KHÓA LUẬN 2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TP HOA SỮA

37 12 0
  • Loading ...
1/37 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 28/11/2016, 20:18

Hoa sữa là cây thuộc họ trúc đào, là cây có hàm lượng Ancaloit lớn trong tự nhiên. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy thành phần vỏ cây chứa Ancaloit, mà trong thực vật Ancaloit không chỉ tập trung ở một bộ phận mà phân bố ở nhiều bộ phân khác của cây. Hoa của cây hoa sữa có thể chứa thành phần Ancaloit. Hoa sữa đã được sử dụng nhiều trong y dược, vì vậy nó có hợp chất có tác dụng dược lý. MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hoa sữa phổ biến Việt Nam Cây thường trồng lấy bóng mát nhiều địa phương Từ xa xưa ông cha ta biết dùng vỏ hoa sữa làm thuốc chữa bệnh Các nghiên cứu gần chủ yếu nghiên cứu thành phần vỏ hoa sữa cho thấy vỏ chúng chứa Ancaloit có tác dụng dược lý Một phận khác hoa lại nghiên cứu đề cập đến Hoa sữa loài hoa có mùi thơm nồng nên nghiên cứu xác định thành phần có hoa làm phong phú thêm nguồn hương liệu phục vụ công nghiệp sản xuất Mặt khác, vỏ có tác dụng dược lý hoa chứa thành phần tương tự, xác định thành phần làm phong phú thêm nguồn dược liệu phục vụ y học Ở địa bàn thành phố Đồng Hới nơi có nhiều hoa sữa, làm nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho trình nghiên cứu ứng dụng Việc thực nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa dung môi n-hexan clorofom hướng nghiên cứu tách chiết hợp chất thiên nhiên Vì vậy, chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa thành phố Đồng Hới dung môi n-Hexan Clorofom” Mục đích nghiên cứu - Xác định thành phần hoá học hợp chất dịch chiết hoa sữa dung môi n-Hexan Clorofom - Xây dựng qui trình chiết tách Ancaloit hoa sữa Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Cây hoa sữa, chọn cách ngẫu nhiên địa bàn thành phố Đồng Hới - Hoa hoa sữa lấy khoảng thời gian tháng 11/2014 - 01/2015 Giả thuyết khoa học - Hoa sữa thuộc họ trúc đào, có hàm lượng Ancaloit lớn tự nhiên Theo nghiên cứu trước cho thấy thành phần vỏ chứa Ancaloit, mà thực vật Ancaloit không tập trung phận mà phân bố nhiều phân khác Hoa hoa sữa chứa thành phần Ancaloit - Hoa sữa sử dụng nhiều y dược, có hợp chất có tác dụng dược lý - Đề tài xác định thành phần có dịch chiết hoa sữa để biết rõ hợp chất có dịch chiết n-Hexan Clorofom Nhiệm vụ nghiên cứu - Xây dựng hệ thống lý thuyết tách chiết hợp chất dung môi làm sở cho thực nghiệm - Tìm hiểu đối tượng cần nghiên cứu hoa sữa - Lập kế hoạch, quy trình nghiên cứu thành phần dịch chiết hoa sữa dung môi n-hexan clorofom - Tổ chức thực kiểm chứng lại giả thuyết nêu Các phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết - Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: + Phương pháp chọn mẫu + Chiết dung môi n-hexan clorofom + Xác định thành phần hợp chất dịch chiết từ vỏ hoa sữa dung môi chiết phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS Bố cục khóa luận Đề tài có cấu trúc gồm có phần: - Phần mở đầu - Phần nội dung + Chương 1: Tổng quan + Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm + Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận - Phần kết luận kiến nghị NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hoa sữa 1.1.1 Sơ lược nguồn gốc hoa sữa giới thực vật Hoa sữa, hay gọi mò cua, mù cua (danh pháp khoa học Alstonia scholaris (L.) R.Br) loài thực vật nhiệt đới thuộc chi Hoa sữa, họ Trúc đào, Hoa vặn (Contortae) hay Long đởm (Gentianales) Họ Trúc đào - Apocynaceae, gỗ hay nhỏ, nhiều phận có nhựa mủ trắng Lá thường mọc đối mọc vòng, mọc cách, kèm Hoa đơn độc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hay cụm hoa xim Hoa trừ nhụy gồm noãn (đôi 3-5) Hoa đều, tràng hợp hình ống, thường có phần phụ dạng vảy lông bên ống tràng, thùy tràng xếp vặn Số nhị số cánh hoa, dính vào ống tràng, bao phấn hình mũi tên, trung đới mang phần phụ lông dài, hạt phấn rời Bầu trên, thường rời phân thùy, vòi đầu nhụy Đầu nhụy thường loe rộng, hình nón cụt bao phấn thường dính vào Trong noãn ô bầu có từ đến nhiều noãn đảo Quả thường gồm đại, có hạch Hạt có cánh hay chùm lông tơ, dễ phát tán Phôi nhỏ có nội nhủ [1] Trúc đào họ lớn, có tới gần 200 chi 2000 loài, phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở nước ta tìm thấy khoảng 50 chi 170 loài, thường mọc đồi rừng thưa, có số loài trồng Chất nhựa mủ họ Trúc đào thường có tính độc (như chi Nerium, Strophanthus), có vị đắng, y học dùng làm thuốc Ở số cây, chất nhựa mủ lại có