Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV 1 ở hà nội, viêng chăn (2007 2011)

118 470 0
Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV 1 ở hà nội, viêng chăn (2007  2011)

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)Nghiên cứu ứng dụng mPCR để xác định phân týp của HIV1 ở Hà Nội Viêng Chăn (2007 2011)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ HIV (Human Immunodeficiency V y y Sy AIDS (Acquired Immuno V, ố T S y ố giai ủ ố ố , y , V ữ ụ y N ữ S UNAIDS/WHO 30 tri thuố o ng 76 tri q it V/ [143] D S ặc tr , V i b nhi 30 y V q tâm lớn toàn c u V V-1 HIV-2, y , ò ốq ố ự T yP V-1 có ặ G phân týp (Sub - y - R V-1 (non - M, non - O , :M M P P O ỉ y , 10 V-1 ỉ í y y , ặ M ,O O P M N P í y : ,N [16], [65], [114], [115], í T yT , y V-2 S ặ N w N [132], p n nay, theo n AIDS [139], [140], [141], [142], x t hi y q ố M Kỳ [95]; 1981 N , B, , G; , E, , G, ,J , J, K K ặ [28], [122] M ố P A4, A5 [50], [120], [128], [145] B [113] L ò 1, B’ 1, 2, 3, ặ B-Thái [120], [138], [139]; 51 ể x [34] Đ ặ ố y y , E ủ ớ, ò Đ N Á í ; y, í y y B T P ủ ì q ữ y y ụ Bắ Mỹ, T y  , í B ữ ằ q y; y L , E ữ ố í q ứ ì ụ [55], ố , V-1 ự ự quan ự , ố S q q [68], [113], [130], [148] Vì kh í V-1 thích nghi lây tr y B ỗ ,k q , í , ò , ể í í ặ y x ể ELISA p týp HIV ặ Mobility Assay (HMA), ỹ kỹ V-1, kỹ thu t Heteroduplex yP R multiplex PCR (mPCR), kỹ ỗ thu t gi i trình tự gen (Sequencing), phân tích loài (phylogenetic), V3 ủ x týp ủ cao Kỹ ứ , í x ò ì yy , y í V-1 ứ ỹ ự ể V-1 T y x mPCR ể ố ể , ự , , í, ặ ỹ í ủ V L ò N L ể ự y, ỹ ự Vì v y : “Nghiên cứu ứng dụng multiplex PCR để xác định phân týp HIV-1 Hà Nội - Viêng Chăn (2007- 2011) ” ụ : Tối ưu hóa qui trình multiplex PCR để xác định phân týp chủ yếu HIV-1 khu vực Hà Nội Viêng Chăn Xác định phân týp chủ yếu HIV-1 đối tượng khu vực Hà Nội Viêng Chăn kỹ thuật multiplex PCR CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS toàn cầu V y y S ỷ, ì ặ í 1959 1981 mã ặ y y, V/ S y S y Mỹ x ố ắ S ữ Theo UNAIDS/WHO, ố 34,2 V Z re, châu Phi [151], ữ 1983 , [95] ẻ M V, V [38] Cho ố q ố 2012, 16,7 í ụ ữ, 3,4 [140], [141], [143] ản 1.1 Tóm tắt đại dịch HIV/AIDS toàn cầu năm 2012 34,2 [ 31,8 – 35,9 ] T n s Số ố N V P ụ ữ Tẻ 16,7 [ 15,7 – 17,9 ] < 15 T n s N V N 2011 T ẻ T S 2011 30,7 [ 28,6 – 32,2 ] 3,4 [ 3,1 – 3,9 ] 2,5 [ 2,2 – 2,8 ] 2,2 [ 2,0 - 2,4 ] < 15 330.000 [ 280.000 – 380.000 ] 1,7 [ 1,6 – 1,9] T n s N Tẻ < 15 1,5 [1,3 – 1,7] 230.000 [ 200.000 – 270.000 ] *Nguồn theo: UNAIDS (2012) [141] 1.1.1 T nh h nh nhi m HIV IDS Ch u Á ự ắ , , S châu Phi [141] N ữ 1984 châu Á v T T [65] Đ N ố 60% 4,26 ỷ dân) [150] Châu Á khu vực b V/ N , K y, í ố , ỷ ặ 0,2% , Pakistan ỷ ắ ì B q ố Ấ Đ , V ố V Philippine Châu Á 370.000 330 000 [140], [141], ỷ Thái Lan, [137] Á, S ốq ố / Đ ng Nam Á V Trung Q ố ố yể ố cao [142] Ấ Đ q ố ,x ố ứ ự V 2,1 ứ [143] 1.1.2 T nh h nh nhi m HIV Việt Nam T T B y ố p , , xé ỉ ự 1990 y, V V í 1998, 77% ố x , ì V ỉ V/ 2011 , q ố S x ố [1] 100% 98% ố q , y , Tì 2011 ố 14 125, ố S , , thành V V 432 ố ố ỉ giáp L y ố ắ T y Bắ ố , x N hí Minh Đ ố Q ỉ V xé S 413 [1] i u đ 1.1 Tình hình HIV/AIDS t von AIDS qu c c năm *Nguồn theo: Bộ y tế Việt Nam (2012) [1] 1.1.3 T nh h nh nhi m HIV Lào ò Theo t ì ụ -B y ố 2012, ố í 942 15- 49 V 360 ố 670 , ố ì Bể ố ỉ , ỉnh Champasak 9% [85], [86] 0,2% xé hân AIDS báo cáo 120 ố ố S S, tỷ 2011 