Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men

65 14 0
  • Loading ...
1/65 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 26/11/2016, 15:52

TÓM TẮT ĐỒ ÁNNghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men. Nội dung nghiên cứu:Nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn.Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, độ ẩm, nhiệt độ,tỷ lệ cơ chất, pH tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum.Nghiên cứu quá trình đồng thời chuyển hóa chitin và lên men để tạo Glucosamin dưới xúc tác enzym chitinase.Đề tài đã đạt được một số kết quả như sau: 1. Thu nhận được enzyme chitinase từ quá trình nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum trên môi trường rắn.2. Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase trên môi trường rắn thu được enzym có hoạt tính cao tại: Thời gian nuôi cấy: 5 ngày Độ ẩm: 55 % Nhiệt độ: 300C Tỷ lệ cơ chất: 1,6 % trên tổng khối lượng môi trường. pH: 53. Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đồng thời lên men và chuyển hóa chitin bằng enzyme chitinase tạo ra hàm lượng đường amin nhiều nhất tại các điều kiện: Thời gian chiết: 24 giờ. Hàm lượng cơ chất bổ sung vào quá trình trích ly: 3gml. Bổ sung cơ chất trong 4 lần, mỗi lần ¼ tổng lượng cơ chất tối ưu. TRNG I HC KHOA === === N TT NGHIP ti: NGHIÊN CứU THU NHậN ENZYME CHITINASE Từ CHủNG NấM TRICHODERMA HAZIANUM TRÊN MÔI TRƯờNG RắN Và KHảO SáT KHả NĂNG CHUYểN HóA CHITIN TRONG QUá TRìNH LÊN MEN Giỏo viờn hng dn: ThS o Th Thanh Xuõn Sinh viờn thc hin: Lờ Th Phng Lp: Mó s sinh viờn: - 2012 B GIO DC V O TO CNG HềA X HI CH NGHA VIT NAM TRNG C LP - T DO - HNH PHC NHIM V N TT NGHIP H v tờn sinh viờn: Lờ Th Phng S hiu sinh viờn: 0852040456 Khúa: 49 Ngnh: Cụng Ngh thc phm Tờn ti: Nghiờn cu thu nhn enzyme chitinase t chng nm Trichoderma hazianum trờn mụi trng rn v kho sỏt kh nng chuyn húa chitin quỏ trỡnh lờn men Ni dung nghiờn cu, thit k tt nghip: H tờn cỏn b hng dn: ThS o Th Thanh Xuõn Ngy giao nhim v ỏn: Ngy thỏng nm Ngy hon thnh ỏn: Ngy thỏng nm Ngy thỏng nm 2012 Ch nhim b mụn Cỏn b hng dn (Ký, ghi rừ h, tờn) (Ký, ghi rừ h, tờn) Sinh viờn ó hon thnh v np ỏn tt nghip ngy thỏng nm 2012 Ngi duyt (Ký, ghi rừ h, tờn) B GIO DC V O TO CNG HềA X HI CH NGHA VIT NAM TRNG I HC VINH C LP - T DO - HNH PHC BN NHN XẫT N TT NGHIP H v tờn sinh viờn: Lờ Th Phng S hiu sinh viờn: 0852040456 Khúa: 49 Ngnh: Cụng ngh thc phm Cỏn b hng dn: ThS o Th Thanh Xuõn Cỏn b duyt: Ni dung nghiờn cu, thit k: Nhn xột ca cỏn b hng dn: Ngy thỏng nm 2012 Cỏn b hng dn (Ký, ghi rừ h, tờn) B GIO DC V O TO CNG HềA X HI CH NGHA VIT NAM TRNG I HC VINH C LP - T DO - HNH PHC BN NHN XẫT N TT NGHIP H v tờn sinh viờn: Lờ Th Phng S hiu sinh viờn: 0852040456 Khúa: 49 Ngnh: Cụng ngh thc phm Cỏn b hng dn: ThS o Th Thanh Xuõn Cỏn b duyt: Ni dung nghiờn cu, thit k: Nhn xột ca cỏn b duyt: Ngy thỏng nm 2012 Cỏn b duyt (Ký, ghi rừ h, tờn) ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn LI CM N ỏn c thc hin ti phũng thớ nghim ca B mụn Cụng ngh Húa thc phm, Trng i hc Vinh hon thnh c ỏn ny ngoi s c gng ca bn thõn tụi ó nhn c rt nhiu s ng viờn, giỳp ca nhiu cỏ nhõn v th Trc ht, tụi xin by t lũng bit n sõu sc n ThS o Th Thanh Xuõn, ging viờn Khoa Húa hc, trng i hc Vinh ó tn tỡnh hng dn tụi sut quỏ trỡnh nghiờn cu v hon thnh ỏn tt nghip Xin cựng by t lũng bit n chõn thnh ti cỏc thy cụ giỏo, ngi ó em li cho tụi nhng kin thc b tr, vụ cựng cú ớch nhng nm hc va qua Cng xin gi li cỏm n chõn thnh ti cỏc thy cụ giỏo, cỏn b k thut viờn phũng thớ nghim Húa thc phm, Phũng Húa vụ c ó to iu kin v giỳp em thi gian nghiờn cu v hon thnh ỏn tt nghip Cui cựng, tụi xin gi li cỏm n n gia ỡnh, bn bố, nhng ngi ó luụn bờn tụi, ng viờn v khuyn khớch tụi quỏ trỡnh thc hin ti nghiờn cu ca mỡnh Vinh, thỏng 12 nm 2012 Sinh viờn Lờ Th Phng SVTH: Lờ Th Phng i Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn TểM TT N Nghiờn cu thu nhn