tính đàn hồi cao su Trong cây, sợi libe vững chắc, dùng lấy sợi Một số quen thuộc họ Trúc đào như: - Dây huỳnh (Allamanda cathartica L.): Cây bụi leo mọc vòng một, hoa to, màu vàng Cây trồng làm cảnh - Trúc đào (Nerium odrorum L.): Cây nhỏ, mọc vòng một, màu lục thẩm, dai cứng Hoa thường có cánh kép, màu đỏ hồng hay trắng Lá có chất độc, chứa neriolin, dùng để chữa bệnh tim Cây trồng làm cảnh - Đại (Plumeria rubra L var acutifolia (Ait.) Woods.): Cây nhỡ, cành khỏe, lớn mọc cách, để lại vết sẹo sau rụng Hoa lớn, màu trắng, vàng, thơm Một vài phận dùng làm thuốc: vỏ thân vỏ rể có tác dụng tẩy mạnh, hoa dùng chữa ho, dã đắp chữa sai khớp, bong gân, mụn nhọt, nhựa dùng vỏ thân liều thấp hơn, dùng chữa chai chân vết loét Cây thường trồng đình chùa làm cảnh - Thông thiên (Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum.): Cây nhỡ, mọc cách màu lục bóng Hoa màu vàng, hình chuông Quả màu lục Cây trồng làm cảnh Hạt chứa dầu số heterozit có chất thevetin dùng chế thuốc chữa bệnh tim Có nơi dùng hạt dã nát làm thuốc trừ sâu Tuy nhiên, việc dùng thuốc chế từ phải thận trọng độc Ở đồi rừng thưa ta hay gặp loài như: - Sừng trâu (Strophantus divaricatus (Lour.) Hook Et Arn.): Cây nhỏ, cao độ - 4m, xanh bóng, hoa màu vàng nhạt, khô gồm đại dính gốc, nom sừng trâu Cây độc, hạt dùng chế thuốc chữa bệnh tim - Thừng mức hay lồng mức (Wrightia annamensis Dub et Eberh.): Cây gỗ nhỡ, hoa màu trắng hay vàng nhạt, mọc thành xim Gỗ trắng, thớ mịn nhẹ, dùng làm guốc khắc dấu Cây mọc nhiều rừng thưa tái sinh khỏe đồi hoang tỉnh miền Bắc, miền Trung [1] 1.1.2 Cây hoa sữa Hoa sữa hay mò cua (Alstonia scholaris (L.) R.Br.): Cây to cao khoảng 10 20m, vỏ nứt nẻ màu xám Cành mọc vòng Lá mọc vòng - cái, tập trung đầu cành; phiến dày, hình bầu dục Hình 1: Cây hoa sữa thành phố Đồng Hới Hoa nhỏ, màu trắng đục, mọc thành xim tán nách lá, mùi thơm hắc, đêm Quả gồm hai đại dài hẹp, chứa nhiều hạt Hạt có mào lông hai đầu Hình 2: Hoa sữa Loài cổ nhiệt đới, mọc hoang trồng khắp nước ta Cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh thường mọc ven rừng nơi ẩm ven sông, ven suối Tái sinh chồi mạnh Có thể trồng hay cành, hoa vào tháng 10 - 11 có tháng - hàng năm Gỗ làm gỗ dán đồ dùng thông thường Thường trồng làm cảnh, trồng ven đường phố quanh công trình công cộng để lấy bóng mát Vỏ thân chứa nhiều Ancaloit (0,16 - 0,27%), dùng nhiều làm thuốc Thường dùng làm thuốc bỗ chữa thiếu máu, kinh nguyệt không đều, sốt rét cấp mạn tính, đau bụng, ỉa chảy, kiết lỵ, viêm khớp có sưng nóng đỏ đau, bệnh da, lở ngứa Vỏ sắc đặc dùng ngậm chữa sâu Ở nước ta, vỏ hoa sữa dùng làm dược liệu chế rượu bổ Dikatina Ở Ấn Độ, vỏ dùng trị sốt rét dùng trị ỉa chảy, kiết lỵ, trị rắn cắn; dịch đáp vết loét Ở Thái Lan, vỏ dùng trị lỵ, trị cảm viêm phế quản Ở Trung Quốc, vỏ dùng trị ho gà, viêm khí quản mạn tính, suyễn khan, sốt rét, cảm mạo phát sốt, sưng amygdal, viêm gan cấp tính, phong thấp, đòn ngã, gãy xương, mụn nhọt sưng đỏ [5] 1.2 Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoa sữa Hoa sữa loài phổ biến Ấn Độ, vùng Nam Á, Đông Nam Á nhà khoa học nước có báo cáo, nghiên cứu Các nhà hóa học nghiên cứu hoa sữa chủ yếu nghiên cứu xác định thành phần hóa học phận Nhiều đề tài chủ yếu nghiên cứu thành phần vỏ cây, Một số nhà khoa học phân lập số chất có Những nghiên cứu thành phần hóa học cây, phận có chứa Ancaloit Hoa sữa biết đến thực vật giàu Ancaloit có giá trị điều trị bệnh Trong thành phần hóa học có loài Ancaloit đóng vai trò quan trọng đến việc phát triển loài thuốc mới, Ancaloit có loạt cấu trúc hóa học xác định định đến tính chất dược lý Hầu tất phận vỏ, rễ, lá, hoa, phát có chứa Ancaloit Từ phận hoa sữa, nhà khoa học nhiều nước khác giới phân lập chất Ancaloit sau: picirinine; scholaricine; echitamine; clorua echitamine; rhazine; nareline; dihydrocondylocarpine; 19,20-Z-vallesamine; 19,20-E-vallesamine; alschmine isoalschomine; mataranine A B Ngoài thành phần hóa học hoa sữa có số thành phần khác như: linalol; cis trans oxit linalol; α – tecpineol; tecpinen-4-ol tìm thấy hoa sữa Một số hợp chất như: iridois; coumarin; flavonid; leucoanthocyanis; đường khử; phenolics đơn giản, steroids, saponin tanin tìm thấy [6], [7] 1.3 Hợp chất Ancaloit 1.3.1 Khái niệm Ancaloit hợp chất hữu có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ, thường gặp nhiều loài thực vật tìm thấy vài động vật Trên thực tế có nhiều loại thực vật có Ancaloit mức độ vết tỉ lệ phần vạn Để giới hạn với thực tiễn, xem có Ancaloit phải chứa 