ố , 10.350 q yq , í y L S y V, 650 q Ướ B V 290 x S L , 1990 Tí vào V/ HIV/AIDS có ồ1.2), [101] HIV/AIDS Savannakhet 34% h ỷ ố Viêng V 33% ứ3 i u đ 1.2 Tình hình HIV/AIDS t von AIDS qu c c năm *Nguồn theo: MOH, CHAS (2011) [101] P ố V y 2011 y: y 87%, 6,8%, ỷ y q ì y ụ y y y , ố q ì ỷ V ẹ 5%, ỷ 3%, m HIV ụ ỷ õ lây V 0,1% kim t y y 0,1% [101] 1.2 N u n c xuất xứ củ HIV HIV-1 HIV-2 ố q ặ deficiencyvirus (SIV) [24], [65], [67], [98], [115], chúng ủ Retroviridae P [112] y Simianimmuno ữ ể ặ ủ Lớp III Lớp I Lớp II , è Đ ố Cá Đ Đ ặ ò i u đ 1.3 Nhữn virus thuộc họ Retrovirid e có th Côn trùng ây bệnh cho vật chủ *Nguồn theo: Patric J, et al (2005),[112] y ủ V [31], [131], [132], [149], [152] ố ,x xứ ản 1.2 N u n oại N u n Nhóm HIV-1 B O, P SIV K ỉ t) Phía tây trung Phi SV K ỉ ặ x Tây Phi y SV z xứ Xuất xứ châu Phi SIVcpz (Tinh tinh) M, N c M, N HIV-2 x c xuất xứ phân loại củ HIV V-1 x Trung Phi ố T nhóm xứ T ng Phi, ò nhóm O, P SV phía Tây Trung Phi N ữ MR ứ ủ í V x ự ồ ố [65], [133], [134], [149], theo W yM ự (2009), [149], phân tích ì ự G , P ủ S V z/ V-1 SIVsm/HIV-2, y ằ ự E ữ ủ ủ SV z , ữ ữ P , vùng gen phân : 1265 658-1679) HIV-1/M P 1795 1627-1900 HIV-1/O P 1827(1680 -1917) HIV-1/P vùng gen Env phân hóa 1845(1766 -1912), [134] HIV-1/N P m 1932 (1876-1968) SV P 1686 1525- HIV-2/ P 1905 1857-1949) HIV-2/B P 1914 1868-1955) 1811) 10 N ySV z í 969 a thành HIV-1/M x ố ủ V-1/M tính trung bình 1795 SIVs x q x q ì q yể , ố ì ự 1: B , [21], [62], ủ 98% [4], , y yể , ủ 1981 ữ SV ữ [62], x y x ớc ủ , ắ , [115], y ể ự ể ữ ỉ ì ủ , ố [35], S B A Hình 1.1 Con người sinh hoạt tiếp xúc với Retrovirus , B , ố *Nguồn theo: Hahn B H et al (2000), [62]; Peeters M et al.(2012), [115] 104 56,6 – 61,60 , õ 540 680 K ể q ố ự y ới ph n ứ ắ P R21 ẹ ứ ụ q ặ ố ặ : B-SPEC, E-SPEC, F-SPEC, C- SPEC 61,60 ố y ủ BEANCH, mồi xuôi, mồ ì ố N T ố ụ ớ PCR2.1 í ố y b, 645 bp ố 63,90C; 64,80C Ph n ứng PCR 2.2 x ặ A5’- A3’, E5’- E3’, G5’- G3’ , E, G 644 P R Để ố ứ P R 2, P R 1, ứ 650C, Vớ ố y ố y , ự y ứ ố ự y 680C 54 N ố ố ố P R Vì ố y 56,60C 61,60C Vớ N , 606 16 ố ể í , 45 , 554 y , 63,9 63,9 ự ữ ứ 4.1.5 Kết t m thời gian tr nhiệt độ gắn m i T y ì S ắ ì í y ì q ốq , ể ì õ T q y y 40 ứ ủ ủ ứ ì ắ 30 í 19 y ì P R y 90 27 , ắ P R , 18y [8] ố 30 y, 105 45 y, 60 y, 90 y ứ y, Để ì ỗ ứ ứ ể ặ 4ố ố 30 y ì ứ y, 45 ố y, 60 y, 90 ố ứ ặ , 16 ố ứ , ố P R ố ắ ắ : 30 ố y, 45 giây, 60 giây, 90 giây T 30 có T DNA rõ, 1/3 có 60 y 45 N ứ õ T õ, 1/3 N N y, gian trì 60 giây, ặ õ Vì ự 60 giây ặ 63,90C N 1/3 õ, 2/3 T N N ắ q y N ó , 1/3 3/3 90 giây có 2/3 ứ ây có 1/3 y, ữ y ì y cho ắ ứ 4.1.6 Kết tối ưu hoá n ng độ MgCl2 Nồ Nồ M M ứ M 2+ ặ ứ , M ứ q ứ í 3,0μl (50mM) PCR [8] ứ ể í ứ ứ , , ủ y Trong trình tố ố T q N ặ Nồ q ì ụ cho ố ủ ủ q í y M M l2, 1µ ứ ố ừ1 N ứ q 50 M 3,5µ /25µ í ứ , , ố ỉ 106 ủ ể í Nồ M 25µ y 50 M õ M ứ K ứ ụ ỗ 30 , ặ ụ 720C 720C q ự ứ ứ ự ứ ặ P R P R í ố ì 1% S P R õ é g , P R2.1 ứ ằ q y ự é y ứ 1-2 853 ụ ữ ố4 y P R1 , 1; , ể ể yố ể ủ y S q ụ P R ự 778 3,5 µ (50mM) 2,5μ Vì ủ T q- N Đ ứ 2,5μl (50mM) , , ừ1 ứ ỗ N ể í ứ MgCl2 ỗ ố ứ 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5µl /25µ N M ứ [8] 4.1.7 Kiểm tra qui tr nh tối ưu S ố ể q ì q y ì ủ q ủ y ứ ì P R, húng 10 ố q sau: Vớ P R2 í 645 bp, 9/10 ứ q P R2 , ố 9/10 x ố x ỉ ò 1/10 N 5/10 N x ặ N õ y 107 Vớ ứ í P R2 554 7/10 q , 10/10 x ố N x ặ 10/10 N y ứ ụ y ủ l P R2 q y ì ố ủ T q ỗ ò ì ố Đ y ố ứ x ì yể , E, G y ủ ứ ự y ứ N í ự P R23 ứ V x ỉ q ( ể ứ ự ò ì ồ31 N V-1 ì , P R2 , ụ P R2 ò y yể P R2 ự ể P R2 P R1 í Vì ứ í ứ q õ í y q ố ủ ứ ứ ặ P R2 yq ự ì N P R V au: B BE O5’ í ứ Ở ứ P R1 í ặ , , N ứ [78], , N y ự í L Vứ V P R2 B N ,L T q ố ự A5’- A3’ ặ E ặ , ặ B, ố [11], [18], E ặ ể ặ ứ y yể E3’ ặ ặ P R21 ,T ò ò , E, G ặ ì B-SPEC, C-SPEC, E-SPEC, F-SPE , V ằ BE O3’ ằ ặ 41 G 5’- G 3’ ặ R 01- E , ì , ặ y E 5’G 108 ò K ứ q P R20 y ỉ ự õ P R21 , , ốí í P R21 ặ ì ủ B-SPEC, ứ , E, G ự -SPE , E-SPE , -SPE ể B, C, D F R 441 B ì ứ ể phân bi ặ P R21 P R2 với ặc hi B D Để gi m t i cho mPCR gi m công tố 01 nghiên cứu n ứng, nhóm cho phân týp B cho phân týp D, s n ph m phân t p D d phân bi n di nên b sung cho phân t p D vào s n ph m chung B D s x y m t thêm ỉ ng h p, n u có s n ph m phân t D, n u s n ph m phân D5’– D3’ ặ typ B Cặ x 350 ụ ì , q x B N y P R1, ò ứ ựq ì ủ P R , E, G N ố í T 41 ằ P R20 ì ụ P R 21 ì B, B, ằ P R22 , , ồ31 Thành ph n hỗn h p chung cho m t ph n ứng PCR với thể tích 25μl ố : Buffer Taq X10 (Invitrogen) 2,5μl, dNTP mix (10mM) (Invitrogen) 0,5μl, MgCl2 (50mM) 2,5 μl, ỗ ứ (Invitrogen) 0,2 μl; N N ủ 25 μl í ò P R μl cho PCR; ò ồi (10 pmol) 0,5 μl; Taq DNA-polymerase y 1μ x N P R1 ể í Vớ P R E 5’- E 3’ ặ ì ặ A5’- A3’ ặ E, ặ G 5’- G 3’ ặ , ặ 109 phân týp G Vớ P R SPE ì ặ ể ì B-SPEC, B, C, D F T x ằ B, P R22 týp D ể ặ D5’ – D3’ ặ ể : u 950C phút + B ớc bi n í + 35 chu kỳ luân nhi t (mỗi chu kỳ - 950 45 - 63,90 ớc) gồm: y n bi n tính) - 720 n gắn mồi) 1,5 n t ng h p) + B ớc t ng h p b sung k t thúc 72o S E í 80 V, ủ y 1: “Tố ủy phân týp K í q ủ HIV-1 ố , q T x P R ể x N ì V ” ủ , : , ụ ì ụ ể í ỉ ứ ứ ự ò , ụ ứ , 1ố 50μl) x , ụ ự ể ỉ 25μ 4oC V-1 ụ ố ữ 60 N ểx N ứ , 1% , ì 10 P R N 100 ì B ì q -SPE , E-SPE , - í q ụ 110 4.2 Ứn d n quy trình mPCR x c định phân týp HIV-1 c c đ i tƣợn khu vực Hà Nội Viên Chăn q Sau tì ụ ì ố , 280 K q ự y, q y ì y 93,57% T N 1,07% S í N P R2 697 ứ 441 N x ứ P R20 x 257/280 554 ứ E í 644 V 262/280 y 91,78% 1/280 ứ ứ 1,07% N 1,07% x ớ N í í P R22 týp B ò 18/280 6,43% x kỹ thu t mPCR phân týp khác nhóm khác không thu c ph m vi phát hi n cặp mồi nghiên cứu d ng tái t h p Tuy nhiên k t qu thực t í t hi u su t cao ph n ứng mPCR V-1 so sánh với ng di truy n phức t p củ ỉ cho k t qu 84,8% [53], tác tác gi khác Chính tác gi gi o qui trình Fumihiro [53], [54], Y n cho k t qu x V-1 t 92,7% [11] Nghiên hi u su t phát hi n phân týp HIV-1 tới 93,57% ì ự N y n Th Bích q P R y t 111 Bảng 4.1 Một s kết nghiên cứu phân týp HIV-1 mPCR Chẩn đo n dƣơn tính Chẩn đo n âm tính (X c định) (Chƣ x c định) S lƣợn (%) S lƣợn (%) 11 11 (100) 00 33 28 (84,8) (15,2) 260 241(92,7) 19 (7,3) 73 73 (100) 00 280 262 (93,57) 18 (6,43) T c iả Cỡ (năm n hiên cứu) mẫu Fumihiro (2002), [54] Fumihiro (2005), [53] N y Y (2003), [11] L T V Bí T (2010), [9] ứ Nghiên y (2011) Vớ q , ứ y L y ự ể 10 ò ể ứ q ủ 3130XL, ụV B K q x G q y B ụB x ỹ 05 01 ể V-1 nên nhóm ngh x ủy ụ P R ủ ì ể V-1 ứ ứ ứ P R ằ E ố E 03 , 01 ì E ự y B Sy , í ì ố ằ ự ủ phân 112 Q ố 10 ứ ì ự ố y ự Đ N q ể ứ ủ ự ố 91,78% K x N V N 2003 T N 248 V ự V-1 ằ ỹ y T 18) P R q ủ V-1 y ủ N y T N Bí Y Bí Y [11], ứ [11], íM P R B T [6], [9] Đ y ố x , ự ủy N T ỹ 91,9% 239/260 ì ố V T , q ứ V-1 V-1 ; phân týp E (CRF01-AE) y Q ỳ ,L V x x q N q 01 y ủ ứ T y P R ò K q ứ q ự 03 P R