Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa)

55 17 0
  • Loading ...
1/55 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 24/11/2016, 17:17

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN KHẮC KHÁNH Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012-2016 Thái Nguyên - 2016 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN KHẮC KHÁNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI TỤ CẦU VÀNG (Staphylococcus aureus VÀ TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Psedomonas aeruginosa) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/Ngành: Công nghệ Sinh học Lớp : K44-CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: BS NGUYỄN THỊ HUYỀN TS NGUYỄN VĂN DUY Thái Nguyên, năm 2016 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi hướng dẫn tận tình trình thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến BS Nguyễn Thị Huyền, Trưởng khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên, KTV Nguyễn Thị Thủy, CN Trần Trung Anh, Khoa Vi sinh vật, Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên hỗ trợ,giúp đỡ cung cấp chủng sinh vật để thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng thí nghiệm thuộc khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn người bạn bên cạnh động viên giúp đỡ học tập làm việc hoàn thành khóa luận Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Khắc Khánh iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Các hóa chất sử dụng đề tài nghiên cứu 23 Bảng 3.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 4.1 Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên 40 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh hiển tế bào Staphylococcus aureus Hình 2.2 Hình ảnh khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa Hình 4.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số chủng S aureus (A) chủng P aeruginosa (B) 29 Hình 4.2 Kết điện di kiểm tra khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi sử dụng nghiên cứu 31 Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện phản ứng khác 33 Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử dụng khuôn chủng S aureus P aeruginosa 35 Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR nồng độ DNA pha loãng khác 37 Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn khác 38 v MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài: 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Giới thiệu chung Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa4 2.1.1 Giới thiệu chung Staphylococcus aureus 2.1.2 Giới thiệu chung Pseumonase aeruginosa 2.2 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa nước giới 12 2.2.1 Tình hình nghiên cứu Staphylococcus aureus 12 2.2.2 Tình hình nghiên cứu Pseudomonas aeruginosa 14 2.3 Các phương pháp phát Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 17 2.3.1 Phương pháp phát Staphylococcus aureus 17 2.3.1.3 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 18 2.3.2 Các phương pháp xác định Pseudomonas aeruginosa 19 2.4.Tổng quan kỹ thuật multiplex PCR 20 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 vi 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22 3.2.1.Địa điểm nghiên cứu 22 3.2.2.Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1 Các cặp mồi sử dụng đề tài 22 3.3.2 Hóa chất sử dụng đề tài 23 3.3.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng qua trình thực đề tài 24 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA 25 3.5.2 Phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa 26 3.5.3 Phương pháp xác định nồng độ tế bào 27 3.5.