0,05% Ancaloit so với mẫu khô Đặc biệt Ancaloit có tác dụng hoạt tính sinh lý cao thể người động vật, hệ thần kinh Với lượng nhỏ, có Ancaloit chất độc gây chết người, có lại thần dược trị bệnh đặc hiệu [2] 1.3.2 Thành phần nguyên tố cấu tạo Ancaloit a Thành phần nguyên tố Ancaloit Có loại Ancaloit: - Loại chứa nguyên tố: C, H, N - Loại chứa nguyên tố: C, H, N, O C, H, N, S - Loại chứa nguyên tố: C, H, N, O, S loại có độc tính cao loài nấm độc [2] b Cấu tạo Ancaloit - Các Ancaloit thường có cấu tạo khác nhau, thường có nhân chứa dị vòng có nitơ như: - Các Ancaloit một họ thực vật thường có công thức cấu tạo gần giống - Các Ancaloit thường kết hợp với axit axit oxalic, axit tacric, axit lactic, axit malic để tạo thành dạng muối - Thành phần Ancaloit phụ thuộc nhiều vào vùng, khí hậu, địa lí, mùa năm Ancaloit thường chứa môt số phận như: lá, hạt, rễ, vỏ [4] 1.3.3 Phân loại Ancaloit Do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân đáp ứng cho số lượng Ancaloit nhiều đa dạng, nên để tiện lợi, Ancaloit chia chia thành ba loại: - Ancaloit thật: Là hợp chất có hoạt tính sinh học, có tính bazơ, thường có chứa nguyên tử nitơ vòng dị hoàn, thường sinh tổng hợp từ amino axit, phân bố giới hạn thực vật diện dạng muối axit hữu cơ, ngoại trừ: colchicin, axit aristolochic, Ancaloit tứ cấp Các Ancaloit loại thường chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp chúng theo dị vòng hoàn - ProtoAncaloit: Được xem amin có hoạt tính sinh học kể mescalin N, N-đimetyltryptamin Chúng amin đơn giản, tổng hợp từ amino axit, nguyên tở nitơ không vòng dị hoàn - Giả Ancaloit: hợp chất không bắt nguồn từ amino axit, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn Ancaloit steroid Ancaloit terpenoid Hầu hết Ancaloit diện có hoa, loại mầm, người ta thấy Ancaloit động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật Chỉ đặc điểm chung thường gặp tên Ancaloit thường tận chữ “ine” [4] 1.3.4 Tính chất chung Ancaloit a Trạng thái Đa số Ancaloit không màu, trạng thái kết tinh rắn với điểm nóng chảy xác định có khoảng nhiệt độ phân hủy Một vài Ancaloit dạng nhựa vô định hình, vài Ancaloit dạng lỏng (nicotin, coniin) vài Ancaloit có màu (berberin màu vàng, betanidin màu đỏ) [4] b Tính bazơ mạnh - Ancaloit hợp chất có tính bazơ yếu, có có mặt nguyên tử nitơ Tính bazơ Ancaloit khác tùy thùy theo diện nhóm R (mang nhóm chức khác nhau) gắn nguyên tử nitơ - Các Ancaloit thường có tính bazơ mạnh làm xanh quỳ tím - Các Ancaloit tạo muối với axit - Một số Ancaloit làm kết tủa Fe(OH)3, Al(OH)3 dung dịch - Một số Ancaloit có tính bazơ mạnh đẩy bazơ trung bình khỏi muối chúng [2] c Tính tan - Các Ancaloit tính bazơ yếu phải cần môi trường axit mạnh để tạo thành muối, tan nước - Các Ancaloit dạng bazơ tự không tan nước, thường tan tốt dung môi hữu clorofom, dietyl eter, alcol bậc thấp Các muối Ancaloit tan nước, ancol không tan dung môi hữu clorofom, dietyl eter, benzen Các protoancaloit giả Ancaloit thường dễ tan nước [4] d Tác dụng ánh sáng Một số Ancaloit không bền ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại; có số bị thái hóa chiếu tia sáng có bước sóng định [2] e Hoạt tinh sinh lí cao Các Ancaloit có tác dụng vào hệ thần kinh mạnh có tác dụng lý hóa thể người động vật Con người sử dụng Ancaloit với liều lượng nhỏ để chữa bệnh hay giải khát cacao, cà phê, Nhiều Ancaloit chất gây nghiện nguy hiểm người thuốc phiện, heroin Các Ancaloit có chứa S thường cố độc tính mạnh, người ta thấy Ancaloit loài nấm độc [4] 1.3.5 Sự tạo thành Ancaloit Trước người ta cho nhân Ancaloit hay thuộc chất chất đường kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh Ngày phương pháp dùng nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh Ancaloit tạo từ axit amin Qua định tính định lượng Ancaloit phận khác người ta thấy nơi tạo Ancaloit luôn nơi tích tụ Ancaloit Nhiều Ancaloit tạo rễ lại vận chuyển lên phần mặt đất cây, sau thực biến đổi thứ cấp chúng tích lũy lá, hạt [8] 1.3.6 Thuốc thử Ancaloit Có nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu tạo kết tủa với Ancaloit, thuốc thử cho kết dương tính với hợp chất như: coumarin, polyphenol, purin, amino axit, protein, axit triterpen, hợp chất có chứa nitơ Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, có số thuốc thử khác để phát loại Ancaloit đăc thù [4] a Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,36 g HgCl2 60 ml nước cất hòa tan g KI 10 ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch thêm nước cho đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, có Ancaloit xuất tủa màu trắng vàng nhạt Cần lưu ý tủa tạo thành hòa tan trở lại lượng thừa thuốc thử hòa tan AcOH, etanol có sẵn dung dịch thử b Thuốc thử Dragendorff Hòa tan 8,0 g nitrat bismuth Bi(NO 3)3.H2O 25 ml HNO3 30% (d = 1.18) Hòa tan 28 g KI ml HCl 6N ml nước cất Hỗn hợp dung dịch, để yên tủ lạnh 5oC cho tủa màu nâu sậm tan trở lại, lọc thêm nước cho đủ 100 ml Dung dịch màu cam đỏ chứa chai màu nâu để che ánh sáng, cất tủ lạnh, giữ lâu vài tuần Dung dịch dùng để định tính diện Ancaloit ống nghiệm để làm dung dịch phun xịt lên mỏng - Để định tính ống nghiệm: Dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit đựng ống nghiệm, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragandorff vào ống nghiệm có Ancaloit xuất kết tủa màu cam nâu (Tủa Ancaloit thu hồi cách xử lý vơi Na2CO3 chiết với dietyl eter) Thuốc thử không phản ứng với hợp chất amino axit, cho kết dương tính với hợp chất có nhóm cacbonyl tiếp cách pyron, cinamadehyd - Để phun xịt lên mỏng: Pha dung dịch phun xịt: bình phun xịt, cho vào theo thứ tự: 20ml nước; 5ml HCl 6N; ml dung dịch thuốc thử Dragendorff ml NaOH N Dung dịch trữ tủ lạnh để lâu 10 ngày Sử dụng dung dịch phun xịt lên mỏng, có Ancaloit cho vết màu cam đỏ c Thuốc thử Wagner Hòa tan 1,27 g I2 g KI 20 ml nước cất Thêm nước cho đủ 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch axit loãng có chứa Ancaloit, có Ancaloit xuất tủa màu nâu d Thuốc thử Iodoplatinat (dung dịch để phun xịt lên mỏng, phát Ancaloit có nitơ vòng dị hoàn) Dung dịch clorua platin 10% (3ml) 97 ml nước KI g 94 ml nước Hỗn hợp hai dung dịch này lại, trữ dung dịch chai lọ màu nâu 1.4 Flavonoit 1.4.1 Đại cương flavonoit Flavonoit hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho nhiều rau, quả, hoa Phần lớn flavonoit có màu vàng (do từ flavus màu vàng); vậy, số sắc tố có màu xanh, tím đỏ, không màu xếp vào nhóm 10 Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi nước Hoa sữa phòng thí nghiệm * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa, thu hái vào tháng 01/2015, hoa hái vào ngày khô ráo, không mưa Mẫu hoa chọn phải không bị sâu, bẩn, có dấu hiệu lạ Hoa nở vừa phải, nở đều, có mùi nồng, số lượng hoa tàn hoa chưa nở - Mẫu hoa có khối lượng 74,685 gam, xử lý, cắt nhỏ Cho vào bình cầu tích 250ml Thêm nước cất vào bình đến thể tích khoảng 2/3 bình Lắp hệ thống ảnh - Hệ thống phải đảm bảo kín, tránh cho tinh dầu bay bị thất thoát hợp chất dễ bay - Đun hỗn hợp nhiệt độ khoảng từ 60 - 80oC khoảng thời gian 40 60 phút 23 2.2.2 Tách, chiết dung môi hữu * Sơ đồ thực hiện: Hoa sữa khô Ngâm etanol 95o Lọc Bã hoa, bỏ Dịch etanol Cô đuổi, thu hồi dung môi Cao etanol Chiết n-hexan Dịch nước Dịch n-hexan Cô đuổi dung môi Chiết clorofom Dịch nước Dịch clorofom Cao n-hexan Đuổi bớt dung môi Dịch CHCl3 đậm đặc * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa tươi phơi khô, tránh ánh nắng trực tiếp, tránh ẩm mốc, tạp chất làm ảnh hưởng đến chất có thành phần hoa sữa, tránh phản ứng hóa học làm biến đổi chất đó, làm sai lệch ảnh hưởng đến kết nghiên cứu - Mẫu hoa sau phơi khô, đến độ ẩm khoảng 10%, ngâm ngập etanol 95o Bình đậy kín - Lọc dịch etanol, loại bã Lắp hệ thống cô đuổi, thu hồi dung môi, chưng đuổi dung môi bình cầu thể tích 250ml Hệ thống tương tự chưng cất lôi nước hoa sữa tươi Nhiệt độ đặt đuổi dung môi khoảng 60 - 70 oC Đuổi dung môi bình cầu đến thể tích khoảng 1/3 bình, chuyển sang cốc thủy tinh, chưng cất thủy để đuổi hết dung môi Thu cao etanol; chứa Ancaloit nhiều chất hữu khác 24 - Chiết n-hexan: Pha cao etanol với nước cất bình tam giác; sau thêm n-hexan, lắc, để yên, chiết Sử dụng pipet để lấy dịch n-hexan phía Thao tác cẩn thận để không lẫn nước vào dịch chiết Chiết nhiều lần nhạt màu Lần đầu tiên, pha cao etanol với 150ml nước cất, thêm 50 ml n-hexan, lắc, để yên, chiết; dịch n-hexaxn phía trên, dịch nước phía dưới, chiết lấy nhexan Sau lần chiết thứ nhất, thêm tiếp 50ml nước cất 50 ml n-hexan, lắc, chiết n-hexan Sau lần chiết thứ 2, thêm 50ml n-hexan, chiết tiếp Thêm tiếp 25ml n-hexan cho lần chiết thứ 4, 5, Các dịch chiết nhạt màu dần: dịch nước có màu vàng, dịch n-hexan dần, có màu xanh lục a) b) Hình 5: Chiết n-hexan: 5-a) Hỗn hợp chiết lần đầu; 5-b) Hỗn hợp chiết lần cuối - Dịch n-hexan sau chiết cô đuổi thu hồi dung môi bình cầu, đun bếp với nhiệt độ 50 – 60 oC Đuổi n-hexan đến thể tích khoảng 1/3 V, sau chưng cách thủy để đuổi hết n-hexan, thu cao n-hexan - Dịch nước sau chiết n-hexan, lọc, chiết