ể ự B ủ B ố hai ì q ì N E R 01- E x y y x ứ , 01 q y 2002 [54] y E, y ố ủ P R N ì ự K y ủ ể Á [61] [78], [91], [148] ặ ự y ò E N y q ố R 01- E P R ì q P R E ể í K R 01-AE E tron B E T S G ứ , 14 P R ố 260 L 41 241/260 98,7% , 8,1% 21/260 E 113 N V 2004 N E Ry ố q ự [36], ụng ma tuý 19 y 11 V N ố 11 q ố , 6/11 55% R 01- E, 5/11 45% ỉ ứ B, ò 19 2/19 10,5% q ố R 01-AE, 17/19 phân týp B (89,5%) M ứ ố ố í P ò ủ N B ì Đ HIV-1 ằ ì ự K , ự ủ ứ z w q CRF01- E, 4/295 1,4% B/C) N 2009 [18], q HIV/AIDS y x ủ y 290/295 98,3% B, 1/295 0,3% y ứ V N y ủy phân týp CRF01-AE ứ ự [113], q Bang kok, Thái Lan 2217 E, 13,5% B’ 5,1% ự [135], x 86,5% Takebe Y y ố M y – My ủ , N mP R ì Pauli N x y My N ứ 59 1999-2000 T V ự V-1 í , ụ y ố K , ỹ q y 45,8% phân týp CRF01-AE; 25,4% phân týp B, 13,6% phân týp C, ò 15,3% N 2006, Y y T Q ố T Z ự [155], , RN ứ 321 1989-2004 P17 ỉ V , , ỹ ì ự N P R 114 K tí q y 53% / R 07-BC/CRF08- B ; 40,5% R 01- E 90,9% 6,5% / R 07-BC/CRF08-B ma túy, 85,4% CRF01- E y M L ố ứ R 01-AE 75 % y ự Á, y ủ ằ ứ ự Đ í N ủ T L , T , ì R 01- E 97,3% V ố 420 y , AE 12 2,9% q ự ỹ P R ự í ố ò 0,5% V , ữ ứ ự N phân týp E (CRF01- E , ể y q ố ự ự phân bố phân týp HIV-1 21 , Bắ R 01- ự V-1 98,57% Bắ , V-1 ự y ự ữ ố ủ ự , K ự Đ ứ với mục tiêu V ể 398 94,8% B ứ ) Đ B ự [118] ự N L , ắ iB P L , T ủ y q T ủ N m Á, Piyanot Wirachsilp c ng [117], 2,7% T S ự nghiên cứu 282 m u củ 97,3; 94,8% 66,8% T Nam Lào ố Bắ y CRF01-AE V CRF01- E Á [78] ứ Indonesia í ụ N S y q ì ự Đ , 97,2% y q y [117], [118]; N B T x ữ N V 138/140 2/140 x ằ 115 P R 1,43% K ự V 124/140 88,57% V-1 E 119 85% N (CRF01- E x 03 , 01 0,71% B N N ặ ể 0,71% y V-1 ủy ủ ự V ằ R 01E 2,14% x V K E ò x 01 E x E ự Đ N Á 16/140 11,43% P R ự x N ỉ 19 Đ ỏ, V-1 N ? N ữ x R 01- x 02 1,43% y ặ ứ V ứ ằ P R phân týp khác nhóm khác không thu c ph m vi phát hi n cặp mồi nghiên cứu d ng tái t h p mớ Đ y nghiên cứu sinh triển khai áp dụng sau v y cứu hi n t kh i quy ể m t thách thức cho N c ph n lớn m u c phân tích ti p gi i trình tự gen vùng gen env hoặ u ki n sau V phân bố phân týp HIV-1 ố ỉ có 3.20); Sự , E ,B í y ủ P R ữ T ố í R 01- E ủy y ò y ằ y ể ng nghiên cứu (b ng nh x ằ V u ki n hi n t i M t số m u không phát hi V-1 mPCR s Đ t qu nghiên y x ố í y y í y [18], [19] y ỉ 116 E R 01- E x ằ mPCR S V-1 19) y ố ự ĩ ủy ,B E ỉx ứ í ằ ỗ N ò ủ V-1 ự y x N ỉ x í P R ứ y ố ỏ x q ủy q ự ựx V-1 t ự , ỹ , ố ủ ỉ p í ủ N 14% P R, y, ỹ ủ ự , B, P R K ; K í y ằ ố ự V x 18% L [...]... 7,4%; phân týp 3,7% phân týp týp B 277 65%, phân týp B 32,9%, phân týp C 2,2% T phân týp Lebanon, T phân týp 27 phân týp D 3,7% 1. 5.5 Đặc điểm ph n týp HIV- 1 ở Liên Bang Nga P N V -1 L 2009, Thomson M.M, ủ HIV- 1 k q S P B N ự [13 6] , phân tích 10 2 89,3%; phân týp A phân týp A [19 ], [27] tra í y y 2006, B 9,7% và phân týp F1 1% 1. 5.6 Đặc điểm ph n týp HIV- 1 ở châu Úc P V -1 B L, châu Úc, E 9 ,1% ; ự [63],... phân týp phân týp x N t phân týp 1, 3% ụ , sự phân týp 3,0% T í Saudi Arabia, 16 9 , m 36,7%, phân týp G 24,3%, phân týp B 18 ,3%; phân týp D 4,7%; phân týp A 4 ,1% ; CRF02-AG 3,6%; CRF25-cpx 2,4%; CRF43- 02G 4,7%; ò 1, 2% , q í í Iran, 59 q 40,7%; phân týp B phân týp 35,6%; phân týp D 6,8%; phân týp C 3,4%; phân týp G 3,4%; 1, 7% 8,5% T Turkey, í R 02- G q phân 70,4%; phân týp A 14 ,8 %; phân týp F1 7,4%; phân. .. 