enzyme chitinase t chng nm Trichoderma hazianum trờn mụi trng rn v kho sỏt kh nng chuyn húa chitin quỏ trỡnh lờn men Ni dung nghiờn cu: Nuụi cy nm Trichoderma hazianum sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn Nghiờn cu nh hng ca thi gian, m, nhit ,t l c cht, pH ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase t chng nm Trichoderma hazianum Nghiờn cu quỏ trỡnh ng thi chuyn húa chitin v lờn men to Glucosamin di xỳc tỏc enzym chitinase ti ó t c mt s kt qu nh sau: Thu nhn c enzyme chitinase t quỏ trỡnh nuụi cy nm Trichoderma harzianum trờn mụi trng rn Nghiờn cu c mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh sinh tng hp chitinase trờn mụi trng rn thu c enzym cú hot tớnh cao ti: - Thi gian nuụi cy: ngy - m: 55 % - Nhit : 300C - T l c cht: 1,6 % trờn tng lng mụi trng - pH: Nghiờn cu c mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh ng thi lờn men v chuyn húa chitin bng enzyme chitinase to hm lng ng amin nhiu nht ti cỏc iu kin: - Thi gian chit: 24 gi - Hm lng c cht b sung vo quỏ trỡnh trớch ly: 3g/ml - B sung c cht ln, mi ln ẳ tng lng c cht ti u SVTH: Lờ Th Phng ii Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn MC LC Trang LI CM N i TểM TT N ii DANH MC CC HèNH, BNG vi M U .1 Lớ chn ti .1 Mc tiờu, yờu cu v ý ngha ca ti CHNG TNG QUAN .3 1.1 Chng nm si Trichoderma hazianum 1.1.1 Gii thiu chng 1.1.2 Ngun dinh dng c bn ca chng Trichoderma hazianum 1.2 Enzyme Chitinase 1.2.1 nh ngha 1.2.2 Phõn loi .7 1.2.3 Cu trỳc ca h enzyme Chitinase 1.2.4 Cỏc c tớnh c bn ca enzym chitinase 10 1.2.5 Cỏc loi c cht ca enzym Chitinase .12 1.2.6 C ch tỏc dng 13 1.2.7 C ch cm ng 15 1.2.8 Ngun thu nhn Chitinase 16 1.2.9 ng dng ca chitinase .18 1.2.10 Tỡnh hỡnh nghiờn cu thu nhn chitinase t Trichoderma 21 1.3 Glucosamin 22 1.3.1 Cu trỳc húa hc v tinh cht húa lý ca glucosamin .22 1.3.2 Tỏc dng ca glucosamin 23 1.3.3 Tỡnh hỡnh nghiờn cu sn xut glucosamin trờn th gii v Vit Nam 24 CHNG VT LIU, PHNG PHP .27 SVTH: Lờ Th Phng iii Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn 2.1 Vt liu v húa cht, mụi trng 27 2.1.1 Vt liu 27 2.1.2 Thit b v húa cht 27 2.1.3 Cỏc mụi trng 29 2.2 Phng phỏp nghiờn cu 29 2.2.1 Phng phỏp xỏc nh hot enzyme chitinase 29 2.2.2 Phng phỏp xỏc nh ng amin theo Elson-Morgan [19] 30 2.2.3 Phng phỏp iu ch chitin t v tụm bng phng phỏp húa hc 31 2.2.4 Phng phỏp thu nhn enzym chitinase trờn mụi trng rn 33 2.2.5 Phng phỏp nghiờn cu mt s yu t nh hng ờn s sinh tng hp enzyme chitinase 34 2.2.6 Phng phỏp nghiờn cu nõng cao hiu sut thy phõn to ng amin ca chitinase 38 CHNG KT QU V THO LUN 40 3.1 Nghiờn cu quỏ trỡnh sinh tng hp enzym t chng Trichodermar trờn mụi trng rn 40 3.1.1 Nghiờn cu nh hng ca thi gian nuụi cy n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn 41 3.1.2 Nghiờn cu nh hng ca m n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn 42 3.1.4 Nghiờn cu nh hng ca c cht n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn 44 3.1.5 Nghiờn cu nh hng ca pH n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn 45 3.2 Quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin 47 3.2.1 Nghiờn cu thi gian quỏ trỡnh ng thi lờn men v chuyn húa chitin 47 3.2.2 Nghiờn cu hm lng c cht ti u cho quỏ trỡnh ng thi chit enzym v thy phõn chitin 48 3.2.3 Nghiờn cu cỏch b sung c cht cho quỏ trỡnh ng thi chit enzym v thy phõn chitin 49 KT LUN 51 TI LIU THAM KHO 52 SVTH: Lờ Th Phng iv Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip SVTH: Lờ Th Phng GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn v Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn DANH MC CC HèNH, BNG Trang Hỡnh: Hỡnh 1.1 Bo t v quỏ th nm Trichoderma hazianum .3 Hỡnh 1.2 Bo t nm Trichoderma hazianum Hỡnh 1.3 V trớ thy gii phõn t chitin bi enzyme chitinase Hỡnh 1.4 S phõn ct chitin bi enzyme thuc nhúm chitinase Hỡnh 1.5 Mụ hỡnh cu trỳc Khụng gian ca enzyme chitinase Serratia marcescens .9 Hỡnh 1.6 Mụ hỡnh cu trỳc khụng gian ca chitinase Hodeum Vulgale Hỡnh 1.7 Cu trỳc húa hc ca Allosamidin v dn xut Allosamidin 11 Hỡnh 1.8 Cu trỳc húa hc ca chitin 12 Hỡnh 1.9 Cỏc dng lp th ca chitin 13 Hỡnh 1.10 C ch thy gii ti trung tõm hot húa ca enzyme chitinase 14 Hỡnh 1.11 Cỏc v trớ kt ni gia c cht chitin v enzyme chitinase ti trung tõm hot húa .15 Hỡnh 1.12 Cụng thỳc cu to ca glucosamin 23 Hỡnh 2.1 Trichoderma phỏt trin trờn mụi trng PGA .27 Bng 2.1 Cỏch pha nng glucosamin 300 - 500àg/ml 31 Hỡnh 2.2 Chitin 32 Hỡnh 2.3 Chitin huyn phự 1% 33 Hỡnh 3.1 ng chun Glucosamin nng 300 ữ500 (àg/ml) 40 Hỡnh 3.2 So sỏnh gia lờn men trờn mụi trng rn v mụi trng lng 40 Bng 3.1 nh hng ca thi gian nuụi cy ti hot enzym chitinase 41 Hỡnh 3.3 nh hng ca thi gian nuụi cy ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase 41 Bng 3.2 nh hng ca m mụi trng ti hot enzym chitinase 42 Bng 3.3 nh hng ca nhit nuụi cy ti hot 43 Hỡnh 3.5 nh hng ca yu t nhit ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase .43 Bng 3.4 nh hng t l c cht ti hot enzym chitinase 44 Hỡnh 3.6 nh hng ca ngun c cht ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase 45 SVTH: Lờ Th Phng vi Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn CHNG KT QU V THO LUN 3.1 Nghiờn cu quỏ trỡnh sinh tng hp enzym t chng Trichodermar trờn mụi trng rn Mụi trng rn c la chn bao gm: khoỏng + 2,5g cỏm go + 10g tru + 12,5ml chitin huyn phự 5%, c hp kh trựng 1210C, 20 phỳt Tip ging t mụi trng M2(hỳt 5ml) vo mụi trng rn tuyn chn Chng T.Harzianum 095 TH nuụi nhit = 300C, sau ngy tin hnh thu dch enzym o xỏc nh hot hot (kt qu hin th hỡnh 3.2) Hot chitinase c xỏc nh bng cụng thc: Trong ú a l hm lng N- acetyl- glucosamin v hm lng ng amin ny c nh lng da vo ng chun ng chun xõy dng c nh sau: Hỡnh 3.1 ng chun Glucosamin nng 300 ữ500 (àg/ml) Hỡnh 3.2 So sỏnh gia lờn men trờn mụi trng rn v mụi trng lng SVTH: Lờ Th Phng 40 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Da vo hỡnh 3.2 ta thy hot ca enzym chitinase thu c trờn mụi trng rn cao hn hn so vi mụi trng lng Kh nng sinh tng hp chitinase t vi sinh vt khụng nhng ph thuc thnh phn dinh dng mụi trng m cũn chu nh hng ca cỏc yu t ngoi cnh khỏc nh nhit , pH, m cỏc nghiờn cu tip theo c tin hnh nhm nghiờn cu mt s yu t tỏc ng ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase 3.1.1 Nghiờn cu nh hng ca thi gian nuụi cy n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn Thi gian cng di thỡ lng enzym to thnh cng nhiu, nhiờn iu ny ch xy mt gii hn nht nh, lng c cht chitin ó ht thỡ kh nng sinh trng v phỏt trin ca T.Harzianum s gim Tin hnh nghiờn cu thi gian nuụi cy chng T.Harzianum 095 TH trờn mụi trng rn tuyn chn M3 vũng 3,4,5,6,7 ngy Sau s ngy nuụi cy kho sỏt trờn, ta tin hnh chit bng 50ml ờm acetat 4.5 1h Sau ú lc dch a i xỏc nh hot enzym Sau ú thu dch enzym i o trờn mỏy UV cho kt qu tớnh toỏn nh sau: Bng 3.1 nh hng ca thi gian nuụi cy ti hot enzym chitinase Thi gian nuụi cy (ngy) Mt quang OD 0.3325 0.6973 1.023 0.8981 0.5679 Hot chitinase (àmol /g/phỳt) 0.111 0.303 0.476 0.409 0.177 Hỡnh 3.3 nh hng ca thi gian nuụi cy ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase SVTH: Lờ Th Phng 41 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Da vo hỡnh 3.3 ta nhn thy rừ rng chng Trichoderma Harzianum 095 TH c nuụi cy mụi trng rn s thu c enzym chitinnase cú hot lc cao nht ngy th 5(0.476 àmol /g/phỳt) vy cỏc nghiờn cu tip theo chng s tin hnh nuụi mụi trng rn M3 n ngy th o hot tớnh 3.1.2 Nghiờn cu nh hng ca m n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn m l yu t cn thit cho hot ng ca vi sinh vt quỏ trỡnh phỏt trin m nh hng n s sinh trng v s trao i cht ca vi sinh vt quỏ trỡnh lờn men rn Ngoi m cũn nh hng ti s khuych tỏn O ú s lm nh hng ti hot lc ca enzyme xỏc inh m, dch nhõn ging s c nuụi mụi trng rn tuyn chn M3 Thao tỏc tin hnh nh mc 2.2.4 Sau thi gian= ngy nuụi cy thu c kt qu nh sau: Bng 3.2 nh hng ca m mụi trng