với clorofom Chiết nhiều lần dịch clorofom nhạt màu Lần chiết thứ nhất, thêm 25ml clorofom vào dịch nước, lắc chiết lấy clorofom phần dưới, thao tác cẩn thận, để nước không lẫn vào dịch clorofom chiết, dịch clorofom lần chiết có màu vàng Ở lần chiết thứ 2, thêm tiếp 25ml clorofom, lắc, để yên, chiết dịch clorofom Cũng tương tự cho lần chiết thứ 3, thêm 25ml CHCl3 Ở lần chiết cuối (lần thứ 3) dịch clorofom không màu.Dịch clorofom thu sau chiết, cô đuổi dung môi thu dịch clorofom đậm đặc 25 - Thử dịch sau chiết với thuốc thử Mayer, Wagner 2.2.3 Tách chiết dung dịch axit * Sơ đồ thực hiện: Hoa sữa khô Chiết với etanol 95o Thu hồi dung môi Bã hoa, bỏ Cao etanol Hòa tan vào dd HCl 5% Thêm nước cất, lọc Chiết clorofom Dịch clorofom Dịch nước (Chứa muối alkaloid) * Quy trình thực hiện: - Chiết hoa sữa khô với etanol, thu hồi dung môi cách chưng đuổi dung môi lại khoảng 1/3 V; sau chưng cách thủy thu cao etanol - Hòa tan vào dd axit HCl 5%, đun ấm cho tan tốt nhằm biến đổi tất Ancaloit dạng bazơ tự Ancaloit dạng muối, thành dạng nuối clorua, tan nước - Thêm nước cất vào dung dịch, khuấy Để yên qua đêm; loạc bỏ cặn Dung dịch chiết với clorofom nhằm loại bỏ hợp chất hữu Ancaloit - Dịch nước lại chứa muối Ancaloit, chiết clorofom loại bỏ gần hết hợp chất hữu Ancaloit - Trong trường hợp tiết kiệm dung môi hữu cơ, thực sau: cao tổng Ancaloit thô hòa vào nước, dùng dung dịch axit để chỉnh pH = Khuấy lọc Dùng dung dịch kiềm chỉnh pH = 10, để yên qua đêm có tủa Lọc lấy tủa Hòa tủa vào nước, chỉnh pH = 3, lại cho kết tủa dung dịch kiềm Thực vài lần thu Ancaloit thô Kết tinh lại Ancaloit dung môi 26 - Thử dịch nước hòa tan cao tổng etanol, dịch axit chứa muối Ancaloit, dịch axit chứa muối Ancaloit dùng Na2CO3 chỉnh pH = 10 với thuốc thử Mayer, Wagner Quan sát tốc độ phản ứng màu sắc dịch với thuốc thử 2.2.4 Pha thuốc thử a Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,36 g HgCl2 60 ml nước cất hòa tan g KI 10 ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch thêm nước cho đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết quan sát tượng b Thuốc thử Wagner Hòa tan 1,27 g iod I2 g KI 20 ml nước cất Thêm nước cho đủ 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết quan sát tượng a) Thuốc thử Mayer b) Thuốc thử Wagner Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A 3.1 Hàm lượng tinh dầu Các nghiên cứu trước cho thấy hoa sữa có số hợp chất monoterpen: linalool; cis trans oxit linalool; α - tecpineol; tecpinen-4-ol Tinh dầu hợp chất không tan nước, có mùi thơm, nhiệt độ sôi khoảng 40 -60oC; phương pháp chưng cất lôi nước khoảng thời gian từ 40 - 60 phút thu tinh dầu Tuy nhiên, điệu kiện phòng thí nghiệm chưa có chứng cất lôi nước, dụng cụ tự lắp đặt (hình 4) thực với mẫu nhỏ, hàm lượng tinh dầu hóa sữa nhỏ, nên thu lượng tinh dầu chưa tiến hành đo GC/MS để xác định thành phần hóa học 3.2 Thành phần dịch chiết nước dịch chiết dung dịch axit 3.2.1 Dịch chiết nước Dịch nước thu sau chiết dung môi hữu cơ: n-hexan, clorofom có màu vàng, trong, nhạt màu dịch clorofom, kết tủa dịch nước Thử dịch nước với thuốc thử Mayer, Wagner cho kết sau: - Thuốc thử Mayer: Khi nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước chiết dung môi hữu có kết dương tính với thuốc thử Trong ống nghiệm xuất kết tủa màu vàng, kết tủa xuất nhanh, nhiều, dung dịch có màu vàng đục - Thuốc thử Wagner: Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng dịch nước cho kết dương tính Trong ống nhiệm xuất kết tủa màu nâu, kết tủa xuất nhanh, dịch nước có màu nâu đỏ a) b) Hình 7: Kết thử thuốc thử dịch nước chiết dung môi hữu cơ: a) Mayer; b) Wagner 28 Khi hòa tan 1gam cao etanol vào 100ml nước cất, để yên qua đêm lọc, thu dịch nước có màu vàng tươi, Cũng nhận biết dịch nước thuốc thử Wagner Mayer Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước Kết cho thấy với thuốc thử Mayer dung dịch chuyển sang màu trắng đục, không thấy có kết tủa Còn với thuốc thử Wagner dung dịch có màu nâu đỏ, kết tủa xuất Kết cho thấy, có hàm lượng nhỏ Ankaloit tan vào nước, khó nhận thuốc thử a) b) c) Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, phản ứng với thuốc thử a)Dịch nước hòa tan cao etanol, lọc; b) Thuốc thử Mayer; c) Thuốc thử Wagner 3.4.2 Dịch chiết dung dịch axit Cho vào hai bình tam giác, bình 1gam cao etanol, sau hòa tan cao 100ml dung dịch HCl 5% Ngâm qua đêm, lọc Bình thứ nhất, chiết clorofom Bình thứ hai, thêm dung dịch Na 2CO3 loãng Thử thuốc thử với dung dịch hai bình: Bình gồm dịch