19 95, Salminen, ặc bi t là kỹ thu t t phá mới làm rõ v chi u dài 19 99 danh pháp phân lo i HIV phân týp y ủ của b c thống nh t [12 2] 17 1. 4 .1 Các phân týp HIV y, HIV 1 c chia thành 2 týp: HIV- 1 và HIV- 2, HIV- chia thành 4 nhóm: M, N, O, P [16 ], [65], [11 4], [11 5], [13 2], nhóm M chia thành 10 phân týp: A, B, C, D, E, F, G, H, J và K [28], [12 2]; ừ p ố phân týp M G; ,B , J, K ớ [12 8], A4 [14 5], A5 [12 0],... HIV- 1 ở châu Mỹ N ằ 2 011 , ự [75], Junqueira DM, de Medeiros RM y B Mỹ x y ừ ể 19 64 19 50 -19 67) Phân týp B c q ố Mỹ V g Bắ Mỹ phân týp B 10 ,6 % [70] V V N Caribean Mỹ phân týp B 89,4%; Trung Mỹ phân týp B B [37], [39] F [15 ], [43] 22 1. 5.4 Đặc điểm ph n týp HIV- 1 ở Trung Đông T Đ ữ HIV ự y ít [56], ằ ứ T Đ ố ủ 2 011 , G phân týp M ự z V -1 P , í ự ốq ố ia ,x 3 01 85,4%; phân týp B 8,6%; CRF02-AG 1, 7%; phân. .. í 14 1 ểx q B 74%; 3,54% 513 G 1, 44% N ừ 2003, V -1 12%, 2 012 , Hawke, K.G 2000 – 2 010 , ể 23 V -1 q Nam Úc, B 76% 8%, R 01- AE 10 %; CRF02 - G 3% 2% 1. 5.7 Đặc điểm ph n týp HIV- 1 ở ch u Sự phân ố phân týp HIV- 1 ự ữ í châu Á , y q ố ể ồ ự châu Á T Ấ Đ ủy ữ ớ 95 - 97% B Ấ Đ [77], [82], y [10 7], [12 6], [15 4]; các q ố Bangladesh [12 7], Nepal, Myanmar, T : Q ố , Đ N B [14 8] T T Q ố , í ì ụ ồ ớ phân týp: CRF 01- .. .11 1. 3 Cấu trúc HIV 1. 3 .1 Đặc điểm cấu trúc của virus HIV ớ ố í ể , V í ỉ 80 -10 0 ồ 3 ớ ì ừ (Hình 1. 2), [2], [49], [83], [11 2], [11 6] 1. 3 .1. 1 Lớp bao ngoài (envelope - env) Lớ é , ắ y y 16 0 y còn V ắ 16 0 ồ y y ủ ể + Glycoprotein xuyên màng có tr q 41, í ì ủ 41 ắ x ớ 12 0, 41 ỗ x ò 1. 3 .1. 2 Lớp vỏ trong (vỏ capsid ) ồ 2 ớ : Lớp ngoài hình c u, c u t o b i protein có tr V -1 18 18 Lớp trong... phân týp [56], [12 0] Các q ố ể ớ ỷ Phi có q ố C O T ự , thể x P ể ủ ủ , V , [29], [40], [12 0], [14 4], [15 8] 1. 5.2 Đặc điểm ph n týp HIV- 1 ở châu Âu Mặ  ớ ỷ ố ố í Phi và châu Á [14 1], ứ phân týp HIV- 1 q ố châu Âu [27], B France ự sau [15 3] P P V/ y S ủ Phân týp B là B Spain 74,5% [96], ớ Switzerland 91, 6% [58], B 70,7% Greece [11 0]; Bắ Poland [11 1], R x ớ France [25], [59], [60] 1. 5.3 Đặc điểm ph n týp. .. CRF 01- E 42,9%, B 10 %; B 12 ,9%; CRF07 - BC 11 ,4%; CRF08 - BC10%; CRF02 - AG 4,3%; K 1, 4% Ngoài ra, ò G 2,9% B/CRF 01- AE 1, 4%; U/G 1, 4% và U/CRF 01 - AE 1, 4% [15 9] T ủy Philippine B 70%, phân týp E 20%, phân týp F là 6% và phân týp C là 4% [12 5] T S ủy T ủy N tB R 01- AE 56%, phân týp B là 23,9% [10 9] B m 87,9%, CRF 01 0,7%; 1, 2%; CRF02 - AG 0,8%; 0,3%; 0,2% và 0,04% E 8,4%; G 0,4%; R 08 - BC [75] 1. 5.8... [12 1] 1. 5 Đặc đi m phân týp HIV- 1 ở một s khu vực 1. 5 .1 Đặc điểm ph n týp HIV- 1 ở châu Phi V ự S ỷ ứ V V -1 c T P : V, [14 1] Các nghiên y ự ố V -1 , Benin và Ghana là phân týp A chi ,G các Janssens và cộng sự (19 97) [74] ứ Tây Phi: Cote ’ ủ 71% vùng châu Phi [12 0] T q ể châu Phi , R Z P y vùng ủy Vùng ủy , 21 ò B, , , E, , G, U , Rw P ủy N ỷ ủy B Đ ,K y ,T z ủy , Bắ P ố B nh Algeria, Morocco, Egypt phân. .. [ 71] , [72], [ 91] , [99]; Từ ồ y ớ ặ CRF07-BC và CRF08-BC V Nhìn chung d y, nhóm gái ữ phân týp x T ác Q ố [64] Á B 36,9%; CRF 01- AE 34,6%; phân týp C 16 ,2%, ò 12 ,3% ỉ xé ì ố R 01- E ữ 81, 3% ồ E ố ự P [55], Thái Lan [30], [11 3], [11 7], [11 8]; ớ :V Myanmar [13 5], ớ R 01- E ố ừT ụ ,T Á P E ớ 50,8% gây d h ự N , ố Q ố [73], N ra [5], [6], [9], [11 ], [18 ], Cambodia [78], 19 94, R 01 - E ỉ ỉ T V Q ố [99], [15 5],

