 Khảo sát nồng độ Imidazol để tinh sản phẩm (+): đối chứng dƣơng; M: thang chuẩn hãng Thermo Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 Giếng 1: 20 mM imidazol; giếng 2: 40 mM imidazol; giếng 3: 60 mM imidazol; giếng 4: 80 mM imidazol; giếng 5: 100 mMimidazol Khảo sát nồng độ imidazol mức 20mM đến 100mM thấy, nồng độ 100mM imidazole thu đƣợc băng sang đậm Chúng lựa chọn nồng độ 100 mM imidazol thu đƣợc lƣợng protein tái tổ hợp lớn, tốn hóa chất dễ dàng để loại muối thẩm tách Tinh protein tái tổ hợp GP5 Do protein nằm pha dịch tế bào nên sau siêu âm phá tế bào tiến hành ly tâm loại bỏ phần xác tế bào lắng xuống, thu lấy phần dịch cho trực tiếp qua cột sắc ký lực Ni-NTA Do GP5 đƣợc biểu hệ thống vector hiểu pET 32a(+) nên protein đƣợc tạo đƣợc dung hợp với trình tự gồm amino acid histidine Trình tự His-tag giúp protein tái tổ hợp kết bám vào cột sắc ký, protein khác bị loại bỏ băng dung dịch rửa chứa Imidazol 100 mM Kết thu đƣợc điện di SDS-PAGE cho thấy protein GP5 tái tổ hợp đƣợc thu lại dạng tinh sạch, có kích thƣớc 43 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc tính toán lý thuyết Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 Hình 3.9 Kết điện di kiểm tra GP5 tinh sắc ký lực Ni-NTA Kết điện di SDS-PAGE GP5 tinh M: Thang chuẩn hãng Thermo Giếng 1: GP5 tinh imidazol 100 mM Giếng 2: đối chứng (+) Giếng 3: đối chứng (-) Trên hình 3.9 cho thấy với nồng độ 100 mM imidazol protein tái tổ hợp thu đƣợc với lƣợng lớn tinh Nhƣ thấy, để tinh chế protein TrXGP5 dùng imidazol với nồng độ 100 mM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Gen GP5 đƣợc tạo dòng thành công - Vector tái tổ hợp pET 32a(+) mang gen mã hóa cho protein GP5 đƣợc thiết kế - Protein tái tổ hợp GP5 đƣợc biểu tinh cột sắc ký lực Ni-NTA với kích thƣớc 43 kDa Kiến nghị Với kết thu đƣợc nhƣ trên, đƣa số định hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: - Tiếp tục thử nghiệm protein tái tổ hợp làm làm nguyên liệu để sản xuất hợp chất có dƣợc tính sinh học nhƣ vaccine hệ - Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên GP5 để tạo kháng thể đặc hiệu nhằm chuẩn đoán nhanh bệnh dịch PRRSV Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Tiêu Quang An, Nguyễn Hữu Nam (2011), “ Xác định số vi khuẩn kế phát gây chết lợn vùng dịch lợn Tai xanh huyện Văn Lâm tỉnh Hƣng Yên năm 2010”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(3), tr 56- 64 Bùi Quang Anh, Hoàng Văn Năm, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Nguyễn Ngọc Tiến (2008), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (Bệnh Tai xanh), Nxb Nông nghiệp - Hà Nội, tr 7- 21 Đặng Xuân Bình, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Hà, Lê Bá Hiệp (2010), “Khảo sát lƣu hành vi khuẩn Pasteurella multocida gia súc số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 17(2), tr 53- 57 Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Tùng, Nguyễn Đăng Thọ, Tống Hữu Hiến (2011), “Điều tra lƣu hành Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) đàn lợn số tỉnh Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr 21-30 Cục Thú y (2008), Báo cáo chẩn đoán nghiên cứu virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến 5/2008, Hội thảo khoa học phòng chống Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn, ngày 21 tháng năm 2008, Hà Nội Nguyễn Tiến Dũng (2011), “Những vấn đề thời Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr 5- 11 Đậu Ngọc Hào, Văng Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long, Tiêu Quang Ân (2008), “Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 môt số tỉnh nƣớc”, Khoa học kỹ thuật thú y, 15(5), tr 14-20 46 Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Hữu Nam (2013), “Nghiên cứu chọn chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) để sản xuất vaccine phòng bệnh Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 20(1), tr 5-15 Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hƣơng, Trần Quang Vui, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Bá Hiên (2009), “ Phân tích gen M mã hóa protein màng vỉus gây PRRS Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc, giới”, Tạp chí Khoa học phát triển, 7(3), tr 282- 290 10 Lý Thị Liên Khai, Võ Thị Cẩm Giàng (2012), “Khảo sát tình hình nhiễm ghép Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản với dịch tả heo tỉnh Bạc Liêu Sóc Trăng”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 19(6), tr 29- 39 11 Phạm Ngọc Thạch (2007), Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (bệnh Tai xanh) số đàn lợn tỉnh Hải Dương Hưng Yên, Hội thảo khoa học Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản bệnh liên cầu gây lợn 10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp, Hà Nội, tr 25-34 12 Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen - nguyên lý ứng dụng, NXB KHKT, Hà Nội 13 Tô Long Thành (2007), “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 14 (3), tr 81-88 14 Nguyễn Nhƣ Thanh (2007), Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản, Hội thảo PRRS bệnh liên cầu khuẩn gây lợn tháng 10/2007, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội 15 Cao Văn Thật, Trần Thị Dân, Trần Thị Bích Liên, Thái Quốc Hiếu, Nguyễn Văn Hân, Hồ Huỳnh Mai, Nguyễn Thị Mến (2012), “Mức độ nhiễm virus PRRS ảnh hƣởng nhiễm ghép PRRSV-Leptospira lên suất sinh 47 sản heo nái tỉnh Tiền Giang”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 19(6), tr 17- 23 16 Nguyễn Ngọc Tiến (2011), “Tình hình dịch lợn Tai xanh (PRRS) Việt Nam công tác phòng chống dịch”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 18(1), tr 12- 20 17 William T.Christianson, Han Soo Joo (2001), “Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, (2), tr 74- 87 Tài liệu tiếng Anh 18 Albina E., Madec F., Cariolet R., Torrison J (1994), “Immune response and persistence of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected pigs and farm units”, Vet Rec 134, pp 567-573 19 Alasdair D I., Bruun R T (2000), Promoter, patent WO 0078975 20 Anonymous (1992), “Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS or blue-eares pig disease)”, Vet Rec 130, pp 87-89 21 Ansari I H., Kwon B., Osorio F.A., Pattnaik A K (2006), “Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respirattory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibodies”, J Virol 80, pp 3994-4004 22 Collins J E., Benfield D A., Christianson W T., Harris L., Hennings J C., Shaw D P., Goyal S M., McCullough S., Morrison R B., Joo S H., Gorcyca D., Chladek D (1992), “Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR- 2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs”, J Vet Diagn Invest 4, pp 117- 126 48 23 Han J., Wang Y., Faaberg K S (2006), “ Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus”, Virus Research 122(1-2), pp 175-183 24 Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Tang J., Wang X., Ma S (2006), “Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice” Vet Immunol Immunopathol 113, pp 169-180 25 Jiang W., Jiang P., Wang X., Li Y., Wang X., Du Y (2007), “Influence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 glycoprotein Nlinked glycans on immune responses in mice” Virus Genes 35, pp 663-671 26 Kegong Tian, Yu X (2007), Emergence of Fatal PRRSV Varants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique Hallmark, PloS ONE 2(6) International PRRS Symposium 27 Lin P K T., Brown D.M (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing deGenrate bases and their use as primers in the Polymerase chain reaction”, Nucleic Acids Res 19, pp 5149-5152 28 Meulenberg J J., Petersen den Besten A., de Kluyver E., van Nieuwstadt A., Wensvoort G and Moormann RJ., (1997), “Molecular characterization of Lelystad virus”, Vet Microbiol 55, pp 197 – 202 29 Montpetit M L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M V (1992), “OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods 36, pp 119-128 30 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular cloning a Laboratory Manual, 3rd, ed Cold spring harbor laboratory press, cold springhabor NY 49 31 Wensvoort G., Terpstra C., Pol J M A (1991), “Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus”, The Veterinary Quarterly, Vol 13, pp 121-130 Internet 32 http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi 33.Nguyen Van D., Ken I., Phan Xuan T (2010), Nucleotide Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, GeneBank databases Acc No HQ540655, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/311909479, ngày 17/10/2010 34 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Hội_chứng_rối_loạn_sinh_sản_và _hô_hấp_ở_lợn_(PRRSV)