ti hot enzym chitinase m (%) 50% 55% 60% 65% Mt quang OD 0.875 1.138 0.947 0.5973 Hot chitinase (àmol/g/phỳt) 0.398 0.537 0.436 0.251 Hỡnh 3.4 nh hng ca m mụi trng ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase SVTH: Lờ Th Phng 42 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Trờn hỡnh 3.4: Cho thy m cú nh hng khụng nh ti quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca nm Trichodermar m mụi trng l 55% l m thớch hp nht cho quỏ trỡnh sinh tng hp enzym i vi chng 095(2)TH nghiờn cu Nú cho hot tớnh cao hn nhiu so vi cỏc khong m khỏc, hot ca chitnase t 0.537 (àmol /g/phỳt) Hot thu c t chng ny cao tng ng vi cỏc chng Trichoderma cú hot tớnh chitinase ó c cụng b trờn th gii 3.1.3 Nghiờn cu nh hng ca nhit n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn Mi mt loi vi sinh vt cú th sinh trng v phỏt trin mt khong nhit nht nh Nhit mụi trng nuụi cy quỏ thp hoc quỏ cao u nh hng ti s phỏt trin ca vi sinh vt v ú cng s nh hng ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym ca chỳng nghiờn cu nh hng ca nhit , ta thay i nhit mụi trng nuụi cy khong t 250C n 450C Tin hnh nuụi chng T.Harzianum 095 TH trờn mụi trng rn tuyn chn M3 Sau ngy, tri qua giai on sinh trng v phỏt trin, tin hnh chit bng 50ml m acetat 4,5 lc em xỏc nh hot enzym Cỏc mu nuụi cy cho kt qu sau: Bng 3.3 nh hng ca nhit nuụi cy ti hot Nhit (0C) 25 30 35 40 45 Mt quang OD 0.7869 1.4887 0.9928 0.5679 0.4672 Hot chitinase (àmol /g/phỳt) 0.351 0.236 0.183 0.723 0.461 Hỡnh 3.5 nh hng ca yu t nhit ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase SVTH: Lờ Th Phng 43 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Trờn hỡnh 3.5 Cho thy nhit cú tỏc ng ln ti quỏ trỡnh sinh trng v phỏt trin ca nm Trichodermar Harzianum 095(2)TH 300C l nhit thớch hp nht cho quỏ trỡnh sinh tng hp enzym i vi chng nghiờn cu Nú cho hot tớnh cao hn nhiu so vi cỏc khong nhit khỏc v ti nhit ny hot ca chitnase 0.723(àmol /g/phỳt) Hot thu c t chng ny cao tng ng vi cỏc chng Trichodermar Harzianum cú hot tớnh chitinase cao nht ó c cụng b trờn th gii [10] Ta ly nhit ny kho sỏt cỏc nh hng tip theo 3.1.4 Nghiờn cu nh hng ca c cht n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn C cht chitin l cht cm ng quỏ trỡnh sinh tng hp ng thi l ngun dinh dng cho s sinh trng v phỏt trin ca nm mc Nng c cht nh hng ti kh nng thm thu ca mng t bo vi sinh vt, vỡ vy m nú nh hng ti quỏ trỡnh sinh trng cng nh quỏ trỡnh sinh tng hp chitinase nghiờn cu nh hng ca nng chitin ti quỏ trỡnh sinh tng hp chitinase, chỳng tụi tin hnh nuụi cy cỏc chng trờn mụi trng rn M3 thi gian= ngy, nhit = 300C Nghiờn cu c thc hin vi chng Trichodermar 095(2)_ TH, cú cht chitin iu ch t v tụm Nng chitin c thay i 0.97%, 1.6%, 2.3%, 3.2% so vi tng lng mụi trng rn a vo Sau ú trớch ly v o, xỏc nh hot enzym chitinase to thnh Kt qu thu c nh sau: Bng 3.4 nh hng t l c cht ti hot enzym chitinase C cht/ mụi trng (%) 0.97% 1.6% 2.3% 3.2% Mt quang OD 0.9930 1.553 0.7272 0.3017 Hot chitinase (àmol /g/phỳt) 0.495 0.757 0.320 0.095 SVTH: Lờ Th Phng 44 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Hỡnh 3.6 nh hng ca ngun c cht ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase Qua kt qu ny ta cú th khng nh ngun c cht cng cú tỏc ng khụng nh ti kh nng sinh trng v phỏt trin ca chng nm Trichoderma Nu quỏ ớt thỡ lng enzym to khụng nhiu, nhng nu lng c cht m quỏ nhiu hn so vi kh nng tiờu th ca chng nm thỡ hot ca enzym khụng nhng khụng cao hn m cũn b gim i Do lỳc ny lng enzym ó c to thnh s quay li s dng ngun c cht cũn d mụi trng nu thi gian quỏ di V nng chitin l 5% tng ng vi 1.6% (lng chitin/ tng lng ca mụi trng rn tuyn chn), l t l ti u vỡ hot ca enzym o c l ln nht 0.757 (àmol /g/phỳt) 3.1.5 Nghiờn cu nh hng ca pH n quỏ trỡnh sinh tng hp enzyme chitinase trờn mụi trng rn Theo [Jolles.P, Muzzaralli.A.R (1999)] Giỏ tr pH ti u ca enzyme chitinase thng giao ng khong t - i vi cỏc chitinase thc vt bc cao v