Ngày đăng: 29/11/2016, 10:48

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • 1.1.2. Tình hình nhiễm HIV ở Việt Nam

  • Theo Bộ y tế Việt Nam, trường hợp phát hiện đầu tiên vào năm 1990 ở Thành phố Hồ Chí Minh. Đến nay, dịch HIV đã lan ra khắp các tỉnh thành, phần lớn số người xét nghiệm HIV dương tính cao là ở các tỉnh, thành phố lớn, các tỉnh khu vực miền núi Tâ...

  • Qua các số liệu giám sát cho thấy dịch HIV/AIDS đã xuất hiện ở 100% tỉnh, thành phố từ năm 1998, đến cuối năm 2011 đã có 98% số quận, huyện, thị xã và 77% số xã, phường, thị trấn có người nhiễm HIV được báo cáo. Tình hình nhiễm HIV trên toàn quốc tron...

  • 1.1.3. Tình hình nhiễm HIV ở Lào

  • 1.3.1. Đặc điểm cấu trúc của virus HIV

  • 1.3.2. Sự xâm nhập và quá trình nhân lên của HIV trong tế bào vật chủ

  • Để hiểu được cơ chế gây bệnh của HIV, cần tìm hiểu chu trình nhân lên và phát triển của nó trong tế bào vật chủ, quá trình này gồm các bước sau:

  • 1.4.1. Các phân týp HIV

  • Hiện nay, HIV được chia thành 2 týp: HIV-1 và HIV-2, trong đó HIV-1 được chia thành 4 nhóm: M, N, O, P [16], [65], [114], [115], [132], trong đó nhóm M lại chia thành 10 phân týp: A, B, C, D, E, F, G, H, J và K [28], [122]; phổ biến nhất là các phân ...

  • Sự đa dạng của HIV-1 là do tính di truyền đột biến cao và tích lũy qua các chu kỳ nhân lên liên tiếp qua nhiều vật chủ dẫn đến vô số các biến thể virus ở cá thể đồng nhiễm trong cộng đồng mà HIV đồng lưu hành. Quá trình này có mối liên hệ chặt chẽ gi...

  • + Yếu tố đầu tiên là sự sai sót tự nhiên trong quá trình phiên mã ngược từ RNA sao chép thành cDNA làm thay đổi nucleotid, dẫn đến sự thay đổi amino acid ở vị trí tương ứng với tần suất của sự thay đổi khoảng 9x10-5 nucleotid trên một vị trí trong mộ...

  • + Yếu tố thứ hai là khả năng nhân lên của HIV cao, khoảng 1010 virion được sản xuất trong một ngày. Yếu tố thứ ba là dưới tác dụng và áp lực của các thuốc kháng virus, dẫn đến HIV thích nghi bằng cách đột biến [29], [34], [40], [96], [97], tạo ra các...

  • + Một yếu tố quan trọng đó là ở những vùng lưu hành đồng thời nhiều phân týp HIV dẫn đến hiện tượng đồng nhiễm hai hay nhiều phân týp hoặc bội nhiễm ở cá nhân hoặc cộng đồng là điều kiện thuận lợi rất dễ tạo ra các dạng tái tổ hợp và các biến thể mớ...

  • Nghiên cứu về phân bố của các phân týp HIV, thực chất đồng nghĩa với tìm hiểu sự biến đổi di truyền của HIV ở cấp độ khu vực trên toàn cầu là cần thiết, không chỉ để tìm hiểu nguồn gốc và giám sát dịch tễ học của HIV, mà còn giám sát sự xuất hiện của...

  • 1.4.2. Phân bố các phân týp HIV-1 tại các khu vực trên toàn cầu

  • HIV-1 lưu hành trên toàn cầu, nó thể hiện một bức tranh bất thường do đặc tính đa dạng, di truyền, đột biến cao, sự phân bố các nhóm, phân týp và các dạng tái tổ hợp có sự khác nhau giữa các châu lục như châu Phi phân týp C là phân týp chiếm ưu thế...

  • Mỗi châu lục lại có đặc điểm phân bố riêng, cụ thể ở châu Phi phân týp C chiếm ưu thế đặc biệt ở Nam Phi [120]. Đông Phi là phân týp A, D chiếm ưu thế [51], [79], [105]. Đông Bắc Phi là phân týp C chiếm ưu thế. Trung Phi là phân týp A, D, CRF02-AG v...

  • Sự phân bố toàn cầu của các thế hệ HIV-1 có thay đổi theo thời gian, ngày càng xuất hiện nhiều biến thể mới.

  • 1.4.3. Đồng nhiễm, bội nhiễm và các dạng tái tổ hợp của HIV-1

  • Khi đồng thời cùng một lúc có hai hay nhiều mầm bệnh cùng phối hợp tác động gây bệnh khi đó gọi là nhiễm trùng hỗn hợp hay đồng nhiễm.

  • Trong khi bệnh đang tiến triển, chưa khỏi lại có mầm bệnh khác, nhờ điều kiện thuận lợi mà xâm nhập cùng gây bệnh thì gọi là nhiễm trùng thứ phát hay bội nhiễm.

  • Các dạng tái tổ hợp của HIV-1 xuất hiện khi cá thể bội nhiễm hoặc đồng thời nhiễm 2 hay nhiều phân týp, trong chu kỳ nhân lên các vật liệu di truyền của chúng trộn lẫn với nhau tạo ra những biến đổi về vị trí acid amin, tích lũy trong chu kỳ nhân lên ...