nước dịch clorofom; bình Hòa tan cao etanol dung dịch axit chuyển Ankaloit có mẫu dạng bazơ tự sang dạng muối clorua tan nước Cao etanol tan nhanh dung dịch axit 29 Hình 9: Cao etanol hòa tan dung dịch HCl 5% Ở bình 1: Chiết với clorofom dịch clorofom thu không màu Phản ứng với thuốc thử dịch axit cho kết dương tính Thuốc thử Mayer cho kết tủa vàng, rõ, thời gian xuất kết tủa nhanh Thuốc thử Wagner, dung dịch thu có màu nâu xuất nhanh, lượng kết tủa nhiều Ở bình 2: Thêm dung dịch Na2CO3 vào dung dịch chứa muối Ankaloit bazơ mạnh đẩy bazơ yếu khỏi muối, đưa Ankaloit lại dạng bazơ tự Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử thuốc thử Mayer cho kết dung dịch màu vàng đục, nhạt so với dung dịch bình 1; thuốc thử Wagner cho dung dịch màu nâu đỏ đục, nhạt bình 1, hai không thấy kết tủa xuất 3.3 Thành phần Ancaloit dịch chiết n-hexan 3.3.1 Hàm lượng Etanol dung môi phân cực, hòa tan hợp chất có tính phân cực không phân cực hợp chất hữu có hoa sữa Một số chất tan nước tan tốt ancol metanol hay etanol Mục đích việc sử dụng etanol hòa tan gần toàn chất hữu có mẫu hoa sữa khô, mặt khác etanol độc metanol Chiết với cao etanol, mẫu hoa sữa tươi có khối lượng 700g, sau phơi khô có khối lượng 80g (chiếm 11,43% khối lượng mẫu tươi) Sau ngâm, chiết với etanol, cô đuổi, thu hồi dung môi thu cao etanol có khối lượng 14,74g (chiếm 18,425% khối lượng mẫu khô; 2,11% khối lượng mẫu tươi) Khi ngâm, chiết với etanol hợp chất không phân cực phân cực ít, đa số hợp chất hữu có 30 hoa sữa tan dung môi etanol Cao tổng chứa thành phần toàn hợp chất hữu có Ankaloit, flavonoid, Chiết với dung môi n-hexan, hòa tan cao với nước cất cao không tan hết, dịch nước có màu vàng, thêm n-hexan phần lớn cao di chuyển lên phần dịch n-hexan n-hexan dung môi không phân cực, hòa tan tốt hợp chất hữu không phân cực Sau chiết n-hexan, cô đuổi, thu hồi dung môi nhiệt độ khoảng 60oC thu cao n-hexan 3.3.2 Trạng thái vật lý Cao n-hexan có màu xanh thẫm Hòa tan vào lại n-hexan thu dịch chiết, không thấy có kết tủa Hình 10: Dịch chiết n-hexan 3.3.3 Phản ứng với thuốc thử Thử dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer Wagner: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết n-hexan, sau nhỏ vài giọt thuốc thử - Thuốc thử Wagner: Dịch chiết n-hexan có kết dương tính với thuốc thử Wagner Thời gian để xuất kết tủa khoảng 15 phút sau nhỏ thuốc thử vào dịch chiết.Kết tủa dung dịch nhiều, bám dính đáy ống nghiệm, có màu nâu sẫm Hình 11: Dịch n-hexan phản ứng với thuốc thử Wagner 31 - Thuốc thử Mayer: Dịch chiết n-hexan cho kết dương tính với thuốc thử Wagner Chất lỏng ống nghiệm tách lớp, lớp không màu, lớp xanh đen.Trong dịch màu xanh đen có xuất kết tủa với lượng nhỏ Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer Trong dịch chiết n-hexan có chứa thành phần Ankaloit, với hàm lượng nhỏ, nhận biết nhờ sử dụng thuốc thử Mayer, Wagner 3.4 Thành phần dịch chiết clorofom 3.4.1 Hàm lượng a Chiết dung môi hữu cơ: Sau chiết với n-hexan, dịch nước thu chiết với CHCl 3, trình chiết xảy nhanh sau lần chiết thu dịch clorofom không màu Dịch clorofom thu sau chiết, thực cô đuổi, thu hồi dung môi nhiệt độ khoảng 50 - 60oC Từ 75ml dịch clorofom thu 5ml dịch clorofom đậm đặc b Chiết dung dịch axit: Khi hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm, lọc bỏ bã, chiết clorofom dịch CHCl3 thu không màu 3.4.2 Trạng thái vật lý a Chiết dung môi hữu cơ: Dịch chiết clorofom có màu vàng, dịch chiết clorofom đậm đặc có màu vàng nâu Không có tủa xuất dịch chiết clorofom 32 Hình 13: Dịch chiết clorofom b Chiết dung dịch axit: Dịch chiết clorofom không màu, kết tủa dịch Mặc dù màu clorofom hòa tan hợp chất hữu mà tan tốt CHCl3 axit 3.4.3 Phản ứng với thuốc thử a Chiết dung môi hữu Khi thử thuốc thử Mayer Wagner với dịch chiết clorofom phản ứng cho kết khác Ở thuốc thử Wagner, có kết tủa nâu xuất sau thời gian khoảng 30 phút, dung dịch tách lớp không rõ ràng, thuốc thử Wagner I2/KI, I2 bị hòa tan dung môi phân cực clorofom nên tách lớp xảy không rõ ràng Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer Thuốc thử Mayer xảy tách lớp rõ ràng, kết tủa xuất hiện.Lớp màu vàng đậm dịch chiết clorofom, lớp thuốc thử Mayer Lớp chứa dịch chiết clorofom sẫm màu so với chưa thử thuốc thử Trong dịch chiết clorofom có chứa Ankaloit, b Chiết dung dịch axit Hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm chiết với clorofom, thu dịch clorofom Phản ứng thuốc thử với dịch clorofom cho kết âm tính, dịch clorofom không màu phản