to ng vt l 4,8-7,5 v vi sinh vt l 3,5-8,0 pH ti thớch ca enzyme chitinase cũn ph thuc vo c cht c s dng Tựy mc ớch phõn tớch, nhng c cht hũa tan nh glycol chitin v N- acetyl chitooligosacharid c s dng thay th cho chitin thỡ pH ti u nm khong giỏ tr pH kim yu nghiờn cu nh hng ca pH mụi trng thỡ chng nm sau tri qua giai on sinh trng v phỏt trin mụi trng M3 Vi tt c cỏc iu kin ti u ó nghiờn cu trờn: nng chitin 1.6% v nhit nuụi cy l 30 0C, sau ngy nuụi cy Tin hnh nuụi cỏc iu kin pH khỏc t 4-8 Sau thu dch enzym xỏc nh hot enzym cỏc mu nuụi cy cho kt qu: SVTH: Lờ Th Phng 45 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Bng 3.5 nh hng ca pH nuụi cy ti hot enzym chitinase pH Mt quang OD 1.1581 1.6993 1.0038 0.5923 0.2419 Hot chitinase (àmol /g/phỳt) 0.548 0.834 0.466 0.248 0.063 Hỡnh 3.7 nh hng ca yu t pH ti quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase Qua bng kt qu ta thy hot ca enzyme chitinase cao nht ti giỏ tr pH 0.834 (àmol /g/phỳt) nu pH ca mụi trng cao hn hay thp hn thỡ u b c ch pH quỏ thp hay quỏ cao hn u lm cho chng Trichodermar sinh tng hp enzyme chitinase cú hot kộm T tt c cỏc kt qu nghiờn cu trờn ta cú th khng nh rng nuụi cy sinh tng hp chng nm Trichodermar trờn mụi trng bỏn rn thu c enzym cú hot lc cao hn hn (gp hn ln)vi mụi trng lng õy cú th coi l mt tin tt cho quỏ trỡnh sinh tng hp, thu nhn enzym ng dng vo cỏc lnh v khỏc nhau, v c th nht l sn xut glucosamin Vic sn xut glucosamin cú th thc hin bng nhiu phng phỏp khỏc nhau, nhng sn xut theo ng sinh hc luụn em li li ớch to ln Vỡ th cỏc nghiờn cu trung vo nõng cao hiu sut thy phõn c cht di xỳc tỏc ca cỏc enzym tng ng SVTH: Lờ Th Phng 46 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn 3.2 Quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin Vi mụi trng nuụi cy b mt, thu enzym phi s dng m chit enzym mụi trng rn sau ú s dng enzym thu c dch chit thy phõn c cht vi phng phỏp ny thỡ hm lng N-acetyl- glucosamin cao nht ch t 1,2g/l Tuy nhiờn quỏ trỡnh sinh tng hp enzym cú th tip tc xy nu c b sung c cht, vỡ vy chỳng tụi tin hnh quỏ trỡnh lờn men ng thi vi chuyn húa chitin, nhm tớch ly c sn phm glucosamin cao hn tin hnh nghiờn cu: chng nm Trichodermar 095 TH c nuụi cỏc bỡnh tam giỏc 500ml cha mụi trng rn tuyn chn M3, sau ngy ta b sung 50ml m chit acetat 4,5 cựng vi lng c cht nht nh Do b sung c cht vo nờn lỳc ny bỡnh tam giỏc 500ml xy ng thi cỏc quỏ trỡnh: - Quỏ trỡnh sinh tng hp enzym chitinase tip tc din - Enzym chitinase liờn tc c chit vo m - Din quỏ trỡnh thy phõn chitin thnh ng amin quỏ trỡnh din hiu qu, thu hi hm lng N-acetyl- glucosamin nhiu nht chỳng tụi tin hnh kho sỏt cỏc yu t: thi gian quỏ trỡnh ng thi lờn men v chuyn húa chitin, lng c cht b sung vo v cỏch b sung nh th no cho hp lý nht 3.2.1 Nghiờn cu thi gian quỏ trỡnh ng thi lờn men v chuyn húa chitin Sau ngy nuụi cy trờn mụi trng rn tuyn chn M3, ó tin hnh kho sỏt thi gian trớch li enzym chitinase ng thi chuyn húa chitin thnh glucosamin ti cỏc thi im: gi, gi, 24 gi, 29 gi, 48 gi Sau ú tin hnh lc dch a i xỏc nh hm lng ng amin Kt qu nh sau: Bng 3.6 nh hng ca thi gian ti quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin Thi gian (h) 24 29 48 Mt quang OD 1.2038 1.9978 3.9767 3.7829 3.6977 Hm lng glucosamin (g /l) 0.9835 1.7053 3.5043 3.3281 3.2506 SVTH: Lờ Th Phng 47 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Hỡnh 3.8 nh hng ca thi gian ti quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin Nhỡn vo hỡnh v trờn ta thy, thi gian trớch ly cng kộo di thỡ hm lng ng amin dch trớch ly mụi trng lờn men cng tng Nhng ti lỳc no ú kh nng to ng amin khụng cũn thỡ s tớch ly s dng li vỡ th vic thi gian quỏ trỡnh trớch ly quỏ di, khụng nhng khụng nõng cao hm lng ng m cũn gõy tn kộm v tin ca v thi gian Nh vy thi gian trớch ly 24 gi l thi gian ti u nht cho trớch ly kt hp vi chuyn húa chitin thnh ng amino hũa tan 3.2.2 Nghiờn cu hm lng c cht ti u cho quỏ trỡnh ng thi chit enzym v thy phõn chitin t c t l chuyn húa chitin thnh ng amin cao, ó s dng phng phỏp thờm c cht cho quỏ trỡnh ng thi lờn men v chuyn húa chitin Sau ngy nuụi cy trờn mụi trng rn tuyn chn M3 ó tin hnh kho sỏt cỏc nng chitin khỏc cho quỏ trỡnh ng thi chit enzym v thy phõn chitin din tt nht Tin hnh cỏc thớ nghim b sung c cht chitin vi lng b sung di: 2,5g/ml, 3g/ml, 4,5g/ml, 6,75g/ml Sau ú tin hnh lc dch a i xỏc nh hm lng ng amin Kt qu nh sau: SVTH: Lờ Th Phng 48 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Bng 3.7 nh hng ca hm lng c cht ti quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin Hm lng c cht (g/ml) 2.5 4.5 6.75 Mt quang OD 3.8775 5.0021 3.0123 2.6397 Hm lng glucosamin (g /l) 3.4141 4.4365 2.6275 2.341 Hỡnh 3.9 nh hng ca hm lng c cht ti quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin Kt qu kho sỏt cỏc thớ nghim cho thy: hm lng glucosamin trớch li ti thi im 24 gi nng c cht b sung l g/ml t cao nht (4.4365g /l) chng t sau nuụi mụi trng rn tuyn chn tin hnh chit v b sung lng c cht l g/ml vo thỡ s thỳc y quỏ trỡnh chuyn húa chitin cỏch nhanh chúng nht to hm lng glucosamin nhiu nht sau 24 gi chit Vic tng hm lng c cht vo mụi trng ti mc 4.5g/ml khụng lm tng s chuyn húa ng, m ngc li hm lng ng amin ch t 2.6275 (g /l) nguyờn nhõn ca hin tng ny l c cht b sung vo mụi trng quỏ nhiu gõy c ch hot ng ca enzym chitinase 3.2.3 Nghiờn cu cỏch b sung c cht cho quỏ trỡnh ng thi chit enzym v thy phõn chitin Sau ngy nuụi cy trờn mụi trng rn tuyn chn M3 thờm 50ml ờm acetat 4.5 + 3g/ml c cht thc hin quỏ trỡnh chit Nhng cỏch b khỏc SVTH: Lờ Th Phng 49 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Vi cựng lng c cht thờm vo quỏ trỡnh chit ny l g/l chỳng ta b sung theo cỏch, tin hnh thớ nghim ng thi: Mt mu thớ nghim b sung c cht ln Mu cũn li mt mu b sung ln, ln thờm vo vi lng = 1/4 ti cỏc thi im gi gi gi gi Kt thỳc 24 gi trớch ly lc, thu dch thy phõn Sau ú tin hnh lc v hỳt 1ml hn hp em i thc hin phn ng thy phõn Xỏc nh hm lng ng amin theo Elson-Morgan Kt qu c th nh sau: Bng 3.8 nh hng ca cỏch b sung c cht ti quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin S ln b sung lng 3g/ml Mt quang OD 4.8997 6.693 Hm lng glucosamin (g /l) 4.3434 5.9736 Hỡnh 3.10 nh hng ca cỏch b sung c cht ti quỏ trỡnh lờn men v chuyn húa ng thi chitin Kt qu trờn hỡnh cho thy vic b sung cựng lng c cht nh nhau, nhng nu phng phỏp b khỏc thỡ hm lng ng amin to cng khụng ging Kt qu sau ln b sung tng 1,5 ln so vi vic ch b sung ln c cht nht SVTH: Lờ Th Phng 50 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn KT LUN ti ó t c mt s kt qu nh sau: Thu nhn c enzyme chitinase t quỏ trỡnh nuụi cy nm Trichoderma harzianum trờn mụi trng rn Nghiờn cu c mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh sinh tng hp chitinase trờn mụi trng rn thu c enzym cú hot tớnh cao ti: - m: 55 % - T l c cht: 1,6 % trờn tng lng mụi trng - Thi gian nuụi cy: ngy - Nhit : 300C - pH: Nghiờn cu c mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh ng thi lờn men v chuyn húa chitin bng enzyme chitinase to hm lng ng amin nhiu nht ti cỏc iu kin: - Thi gian chit: 24 gi - Hm lng c cht b sung vo quỏ trỡnh trớch ly: 3g/ml - B sung c cht ln, mi ln ẳ tng lng c cht ti u SVTH: Lờ Th Phng 51 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn TI LIU THAM KHO Ti liu ting Vit: Bựi Xuõn ng - Nguyn Huy Vn (2000), Vi Nm dựng cụng ngh sinh hc NXB KH & KT H Ni Phm Minh Hiu (2005), Kho sỏt quỏ trỡnh cm ng tng hp h enzyme chitinase ca cỏc chng nm mc Trichoderma harzianum, Khúa lun tt nghip C nhõn Sinh Hc, Trng i Hc KHTN TP HCM Trn Th Luyn, Hunh Nguyn Duy Bo v mt s cng s Hon thin quy trỡnh sn xut Chitin-Chitosan v ch bin mt s sn phm cụng nghip t ph liu v tụm, cua Bỏo cỏo khoa hc, ti cp b Nha Trang.2000 Phm Lờ Dng, Trnh Bỡnh, Li Thu Hin v cựng cỏc cng s Vt liu sinh hc t chitin Vin húa hc - Vin cụng ngh sinh hc, Trung tõm khoa hc t nhiờn v Cụng ngh quc gia H Ni.1997 Nguyn c Lng, Cao Cng, Nguyn nh Tuyt (2004), Cụng Ngh enzyme NXB HQG TP.HCM Tụ Duy Khng (2007), Kho sỏt s sinh tng hp chitinase Trichoderma spp v kh nng i khỏng vi mt s nm gõy bnh thc vt, Lun Vn Thc S ngnh sinh hc, i Hc KHTN TP.HCM Lờ Quc Phong (2000), Kho sỏt cỏc c tớnh ca enzyme chitinase chit tỏch t nm mc Trichoderma harzianum, Khúa lun c nhõn sinh hc, Trng i hc KHTN TP.HCM Lờ Ngc Tỳ, La Tr, Phm Chõn Chõu (1982), Enzyme vi sinh vt (Tp 1, 2) NXB KH & KT H Ni ỡnh Róng, Phm ỡnh Cng, Xỏc nh hm lng chitin ca mt s loi thy sn Vit Nam v chuyn húa thnh glucosamin Tp khoa hc, N0 4, tr 66- 71, 1990 10 Nguyn La Anh, Quỏch Th Vit (2011), Nghiờn cu ng thi chuyn húa v lờn men ng thi to glucosamin t chitosan hiu sut cao Tp khoa hc cụng ngh pp 190- 197 11 Lu Vn Chớnh, Chõu Vn Minh, Phm Hu in, V Mnh Hựng, Ngụ Th Thun Tng hp v nghiờn cu tỏc dng h Cholesterol mỏu ca N,N,Ntrimethyl chitosan (TMC) Tp Dc hc s 9, mc 5, nm 2000 SVTH: Lờ Th Phng 52 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip 12 GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Ts Nguyn Vnh Ngc Thuc iu tr thoỏi húa khp Khoa xng khp Bnh Vin Bch Mai H Ni Tp Sc khe & i sng ngy 30/5/2006, s 964 13 BS.Hunh Bỏ Lnh Glucosamine, thuc mi iu tr bnh viờm khp.Bnh Vin Vit c H Ni Ti liu truy cp mng internet, theo a ch: vietduchospital.edu.vn 14 Nguyn Trng Th (2004), Nghiờn cu s dng nm mc Trichoderma Harzianum phũng bnh hộo r cõy da leo Pythium sp, Lun Thc S ngnh Sinh hc, i Hc KHTN TP.HCM 15 Nguyn Th Ngc Tỳ, Nguyn Th hng Giang (1997), Bo v cõy trng bng cỏc ch phm t vi nm NXB Nụng Nghip 16 Ts Nguyn Vnh Ngc Thuc iu tr thoỏi húa khp Khoa xng khp Bnh Vin Bch Mai H Ni Tp Sc khe & i sng ngy 30/5/2006, s 964 17 Lu Vn Chớnh, Chõu Vn Minh, Phm Hu in, V Mnh Hựng, Ngụ Th Thun Tng hp v nghiờn cu tỏc dng h Cholesterol mỏu ca N,N,Ntrimethyl chitosan (TMC) Tp Dc hc s 9, mc 5, nm 2000 18 V Th Ngc Thanh, on Trng Ph, Nguyn Th Ty Nghiờn cu tỏc dng tng sinh collagen ca chitosan iu tr bng nhit thc nghim Tp Dc hc s 9, mc 9, nm 2000 Ti liu ting Anh: 19 Good T.A and Beesman S.P (1964)- Determination of glucosamin and galatosamin using borate buffers of the Elson - Morgan and Morgan Elson reaction, pp 253-262 20 Inbar J, Chet.I (1992), Biomimics of fungal cell-cell recognition by use of lectin coated nilon fibers, J bacterial 1992 Feb 174(3), pp 1055-1059 21 Jeuniaux C, Braconnot H (1971), Structure of chitin and chitosan Ann Chitin, Paris, pp - 49 - 1811 22 Jeuniaux Charles (1963), Chitinase- Methods of enzymology, Vol 4, pp 644 - 650 SVTH: Lờ Th Phng 53 Lp 49K - CN thc phm ỏn tt nghip 23 GVHD: ThS o Th Thanh Xuõn Hutchinson, S A, and M E Cowan (1972) Identification and biological effects of volatile metabolites from cultures of Trichoderma harzianum Trans Br Mycol Soc 59, 71-77 24 Jolles.P, Muzzaralli A R (1999), Chitin and Chitinase Birkhauser verlag, Basel, Switzerland, pp 125 - 133 25 Patil R.S, Ghormade V (2000), Chitinolytic enzymes: an exploration Enzyme and Microbial Technogy 26 (2000) pp 473-483 26 Harman E G, Kubicek.P.Christian (1998), Trichoderma & Gliocladium Vol 2.pp 73 - 123 27 Fridlender.M, Inbar.J, Chet.I (1993) Biological control of soilborne plant pathogens by a b-1,3 glucanase producing pseudomones cepacia Soil Biol Biochem, 1211-1221 28 Gray.W.P(1997), Chitinase - material and method Patent WO 97/47752 29 Hirano.S, Inui H, Kosaki H (1994), Biotechnology ND Bioactive polymers, Vol2,pp 34-35 30 http://www.mrc lmb.cam.ac.uk/genomes/date/lctn.html 31 http://www.reserach.cm.utexas.edu//chitin/structure.html 32 http://www.ocean.udel.edu//Research/chitin.html 33 http://delloyd.50megs.com/moreinfo/buffers2.html#buffer 34 http://www.spices.res.in/spicebioinfo/project/chitinase/result.php 35 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzymeexplorer/learning-center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html 36 http://www.scribd.com/doc/58156023/Enzyme-Chitinase SVTH: Lờ Th Phng 54 Lp 49K - CN thc phm [...]... chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men 2 Mục tiêu, yêu cầu và ý nghĩa của đề tài SVTH: Lê Thị Phương 1 Lớp 49K - CN thực phẩm Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Đào Thị Thanh Xuân 2.1 Mục tiêu Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình. .. trình lên men 2.2 Yêu cầu  Nuôi cấy nấm Trichoderma hazianum sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường rắn  Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum  Nghiên cứu quá trình đồng thời lên men và chuyển hóa chitin để tạo Nacetyl-glucosamin dưới xúc tác enzym chitinase 2.3 Ý nghĩa Tại Việt Nam cũng đã có các nghiên cứu thu nhận chitinase. .. Các nghiên cứu phần lớn tiến hành trong môi trường lỏng Cho tới năm 2003, Ashok Pandy và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma Harzianum nuôi cấy trên môi trường rắn Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao Đó chính là tiền đề để chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng. .. Felse và T Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma Harzianum trong bể lắc Năm 2003, Ashok Pandy và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ Trichoderma Harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong. .. hoạt độ enzym chitinase 46 Hình 3.7 Ảnh hưởng của yếu tố pH tới quá trình sinh tổng hợp enzym chitinase .46 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 47 Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin 48 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất tới quá trình lên men và chuyển hóa đồng thời chitin .49 Hình... (P Vyas và M.V Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trọng việc phá vỡ vách tế bào nấm Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma Năm 1991, C.J Ulhoa, J.F Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma Harzianum Năm 1999, P.A.Felse và T Panda nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitin từ Trichoderma. .. với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Noakarn Rattanakit và cộng sự, 2002).Những chủng thu c chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A.A Sherief, 1990) ; A fumigatus (Jin - Ian Xia và Jing Xiong, 2009) A.A Shubakow và P.S Kucheryavykh (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác... như trong thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamin và N-acetyl glucosamin, sản xuất thu c trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm soát nấm ký sinh trên cây trồng Chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma Harzianum Cả về sự điều hòa hay tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitinase trên môi trường nuôi cấy chìm hay lên men. .. điểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cutincun) trong quá trình biến thái hay lột xác 1.2.9 Ứng dụng của chitinase 1.2.9.1 Trong nông nghiệp  Sử dụng enzyme chitinase trong kiểm soát nấm gây bệnh thực vật Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chữa chitin Chitinase và β -1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật... chitinase từ Trichoderma hazianum Tuy nhiên hoạt lực enzym từ các chủng phân lập ở Việt Nam có hoạt tính chưa cao Đề tài mang lại một số ý nghĩa khoa học và thực tiễn cho những nghiên cứu sâu hơn về enzyme chitinase từ vi nấm Trichoderma hazianum Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về vi nấm Trichoderma hazianum, đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về vi nấm Trichoderma
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men, Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men, Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng nấm Trichoderma hazianum trên môi trường rắn và khảo sát khả năng chuyển hóa chitin trong quá trình lên men

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Từ khóa liên quan

Nạp tiền Tải lên
Đăng ký
Đăng nhập