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR 27 3.5.4 Xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn nghiên cứu 29 4.2 Kết xây dựng quy trình phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa kỹ thuật multiplex PCR 30 4.2.1 Kết thử nghiệm khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi sử dụng nghiên cứu 30 4.2.2 Kết xác định điều kiện chung phản ứng PCR sử dụng cặp mồi riêng rẽ 32 vii 4.2.3 Kết thử nghiệm khả khuếch đại phản ứng multiplex PCR 35 4.2.4 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR 36 4.2.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR 38 4.3 Kết thử nghiệm phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa từ mẫu thu thập bệnh viện 39 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) thách thức mối tuân tâm hàng đầu Việt Nam toàn giới Những nghiên cứu gần cho thấy NKBV làm tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng đề kháng kháng sinh tăng chi phí điều trị Thống kê cho thấy tỷ lNKBV khoảng 5-10% nước phát triển số nước phát triển tỷ lệ lên đến 25% [30] tỷ lệ cao khoa Hồi Sức Tích Cực NKBV làm gia tăng tỷ lệ tử vong bệnh viện Tại Cộng đồng Châu Âu, tỷ lệ tử vong nhiễm trùng bệnh viện 37.000 ca/năm [14] , Mỹ tỷ lệ lên tới 99.000 ca/năm Các bệnh nguyên gây NKBV có mức độ đề kháng kháng sinh cao với bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng, đồng thời NKBV có thời gian nằm viện trung bình dài hơn, từ 7-14 ngày Do đó, chi phí cho NKBV thường tăng gấp 2-4 lần so với trường hợp không NKBV Chi phí phát sinh NKBV Anh quốc khoảng tỷ USD Mỹ 28-45 tỷ USD[11] Staphylococcsu aureus Pseudomonas aeruginosa hai tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến Ngoài việc thực quy trình phát S aureus P aeruginosa chủ yếu phương pháp vi sinh Phương pháp thực phức tạp qua nhiều công đoạn nuôi cấy kiểm tra sản phẩm thu gặp khó khăn có khả nhầm lẫn loại vi sinh vật với Trong việc xác định nhanh xác loại vi sinh vật góp phần giảm nguyên nhân lây lan cộng đồng Với trình độ khoa học kỹ thuật ngày đại kéo theo người ngày am hiểu giải thích rõ ràng quan điểm kỹ thuật sinh học phân tử Qua việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào lĩnh vực đời sống ngày rộng rãi, đặc biệt sinh học phân tử ứng dụng mạnh mẽ vào lĩnh vực y khoa mang lại chẩn đoán xác nhanh chóng xác định vi sinh vật gây bệnh Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng rộng rãi : kỹ thuật PCR, kỹ thuật multiplex PCR, ELISA kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao thời gian cho kết nhanh chóng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác Xuất phát từ tình hình thực tiễn dựa điều kiện sở vật chất khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa).” 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình phát nhanh đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) kỹ thuật multiplex PCR 1.2.2 Yêu cầu đề tài: - Tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn S aureus P aeruginnosa - Tối ưu phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa - Thử nghiệm thành công phản ứng multiplex PCR mẫu vi khuẩn phân lập Bệnh viện 33 Hình 4.