  • Một số dạng tái tổ hợp lây lan phạm vi toàn cầu như CRF01- AE là dạng tái tổ hợp với sự kết hợp của phân týp E và phân týp A có nguồn gốc từ trung Phi nhưng dịch bệnh bùng nổ và chiếm ưu thế ở Đông nam Á, ban đầu tạ...

  • Một số dạng tái tổ hợp chỉ đặc hữu ở khu vực hoặc trong quốc gia cụ thể: CRF04- cpx là tái tổ hợp phức tạp có xuất xứ và đặc hữu tại Hi Lạp thuộc châu Âu, trước đây gọi là phân týp I. CRF07-BC và CRF08-BC đều là kết hợ...

  • 1.5. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở một số khu vực

  • 1.5.1. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Phi

  • Vùng cận Sahara châu Phi là tâm điểm của HIV, được ghi nhận là khu vực có tỷ lệ nhiễm HIV chiếm 71% cao nhất trên toàn cầu [141]. Các nghiên cứu về phân týp HIV-1 cho thấy các phân týp lưu hành có sự khác nhau ở các vùng châu Phi [120]. Theo tác giả J...

  • Các quốc gia vùng Trung Phi là tâm điểm của các phân týp của HIV được thể hiện sự đa dạng, có tất cả các nhóm, các phân týp, các dạng tái tổ hợp và các biến thể chưa xác định phân týp [29], [40], [120], [144], [158].

  • 1.5.2. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Âu

  • Mặc dù châu Âu có tỷ lệ nhiễm và số người sống chung với HIV/AIDS thấp so với châu Phi và châu Á [141], nhưng tính đa dạng di truyền của các phân týp HIV-1 là đứng sau khu vực châu Phi. Phân týp B là phân týp phổ biến ở các quốc gia châu Âu [27],...

  • 1.5.3. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Mỹ

  • 1.5.4. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở Trung Đông

  • Trung Đông là ngã tư giữa các châu lục, sự phân bố của các phân týp HIV ở khu vực này ít được biết đến. Năm 2011, Ghina Mumtaz và cộng sự [56], đã có bằng chứng về sự đa dạng các phân týp HIV-1 ở một số quốc gia vùng Trung Đông nh...

  • 1.5.5. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở Liên Bang Nga

  • Phân týp HIV-1 phổ biến ở Liên Bang Nga là phân týp A [19], [27]. Năm 2009, Thomson M.M, và cộng sự [136] điều tra tính đa dạng di truyền của HIV-1 ở St Petersburg, phân tích 102 mẫu huyết thanh thu vào năm 2006, kết quả phân týp A chiếm 89,3...

  • 1.5.6. Đặc điểm phân týp HIV-1 ở châu Úc

  • Phân týp HIV-1 phổ biến ở châu Úc là phân týp B [26]. Năm 2003, Herring B. L, và cộng sự [68], phân tích141 mẫu để xác định phân týp HIV-1 lưu hành tại châu Úc, kết quả phân týp B chiếm 74%; phân týp C 12%, phân týp E 9,1%; phân týp A 3,5...

  • 1.6. Một số kỹ thuật xác định phân týp HIV-1

  • 1.6.1. Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể peptide đặc hiệu HIV-1

  • Là phương pháp dùng các peptid đặc hiệu cho các phân týp (thường sử dụng là các peptid tổng hợp hoặc phân lập từ vùng quyết định trung hoà chính trên V3 của gp120) làm kháng nguyên gắn vào các giếng của phiến nhựa. Huyết thanh bệnh nhân (có chứa kháng...

  • 1.6.2. Kỹ thuật Heteroduplex Mobility Assay (HMA): có 2 giai đoạn

  • Giai đoạn đầu, các đoạn DNA đặc hiệu trong một panel các phân týp của

  • HIV-1và đoạn DNA của chủng HIV-1 cần xác định được khuếch đại bằng phản ứng nested PCR.

  • Giai đoạn sau, sản phẩm của phản ứng Nested PCR của chủng HIV-1 cần xác định phân týp sẽ được lai với từng sản phẩm DNA trong panel phân týp qua các giai đoạn xử lí nhiệt độ thích hợp. Sản phẩm lai cặp này được phát hiện qua điện di trên gel polyacryl...

  • Ưu điểm: có thể phát hiện được gen kháng thuốc, phát hiện được hiện tượng đồng nhiễm các phân týp, có thể áp dụng với số mẫu lớn, giá thành vừa phải, nhược điểm hay có phản ứng chéo và đòi hỏi kỹ thuật viên chuyên sâu [42], [61], [89], [123].

  • ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

  • 2.1. Đối tượng nghiên cứu

    • 2.1.1. Địa điểm lấy mẫu máu ở khu vực Hà Nội (KVHN) – Việt Nam

    • 2.1.2. Địa điểm lấy mẫu máu ở khu vực Viêng Chăn (KVVC) – Lào

    • 140 đối tượng nghiên cứu khu vực Viêng Chăn trong đó có 50 mẫu ký hiệu là nhóm A từ A1 đến A50 thuộc nhóm nghiện chích ma túy, 50 mẫu ký hiệu là nhóm B từ B1 đến B50 thuộc nhóm gái mại dâm, hai nhóm này lấy tại khoa bệnh nhiệt đới của bệnh viện Sêt Th...

    • Các đối tượng nghiên cứu ở khu vực Viêng Chăn tham gia nghiên cứu tình tự nguyện có giấy xác nhận và nhóm nghiên cứu được Chủ tịch ủy ban

    • đạo đức - Bộ Y tế CHNCND Lào cấp giấy chứng nhận về Y đức số

    • 284/NECHR, Vientiane Capital, ngày 26/3/2010 (xem phần phụ lục).