ứng với thuốc thử Mayer 33 dung dịch ống nghiệm tách lớp rõ rệt, hai lớp dung dịch không màu kết tủa xuất hiện; với thuốc thử Wagner dung dịch có màu nâu đỏ, tách lớp rõ ràng Nguyên nhân tách lớp phản ứng với thuốc thử dịch clorofom thuốc thử Mayer dung dịch hai muối KI, HgCl2, chất phân cực, không tan dung môi phân cực CHCl3; thuốc thử Wagner hỗn hợp I2/KI, I2 vừa tan KI lại vừa tan CHCl3 nên xảy tách lớp không rõ ràng 3.5 Kết khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 3.5.1 Kết lựa chọn thuốc thử Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử tổng hợp bảng sau: Bảng 3: Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử Phương pháp chiết Dịch chiết n-hexan Dung môi hữu Clorofom Dịch nước Dịch nước Dung dịch HCl 5% Dịch axit Clorofom Dd axit + Na2CO3 Thuốc thử Mayer Wagner Mayer Wagner Mayer Wagner Mayer Wagner Mayer Wagner Mayer Wagner Mayer Wagner Hiện tượng Kết tủa màu nâu sẫm Kết tủa màu nâu đen Không có kết tủa Kết tủa nâu (sau thời gian) Kết tủa vàng rõ rệt Kết tủa nâu rõ rệt Dung dịch trắng đục, kết tủa Dung dịch nâu đỏ, kết tủa Kết tủa vàng, rõ rệt Kết tủa nâu, Không có kết tủa Không có kết tủa Dung dịch vàng đục, kết tủa Dung dịch nâu đỏ, kết tủa 3.5.2 Kết lựa chọn dung môi chiết Kết cho thấy chiết dung môi hữu cơ, n-hexan chiết tốt hợp chất không phân cực, số Ancaloit dạng bazơ tự không tan nước 34 mà tan dung môi n-hexan, nên phản ứng với thuốc thử cho kết dương tính, hàm lượng Ancaloit mẫu thường tồn dạng muối, chiết dung môi hữu n-hexan hay clorofom muối khó tan dung môi hữu cơ, nên dịch nước thu sau chiết dung môi hữu có chứa hàm lượng lớn muối ancaloit, kết phản ứng với thuốc thử thấy rõ ràng Khi chiết dung dịch axit, Ancaloit dạng bazơ tự chuyển sang dạng muối, muối tan tốt nước, không tan dung môi phân cực clorofom, nên cô cạn, đuổi nước thu Ankaloit dạng muối Vì phản ứng với thuốc thử xảy nhanh Trong điều kiện pH khác khả chiết Ancaloit khỏi dung dịch khác Thực nghiệm cho thấy, pH = 3, Ancaloit tồn dạng muối, phản ứng nhanh với thuốc thử; pH = 10, Ancaloit tồn dạng bazơ tự số Ancaloit có tính bazơ mạnh không bị đẩy khỏi muối, phản ứng chậm với thuốc thử Qua hai phương pháp chiết dung dịch axit dung môi hữu kết cho thấy, Ancaloit tồn chủ yếu dạng muối, tan tốt nước Khi chiết hai phương pháp kết thu gần tương đương Tuy nhiên, để đảm bảo, an toàn tiết kiệm dung môi nên thực phương pháp chiết dung dịch axit, thu muối, sau phân lập hợp chất 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, rút số kết luận sau: - Nghiên cứu tổng quan đối tượng nghiên cứu hoa sữa Nghiên cứu tổng quan lý thuyết tách chiết sỗ hợp chất thiên nhiên như: Ancaloit, Flavonoit - Nghiên cứu phương pháp tách chiết số hợp chất có hoa sữa Phương pháp xử lý mẫu, tách chiết tinh dầu hoa sữa tươi Phương pháp tách chiết dung môi hữu cơ, dung dịch axit - Định tính Ankaloit có thành phần dịch chiết Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột để tách cấu tử tinh khiết từ hoa sữa, đo GC-MS, LC-MS, cộng hưởng từ để xác định cấu trúc hợp chất Làm giàu cấu tử chính, thử hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng - Có thể nghiên cứu mở rộng xác định thành phần chất có lá, rễ hoa sữa so sánh với thành phần chất có hoa sữa Từ đó, lựa chọn nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ cho y học 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Võ Văn Chi (2003); Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1; NXB Khoa học kỹ thuật [2] Lê Văn Đăng (2005); Chuyên đề Một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Thị Thanh Huyền (2011); Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học vỏ hoa sữa; Luận văn thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Đà Nẵng [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007); Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ; NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [5] Hoàng Thị Sản (2006); Phân loại học thực vật; NXB Đại học Sư phạm [6] Abhijit Dey (2011); Alstonia scholaris R.Br (Apocynaceae): Phytochemistry and pharmacology: A concise review; Journal of Applied Pharmaceutical Science [7] Bhanu Pratap, G.S.Chakraborthy, Nandini Mogha (2013); Complete Aspects Of Alstonia Scholaris; International Journal of PharmTech Research [8] Wikipedia tiếng Việt; http://vi.wikipedia.org/wiki/Ancaloit 37 [...]... KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận Qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau: - Nghiên cứu được tổng quan về đối tượng nghiên cứu là hoa sữa Nghiên cứu được tổng quan lý thuyết về tách chiết một sỗ hợp chất thiên nhiên như: Ancaloit, Flavonoit - Nghiên cứu được phương pháp tách chiết một số hợp chất có trong hoa sữa Phương pháp xử lý mẫu, tách chiết tinh dầu trong hoa. .. NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆMA 2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu chính Hoa của cây hoa sữa (cây mò cua, mù cua) được lấy trên địa bàn thành phố Đồng Hới 2.1.2 Thu mẫu hoa và phương pháp xử lý Hoa của cây hoa sữa được thu vào tháng 11/2014, 1 /2015 tại đường Hữu Nghị, thành phố Đồng Hới Mẫu hoa tươi được hái vào ngày khô ráo, không mưa Hoa được hái khi đã nở, có mùi nồng, đã loại bỏ hoa. .. nước cất 2.2 Quy trình nghiên cứu 2.2.1 Tách, chiết tinh dầu * Sơ đồ thực hiện Hoa sữa tươi thu, xử lý Chưng cất lôi cuốn hơi nước Tinh dầu 22 Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước Hoa sữa trong phòng thí nghiệm * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa, được thu hái vào tháng 01 /2015, hoa hái vào ngày khô ráo, không mưa Mẫu hoa được chọn phải không bị sâu, bẩn, có dấu hiệu lạ Hoa nở vừa phải, nở đều,... trong hoa sữa tươi Phương pháp tách chiết trong dung môi hữu cơ, trong dung dịch axit - Định tính được Ankaloit có trong thành phần dịch chiết 2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột để tách được các cấu tử tinh khiết từ hoa sữa, đo GC-MS, LC-MS, cộng hưởng từ để xác định cấu trúc các hợp chất chính Làm giàu các cấu tử chính, thử hoạt tính sinh học và nghiên cứu các phản... Làm giàu các cấu tử chính, thử hoạt tính sinh học và nghiên cứu các phản ứng chuyển hóa chúng - Có thể nghiên cứu mở rộng xác định thành phần các chất có trong lá, rễ của cây hoa sữa so sánh với thành phần các chất có trong hoa sữa Từ đó, sẽ lựa chọn được nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu các hoạt tính sinh học phục vụ cho y học 36 ... thực hiện: Hoa sữa khô Ngâm etanol 95o Lọc Bã hoa, bỏ Dịch etanol Cô đuổi, thu hồi dung môi Cao etanol Chiết n-hexan Dịch nước Dịch n-hexan Cô đuổi dung môi Chiết clorofom Dịch nước Dịch clorofom Cao n-hexan Đuổi bớt dung môi Dịch CHCl3 đậm đặc * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa tươi được phơi khô, tránh ánh nắng trực tiếp, tránh ẩm mốc, tạp chất làm ảnh hưởng đến các chất có trong thành phần hoa sữa, tránh... chất có tính phân cực hoặc không phân cực như các hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa Một số chất tan kém trong nước nhưng tan tốt trong ancol như metanol hay etanol Mục đích của việc sử dụng etanol là hòa tan gần như toàn bộ chất hữu cơ có trong mẫu hoa sữa khô, mặt khác thì etanol ít độc hơn metanol Chiết với cao etanol, mẫu hoa sữa tươi có khối lượng là 700g, sau khi phơi khô có khối lượng là 80g (chiếm... Nếu sử dụng bột Zn thay thế cho bột Mg, thì chỉ có flavanonol cho màu đỏ xậm, còn flavanon cho màu hồng nhạt hoặc không màu [4] 1.4.2 Hợp chất flavonoid có trong cây hoa sữa Nghiên cứu trước đây cho thấy có 8 loại flavonoid trong cây hoa sữa gồm: kaempferol, quercetin, isorhamnetin, kaempferol-3-0-beta-D-galactopyranoside, quercetin-3-0-beta-D-galactopyranoside, isorhamnetin-3-0-beta-D-galactopyranoside,kaempferol-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(2-1)-0beta-D-galactopyranoside,... quercetin-3-0-beta-D-xylopyranosyl-(21)-0-beta-D-galactopyranoside [3] 1.5 Phương pháp tách một số hợp chất hữu cơ có trong hoa sữa 1.5.1 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Áp suất hơi bão hòa của hỗn hợp chất lỏng tan vào nhau được xác định theo áp suất hơi của các cấu tử riêng theo định luật Raun: P = PA + PB Áp suất hơi của hỗn hợp, nếu không tạo thành hỗn hợp đẳng phí, nằm giữa áp suất hơi của các... biến đổi các chất trong đó, làm sai lệch ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu - Mẫu hoa sau khi được phơi khô, đến độ ẩm còn khoảng 10%, ngâm ngập trong etanol 95o Bình được đậy kín - Lọc dịch etanol, loại bã Lắp hệ thống cô đuổi, thu hồi dung môi, chưng đuổi dung môi trong bình cầu thể tích 250ml Hệ thống tương tự chưng cất lôi cuốn hơi nước hoa sữa tươi Nhiệt độ đặt đuổi dung môi khoảng 60 - 70 oC Đuổi dung
- Xem thêm -

Xem thêm: KHÓA LUẬN 2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TP HOA SỮA, KHÓA LUẬN 2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TP HOA SỮA, KHÓA LUẬN 2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TP HOA SỮA

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nạp tiền Tải lên
Đăng ký
Đăng nhập