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện phản ứng khác Đường chạy M Thang chuẩn DNA 100 bp (Enzynomic), đường 1-16: phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OPRLF-OPRLR; đường chạy 17-32: phản ứng PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR đường chạy: 17: mẫu kiểm chứng âm tính Ghi đường chạy hình 4.3 Hàm Đường lượng chạy MgSO4 mM Nhiệt độ gắn mồi Hàm Đường lượng chạy MgSO4 mM o ( c) Nhiệt độ gắn mồi Hàm Đường lượng chạy MgSO4 mM o ( c) Nhiệt độ gắn mồi Hàm Đường lượng chạy MgSO4 mM o ( c) Nhiệt độ gắn mồi (oc) 1,6 53 57 17 1,6 53 25 57 1,6 53 10 59 18 1,6 53 26 59 1,6 55 11 61 19 1,6 55 27 61 1,6 57 12 2,4 53 20 1,6 57 28 2,4 53 1,6 59 13 2,4 55 21 1,6 59 29 2,4 55 1,6 61 14 2,4 57 22 1,6 61 30 2,4 57 53 15 2,4 59 23 53 31 2,4 59 55 16 2,4 61 24 55 32 2,4 61 34 Dựa vào kết điện di sản phẩm hình 4.3 cho thấy nhiệt độ gắn mồi hàm lượng MgSO4 khác cho băng sản phẩm có cường độ khác So sánh khả khuếch đại cặp mồi OPRLFOPRLR (hàng trên, hình 4.3.) cho thấy: Các đường chạy từ 7-11 có cường độ sáng nhất, giảm dần đường chạy từ 2-6 từ 12-16, đường chạy số 10 tương ứng với điều kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC cho cường độ rõ nét Điều chứng tỏ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi OPRLF-OPRLR phù hợp điều kiện kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC Tương tự vậy, so sánh hiệu khuếch đại cặp mồi NucF-NucR (hàng dưới, hình 4.3.) cho thấy, thay đổi hàm lượng MgSO4 thành phần phản ứng nhiệt độ gắn mồi phản ứng có khác hiệu khuếch đại phản ứng PCR không rõ ràng Ở đường chạy số 26, tương ứng với điều kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC cho hiệu hình thành sản phẩm PCR cao Trong nghiên cứu sử dụng enzyme Taq DNA polymerase High Fidelity hãng Biobasic, Canada với ion Mg2+ dạng muối MgSO4 Theo hướng dẫn nhà sản xuất, hàm lượng MgSO4 tối ưu 2,0 mM phần lớn phản ứng PCR Trong kết nghiên cứu cho thấy hàm lượng MgSO4 phù hợp 2,0 mM Từ kết nghiên cứu này, lựa chọn nồng độ MgSO4 2,0 mM nhiệt độ gắn mồi 59oC để thử nghiệm phản ứng multiplex PCR sử dụng cặp mồi NucF-NucR OPRLF-OPRLR phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa 35 4.2.3 Kết thử nghiệm khả khuếch đại phản ứng multiplex PCR Trong nghiên cứu này, DNA chủng S aureus chủng P aeruginosa trộn lẫn sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR Phản ứng thực điều kiện hàm lượng MgSO4 2,0mM nhiệt độ gắn mồi 59oC Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR gel agarose 1,5% thể hình 4.4 Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR sử dụng khuôn chủng S aureus P aeruginosa Dường chạy M Thang chuẩn DNA 100bp; đường chạy Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy 2-4: mẫu sử dụng khuôn S aureus P aeruginosa Kết điện di hình 4.4 cho thấy đường chạy số mẫu đối chứng không suất sản phẩm PCR phù hợp với phản ứng kiểm chứng âm tính Cả đường chạy số 2, xuất , hai băng sản phẩm PCR rõ nét với kích thước khác nhau, băng có kích thước khoảng 439bp băng có kích thước 483bp tương ứng với kích thước sản phẩm PCR cặp mồi NucF-NucR cặp mồi OPRLF-OPRLR theo lý thuyết 36 Như vậy, xây dựng điều kiện phù hợp cho phản ứng multplex PCR phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa với độ đặc hiệu cao Thành phần phản ứng điều kiện chu trình nhiệt phản ứng multiplex cụ thể sau: Thành phần phản ứng gồm: - 10X PCR buffer: 2,5 µl - MgSO4 (20mM): 2,5 µl - dNTPs (2,5 mM): 2,0 µl - Mồi NucF (10 μM): 1,0 µl - Mồi NucR (10(μM): 1,0 µl - Mồi OPRLF (10μM): 1,0 μl - Mồi OPRLR (10μM): 1,0 μl - Taq DNA polymerase (5U/μl): 0,2 µl - DNA khuôn: 2,5 µl - H2O khử ion, không chứa Dnase: 11,3 µl Điều kiện chu trình nhiệt phản ứng là: - Giai đoạn biến tính ban đầu: 95oC phút - Giai đoạn khuếch đại 40 chu kỳ gồm bước: + Biến tính: 95oC 45 giây + Gắn mồi: 53oC 45 giây + Kéo dài mồi: 72oC 45 giây - Giai đoạn kéo dài cuối cùng: 72oC phút - Giai đoạn ủ bảo quản: 8oC lấy sản phẩm PCR 4.2.4 Kết xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR Để xác định ngưỡng phát phản ứng multiplex PCR, tiến