    • + Tiêu chuẩn lựa chọn: những trường hợp có xét nghiệm khẳng định HIV

    • dương tính thuộc 3 nhóm trên.

    • + Tiêu chuẩn loại trừ: những trường hợp không khai báo địa chỉ,

    • 2.2.1. Các sinh phẩm hoá chất chính

    • 2.2.2. Các máy và thiết bị chính

    • 2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu

    • Mồi là các chuỗi oligonucleotide tổng hợp có thể kết hợp bổ sung vào đầu tận của các chuỗi đơn DNA đặc hiệu cho cấu trúc gen gp41 tại vùng gen env, chúng tôi áp dụng những cặp mồi theo tác giả Fumihiro (2005) [53], như sau:

    • 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu

    • 2.3.2. Tách chiết acid nucleic (RNA hoặc DNA)

    • Trong quy trình xác định phân týp HIV có thể dùng phương pháp tách RNA từ huyết tương sau đó tổng hợp cDNA và chạy phản ứng mPCR hoặc tách DNA từ khối tế bào bạch cầu (Buffy coat). Do RNA không bền, không thể lưu giữ lâu và thực hiện với nhiều mẫu đồn...

    • Từ giá trị mật độ quang học OD260/OD280 = T (OD - Optical Density) đánh giá mức độ sạch của dung dịch tách. Nếu 1,8<T<2,0 thì dung dịch axit nucleic đó được coi là sạch [94] .

    • 2.7.1. Tinh sạch sản phẩm PCR2

    • * Đối với các mẫu không có băng phụ, các bước như sau:

    • 1. Thêm 5 thể tích Buffer 1 (PCR Binding Buffer) vào ống chứa 1 thể

    • tích sản phẩm PCR (nếu thể tích sản phẩm PCR là 20µl thì thêm 100µl

    • 2.7.2. Bước 2 chạy phản ứng PCR gắn BigDye

    • 2.7.3. Bước 4 biến tính HiDi Formamid

    • 2.7.4.

    • 1. Sản phẩm tinh sạch sau khi đã làm khô và làm bay hết hơi cồn, được thêm vào mỗi ống 20 μl HiDi. Để ở 950C x 5 phút rồi 40C x 5 phút.

    • 2. Chạy máy giải trình tự tự động ABI Sytem 3130XL.

  • KẾT QUẢ

    • 3.1.2. Kết quả lựa chọn quy trình phản ứng PCR

    • Kết quả 10 mẫu áp dụng theo quy trình của tác giả Fumihiro

    • 3.1.4. Kết quả kiểm tra quy trình tối ưu

    • vực Hà Nội và khu vực Viêng Chăn

    • Trong quá trình tối ưu phản ứng cho phù hợp với điều kiện thực tế, nhóm nghiên cứu nhận thấy nếu chuyển thứ tự phản ứng PCR2.2 sử dụng các cặp mồi xác định phân týp A, E, G ngay sau PCR1 thành PCR2.0 hầu hết các mẫu có kết quả ngay mà ít phải dùng đế...

    • 3.2.1. Kết quả xác định phân týp HIV-1 khu vực HN và VC bằng mPCR

  • BÀN LUẬN

    • 4.1.1. Lựa chọn phương pháp tách DNA và RNA

    • Độ tinh sạch DNA hay RNA là một trong những yếu tố quyết định về sự thành công của các kỹ thuật sinh học phân tử nói chung và các kỹ thuật PCR nói riêng đặc biệt là kỹ thuật mPCR, do đó việc lựa chọn phương pháp tách DNA hoặc RNA là một chiến lược và ...

    • 4.1.3. Lựa chọn quy trình phản ứng multiplex PCR

    • Quy trình của tác giả Fumihiro năm 2005 [53] đã được sử dụng thành công sau đó nhiều tác giả khác cũng đã áp dụng thành công [6], [9], [11] chính là cơ sở để nhóm nghiên cứu lựa chọn. Tuy nhiên mỗi phòng xét nghiệm lại có trang bị khác nhau về cấu hì...

    • Theo công bố của Fumihiro, tác giả chạy phản ứng PCR1 với mồi chung BECO5’ và BECO3’ khuếch đại đoạn gen gp41 đặc hiệu cho HIV-1 sau đó là phản ứng PCR 2.1 với các mồi BE-ANCH là mồi xuôi, 4 mồi B-SPEC, E-SPEC, F-SPEC, C-SPEC là mồi ngược để xác định...

    • Ban đầu chúng tôi đã áp dụng nguyên bản quy trình của tác giả Fumihiro với 10 mẫu, cho thấy hiệu quả xác định phân týp là thấp, đối với PCR 2.1 cho kết quả 5/10 mẫu không có băng xuất hiện, có 5/10 mẫu xuất hiện băng DNA đặc hiệu với kích thước 645 bp...

  • Qua nghiên cứu ứng dụng multiplex PCR để xác định phân týp của HIV-1 ở Hà Nội và Viêng Chăn chúng tôi rút ra kết luận sau:

  • + PCR2.0 sử dụng 3 cặp mồi (A 5’ - A3’), ( E 5’- E 3’), (G 5’- G3’) để phân biệt phân týp A, E và G. Sản phẩm có kích thước 644 bp là phân týp A, 554 bp là phân týp E và 607 bp là phân týp G.

  • + PCR2.1 sử dụng các mồi BE - ANCH, B - SPEC, E-SPEC, F-SPEC, C-SPEC. Sản phẩm kích thước 697 bp là phân týp C, 778 bp là phân týp F. Kích thước sản phẩm 441 bp có thể là phân týp B hoặc D cần tiếp tục PCR 2.2.

  • + PCR2.2 sử dụngcặp mồi D5’ - D3’, sản phẩm có kích thước 350 bp là phân týp D, không có sản phẩm là phân týp B.

  • *Chu trình luân nhiệt chung cho các vòng phản ứng mPCR

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan