Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM 2010 THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ThS Lê Thùy Linh Lưu hành nội Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM NỘI DUNG Bài 1: Định lượng Coliforms E coli Trang 1.1 Tóm tắt kiến thức 1.2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm 1.4 Cách tính kết 10 Bài Định lượng Staphylococcus aureus 10 2.1 Tóm tắt kiến thức 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus phương pháp MPN 2.3 Cách tiến hành cách tính kết Bài Định tính Salmonella 10 10 11 14 3.1 Tóm tắt kiến thức 3.2 Qui trình định tính Salmonella thực phẩm Bài Định lượng Bacillus cereus 14 14 20 4.1 Tóm tắt kiến thức 4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus phương pháp đếm khuẩn lạc Bài Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí tổng nấm men-nấm mốc 20 20 24 5.1 Tóm tắt kiến thức 5.2 Quy trình phân tích 24 26 Tài liệu tham khảo Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, NXB Giáo dục, 2006 http://www.microbelibrary.org http://www.chromagar.com http://www.rapidmicrobiology.com http://www.marietta.edu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bài 1: Định lượng Coliforms E coli 1.1 Tóm tắt kiến thức 1.1.1 Định nghĩa Hình 1: phát Coliforms E coli thực phẩm hay nước môi trường CHROMagar ECC Coliforms trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 370C 24 – 48 Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện loại vi sinh vật khác Nhóm Coliforms gồm giống là: E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi IMViC Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24h ủ 440C môi trường canh EC Coliforms phân (Faecal Coliforms) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24h 440C canh Trypton E coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -) 1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN) Đây phương pháp định lượng dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác Thông thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng x = ống nghiệm Quy trình thực sau: Pha loãng mẫu phân tích nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Kết biểu kiến chứng minh tăng trưởng vi sinh vật cần kiểm định Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính độ pha loãng Tra bảng Mac Crady Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Chú ý: Đa số bảng MPN cung cấp số liệu dạng số MPN 100ml dung dịch sử dụng để phân tích liều lượng 10ml, 1ml, 0.1 ml Trên thực tế phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Lượng mẫu với độ pha loãng tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu Vậy số liệu bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng 1ml dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 dùng để phân tích Trường hợp mật độ vi sinh vật cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu với hệ số pha loãng Ví dụ: sử dụng 1ml cho độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức sử dụng 1/10 lượng mẫu nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng 10 1.2 Quy trình định lượng Coliforms E coli phương pháp MPN Chuẩn bị dịch đồng pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, nồng độ có ống lặp lại, ủ 370C, 48 Ghi nhận ống LSB (+) (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, ủ 370C ± 10C, 48 Số ống (+)(sinh )ở độ pha loãng Cấy vào ống canh EC, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Số ống (+) độ pha loãng Cấy lên thạch EMB, ủ 370C, 24 Coliforms Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Xem trang sau Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Tiếp theo Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ 44.50C ± 0.20C, 24 Thử nghiệm IMViC Đếm số ống canh EC (+) IMViC ++ , tra bảng MPN E coli 1.3 Cách tiến hành thí nghiệm Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho tổ) 1.3.1 Pha môi trường khử trùng dụng cụ Bước 1: pha môi trường Tên môi trường SPW (Saline Water) Thành phần NaCl : 42.5g Pepton Pepton: 5g Tryptose: 20g LSB (Lauryl Sulphate Lactose: 5g Broth) Sodium chloride: 5g KH2PO4: 2.75g K2HPO4: 2.75g Lauryl sulphate: 0.1g BGBL Peptone: 10g Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Tổng thể tích Ghi 500 ml nước Phân phối cho tổ 27ml cất SPW (9ml/ống nghiệm) trước khử trùng (buổi 1) 1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho cất tổ (10ml/ống nghiệm) pH 6.8 ± 0.2 trước khử trùng (buổi 1) 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho Page | Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM PCA (Plate Agar) Casein enzymic Count hydrolysate: 5g Yeast extract: 2.5 g 1000 ml nước Phân phối 100ml PCA cho cất tổ (15ml/petri) (buổi pH 7.0 ± 0.2 5) Dextrose: 1g Agar: 15g Glucose: 10g DRBC (Dichloran Rose Peptone: 5g Bengal KH2PO4: 1g Chloramphenicol MgSO4: 0.5g Agar) 1000 ml nước Phân phối 100ml DRBC cất cho tổ (15ml/petri) pH 5.6 ± 0.2 (buổi 5) Lưu ý: trộn lẫn Rose bengal (dung dịch thành phần 5%, w/v): 0.5ml trừ Dichloran (0.2%(w/v) chloramphenicol, ethanol): 1ml đun nóng để hòa Chloramphenicol: 0.1g tan hết agar, hấp Agar: 15g khử trùng Để nguội đến 500C, bổ sung 1ml dung dịch kháng sinh 100X vào 100ml môi trường Bước 2: khử trùng dụng cụ môi trường pha Bao gói dụng cụ phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút bao gói Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Bước 3: pha loãng mẫu (xem 1, mục 1.3.2) Bước 4: thực qui trình Biên soạn: Lê Thùy Linh Homepage: http://lethuylinh.weebly.com Page | 26 Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Cách tính kết Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn số đĩa có số đếm khoảng 25-250 để tính kết Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men nấm mốc tính sau: Trong đó: A (CFU/g hay CFU/ml) = N n1 x V x f1 + ⋯ + ni x V x i A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm men) 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi: độ pha loãng tương ứng Nếu độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa >250, ví dụ nồng độ 10-5 số đếm lớn 250, kết ghi: >2.5 x 107 CFU/g Nếu độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm đĩa