hành nuôi cấy S aureus P aeruginosa riêng rẽ môi trường lỏng để thu dịch nuôi cấy Tiến hành xác định mật độ tế bào dịch nuôi cấy 37 đồng thời tiến hành tách chiết DNA tổng số chủng vi khuẩn DNA tồng số chủng trộn lẫn với sau pha loãng nồng độ khác cách 10 lần sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm multiplex PCR thể hình 4.5 Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR nồng độ DNA pha loãng khác Đường chạy 1: Mẫu kiểm chứng âm tinh; đường chạy – 10: nồng độ DNA độ pha loãng từ 10-2 đến 10-10 Kết điện di cho thấy nồng độ DNA thấp dần độ sáng băng sản phẩm mờ dần Ở đường chạy số 7, tương ứng với nồng độ DNA pha loãng 10-7, xuất băng DNA tương rõ nét, kích thước theo lý thuyết hoàn toàn nhận biết mắt thường Ở đường chạy số 8, tương ứng với độ pha loãng 10-8, băng DNA mờ, khó nhận biết mắt thường, từ nồng độ pha loãng 10-9 trở (đường chạy số 9) hoàn toàn không xuất băng sản phẩm PCR nhận biết mắt thường Điều lý giải nồng độ DNA khuôn thấp nên lượng sản phẩm PCR tạo ít, không đủ hình thành băng nhận biết 38 Theo tính toán mật độ tế bào dịch nuôi cấy ban đầu phương pháp đếm khuẩn lạc, nồng độ DNA độ pha loãng 10-7 tương đương với có 2,1.102 CFU S aureus 1,3.102 CFU P aeruginosa/ml dịch nuôi cấy Như vậy, phản ứng multiplex PCR xây dựng nghiên cứu cho phép phát S aureus P aeruginosa mật tế bào dung dịch vi khuẩn thấp 210 CFU 130 CFU/ml dịch nuôi cấy 4.2.5 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng multiplex PCR Kết kiểm tra độ đặc hiệu phản ứng multplex PCR thể hình 4.6 Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn khác Đường chạy Mẫu kiểm chứng âm tính; đường chạy Mẫu S aureus P aeruginosa; đường chạy Mẫu P aeruginosa; đường chay Mẫu S aureus; đường chạy 6-12 mẫu E coli, S epidermidis; S capidis, Salmonella typhi, Steptococcus pneumonia, Klebsiella pneumonia Hemophilus spp Từ kết điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng multiplex PCR cho thấy, sử dụng khuôn hỗn hợp chủng S aureus P aeruginosa (đường chạy 5), sản phẩm PCR gồm băng DNA phù hợp với kích 39 thước sản phẩm PCR theo lý thuyết Khi sử dụng riêng rẽ khuôn chủng S aureus P aeruginosa, sản phẩm PCR xuất băng DNA kích thước theo lý thuyết Khi sử dụng khuôn chủng vi khuẩn kiểm định S aureus P aeruginosa (đường chạy từ số đến số 12), băng sản phẩm PCR hình thành Kết nghiên cứu cho thấy phản ứng multiplex PCR xây dựng đặc hiệu cho việc phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa phát riêng rẽ loài 4.3 Kết thử nghiệm phát nhanh đồng thời S aureus P aeruginosa từ mẫu thu thập bệnh viện Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên thể bảng 4.2 Từ kết thử nghiệm thể bảng 4.2 cho thấy, tất mẫu không chứa vi khuẩn S aureus P aeruginosa cho kết âm tính (không có sản phẩm PCR hình thành) Trong tổng số 12 mẫu xác định kiều hình có chứa vi khuẩn S aureus, phản ứng multiplex PCR phát xác mẫu (hình thành sản phẩm PCR tương ứng với chủng S aureus), chiếm 66,66% mẫu âm tính giả (chiếm 33,33%) Trong số mẫu xác định nuôi cấy có chứa P aeruginosa, phản ứng PCR phát xác mẫu (chiếm 75,0%) mẫu cho kết âm tính giả, chiếm 25,0% Các kết âm tính giả giải thích có nguyên nhân mật độ tế bào vi khuẩn không đủ lớn để hình thành sản phẩm PCR mẫu có chứa chất ức chế phản ứng PCR 40 Bảng 4.1 Kết thử nghiệm phản ứng multilplex PCR mẫu thu thập Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng Thái Nguyên STT Mẫu Kết kiểm tra PCR 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 7 8 9 10 10 11 Nuôi cấy Steptococcus STT Mẫu Kết kiểm tra PCR Nuôi cấy 14 14 S aureus S aureus 15 15 - S aureus 16 16 P P aeruginosa aeruginosa 17 17 - S aureus E coli 18 18 S aureus S aureus S aureus S aureus 19 19 S aureus S aureus S aureus S aureus 20 20 - P aeruginosa 21 21 P aeruginosa 22 S aureus S aureus 11 - 12 12 - 13 13 pneumonia Klebsiella pneumonia Hemophilus spp Enterobacter spp P aeruginosa P aeruginosa P aeruginosa P aeruginosa P P aeruginosa aeruginosa 22 S aureus S aureus 23 23 - S aureus P aeruginosa 24 24 - S aureus 25 25 P aeruginosa 26 26 P aeruginosa P P aeruginosa aeruginosa S aureus S aureus Ghi chú: (-): kết kiểm tra âm tính 41 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã tách chiết thành công DNA tổng số chủng vi khuẩn thu thập, DNA tách chiết có độ tinh hàm lượng đủ để tiến hành thí nghiệm Đã xây tối ưu thành công phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Phản ứng PCR cho phép phát xác 100% phát chủng Đã thử nghiệm phản ứng multiplex PCR phát nhanh đồng thời mẫu thu thập Bệnh viên Đa khoa Trung ương Thái Nguyên Phản ứng cho phép phát xác 66,66% số mẫu chứa S aureus 75% số mẫu chứa P aeruginosa 5.2 Kiến nghị - Nên sử dụng kỹ thuật multiplex PCR xây dựng nghiên cứu để phát nhanh S aureus P aeruginosa mẫu chủng - Tiếp tục thử nghiệm tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR phát Tụ cầu vàng Trực trùng mủ xanh mẫu bệnh phẩm để làm tăng tính đặc hiệu phản ứng phát trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt [1] Nguyễn Thị An, Nguyễn Thị Kim Hoàng, Phạm Thị Thùy Dương, Võ Thị Huỳnh Mai, Lê Thị Thu Trúc (2011), Staphylococcus aureus điều cần biết chúng Trường Đh Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.HCM Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học [2] Hoàng Doãn Cảnh cộng (2014), Tình hình kháng kháng sinh Pseudomonas aeruginosa phân lập bệnh phẩm Viện Pasteur , TP Hồ Chí Minh, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, (61) [3] Nguyễn Văn Duy, Phạm Văn Phúc Đỗ Bích Duệ (2014) Ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi phát nhanh đồng thời Staphylococcus aureus Salmonella typhi Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, số tháng năm 2014, trang 152-159 [4] Nguyễn Trần Hải Hoàng, (2010), Tổng quan Staphylococcus aureus đề xuất biện pháp phòng ngừa lây nhiễm thực phẩm, Khóa Luận Tốt Nghiệp, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghiệp TP.HCM, Khoa Môi Trường Và Công Nghệ Sinh Học [5] Lê Bảo Huy, Lê Đức Thắng, Khảo sát tác nhân gây viêm phổi bệnh viện tình hình kháng kháng sinh khoa ICU bệnh viện Thống Nhất 2004-2005, Tập thể khoa hồi sức cấp cứu – Khoa vi sinh bệnh viện Thống Nhất, Tài liệu hội thảo khoa học [6] Võ Thị Chi Mai Nhận xét tính kháng thuốc in vitro bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997 Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược – Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy, 1997 Tài liệu hội thảo khoa học [7] Trần Thị Xuân Mai (2011), “ phát nhanh salmonella spp., Salmonella Enterica diện thực phẩm băng kỹ thuật PCR đa mồi (Mutiplex PCR)” , tạp chí khoa học 20, tr 198-208 [8] Hồ Việt Mỹ (2004) Nghiên cứu tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện; đề xuất, áp dụng đánh giá biện pháp phòng chống bệnh viện đa khoa tỉnh BVĐK khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004 Sở y tế Bình Định II Tài liệu tiếng Anh [9] Agarwal A., Makker A., Goel S K (2002), “Application of the PCR technique for a rapid, specific and sensitive detection of Salmonella spp in foods”, Mol Cell Probes, 16, pp 243-250 [10] Anton Y.P, David C Hooper (2010), “Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria”, N Engl J Med, 362(19), 18041813][ Bush, K., G A Jacoby (2010), “Update functional classification of -lactamases”, Antimicrob Agents Chemother, 54, 969-976 [11] Ayesha Mirza, Haidee T Custodio; Hospital- AcquiredInfections.Availableathttp://emedicine.medscape.com/artic le/967022-overview.Accessed 20/6/2010 [12] Baird R.M, Lee W.H (1995), “Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus”, Int J Food Microbiol, 26(1):15-24 [13] Berke A., Tilton R C (1986), “Evaluation of Rapid Coagulase Methods for the Identification of Staphylococcus aureus”, Journal of clinical microbiology, 23(5), pp 916-919 [14] European Center for Disease Prevention and Control.Annual Epidemiological Report on Communicable DiseasesinEurope.Availableat:http://ecdc.europa.eu/en/files/pdf/Pu blications/081215_AER_long_2008.pdf Accessed July 2009 [15] Freitas C G., Santana A P., Silva P H., Goncalves V S., BarrosMde A., Torres F A., Murata L S., Perecmanis S (2010), “PCR multipex for detection of Salmonella Enteritidis, typhi and typhimurium and occurrence in poultry meat”, Int J Food Microbiol, 139(1-2), pp 15-22 [16] Fueyo M., Martin M.c., Gonzalez- Hevia M.A and Mendoza M.C., (2000), “Enterotoxin production and DNA fingreprinting in Staphylococcus.aureus isolated from human and food samples Relations between genetic types and enterotoxins” International Journal of Food Microbiology, 67: 139-145 [17] Gales, A C., R N Jones,1 J Turnidge,2 R Rennie,3 and R Ramphal Characterization of Pseudomonas aeruginosa Isolates: Occurrence rates, antimicrobial susceptibility patterns, and molecular typing in the global SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997– 1999 Clinical Infectious Diseases, 2001, 32(Suppl 2): S146–55 [18] Guardabassi L, Courvalin P (2006), Modes of Antimicrobial Action and Mechanisms of Bacterial Resistance, 1-18 In Aarestrup F (ed), Antimicrobial Resistance in Bacteria of Animal Origin ASM Press, Washington, DC [19] Hirose K., Itoh K I., Nakajima H., Kurazono T., Yamaguchi M., Moriya K., Ezaki T., Kawamura Y., Tamura K., Watanabe H (2002), “Selective Amplification oftyv (rfb E), prt (rfb S), viaB, and ficC Genes by Mutiplex PCR for Identification of Salmonella enterica Serovars typhi and paratyphi A”, Journal of Clinical Microbiology, 40(2), pp.633-636 [20] Hirulkar N.B , Bhavna Soni, (2011), Incidence of Antibiotic Resistant Pseudomonas aeruginosa Isolated from Drinking Water, nternational Journal of Pharmaceutical & Biological Archives 2011; 2(2):724-733 [21] Lateef A., Oloke J K., Gueguimkana E B The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria Environmental Monitoring and Assessment, 2005, 100: 59–69 [22] Malorny B., Bunge C., Helmuth R (2007), “A real-time PCR for the detection of Salmonella enteritidis in poultry meat and consumption eggs”, J Microbiol Methods, 70, pp 245-251 [23] Michael R Mulvey, PhD and Andrew E Simor, MD (2009), Antimicrobial resistance in hospitals: How concerned should we be?, CMAJ 2009 Feb 17; 180(4): 408–415 [24] Mirakhur A., Gallagher M.J., Ledson M.J., Hart C.A., Walshaw M.J Fosfomycin therapy for multiresistant Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis J Cyst Fibros., 2003 Mar, 2(1):19-24 ][Monden K., Ando E., Iida M., Kumon H Role of fosfomycin in a synergistic combination with ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm J Infect Chemother., 2002 Sep, 8(3):218-26 [25] Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2, Occurrence of Pseudomonas aeruginosa in post-operative wound infection, Pak J Med Sci JulySeptember 2004, Vol 20 No 3: 187-191 [26] Pui C F., Wong W C., Chai L C., Lee H Y., Noorlis A., Zainazor T C T., Tang J Y H., Ghazali F M., Cheah Y K., Nakaguchi Y., Nishibuchi M., Radu S (2011), “Mutiplex PCR for the concurrent dectection and differentiation of Salmonella spp, Salmonella typhi and Salmonella typhimurium”, Trop Med Health, 39(1), pp 9-15 [27] Sandel M.K., McKillip J.L., (2002), “virulence and recovery of staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches”, Food control, 15, pp 5-10 [28] Samira Aghamiri, Nour Amirmozafari, Jalil FallahMehrabadi, Babak Fouladtan, and Hossein Samadi Kafil (2014), “Antibiotic Resistance Pattern and Evaluation of Metallo-Beta Lactamase Genes Including bla-IMP and bla-VIM Types in Pseudomonas aeruginosa Isolated from Patients in Tehran Hospitals” ISRN Microbiolog, yolume 2014, Article ID 941507, pages [29] Taniuchi M., Verweij J J., Houpt E R (2011), “ Mutiplex PCR method to detect Cyclospora, Cystoisospora, and Microsporidia in stool samples”, Diagnostic microbiology and infection disease, 71(4), pp.386-390 [30] WHO World Alliance for Patient Safety Global Patient Safety Challenge Program 2005-2006 Geneva Switzerland [31] Yves Le Loir, Florence Baron and Michel Gautier (2003), Staphylococcus aureus and food poisoning Genetic and Molecular Research 2, pp 63-76 [32] Zhu Q., Lim C K., Chan Y N (1996), “Detection of Salmonella typhi by polymerase chain reaction”, J Appl Bacteriol, 80, pp 244-251 III Tài liệu internet [33] http://medicare.health.vn/cong-dong/tai-lieu/truc-khuan-mu-xanh [34] https://vi.scribd.com/doc/55372088/BAO-CAO-STAPHYLOCOCCUS2(lịch sử phát s) [35].http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:http://repository tnu.edu.vn/bitstream/123456789/2171/1/5155_document_1130638 1135.pdf [36] Wikipedia, https://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus [37] http://luanvan.co/luan-van/tong-quan-ve-staphylococcus-aureus-2021/ [38] https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa [39].https://vi.wikipedia.org/wiki/Pseudomonas_aeruginosa#Danh_ph.C3.A1p [40].http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:http://repository tnu.edu.vn/bitstream/123456789/2171/1/5155_document_1130638 1135.pdf [41].https://vi.scribd.com/doc/89582184/Phan-L%E1%BA%ADpStaphylococcus-Aureus-T%E1%BB%AB-M%E1%BA%ABuMau-B%E1%BB%87nh-Nhan [...]... nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho việc xây dựng bộ kít phát hiện nhanh và đồng thời tụ cầu vàng (S aureus) và trực trùng mủ xanh (P aeruginosa) 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng vào công việc chẩn đoán nhanh sự nhiễm trùng S aureus và P aeruginosa trong lĩnh vực y tế 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa... thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm Các chủng S.aureus và P.aeruginosa nhiễm trùng bệnh viện, mẫu được thu thập tại Bệnh Viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Ứng dụng của multiplex PCR trong phát hiện nhanh và đồng thời tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) trên chủng thuần và mẫu thu thập tại Bệnh Viện Đa Khoa... phẩm PCR có thể quan sát được bằng mắt thường trên hình ảnh điện di [3] 28 3.5.4 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR Độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR được xác định bằng cách kiểm tra Để có thể xác định được độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR trong phát hiện nhanh và đồng thời S.aureus và P.aeruginosa, phản ứng multiplex PCR được kiểm tra với các chủng S aureus và P aeruginosa và. .. phương pháp là yêu cầu có đoạn mồi phù hợp và đặc hiệu với đoạn gen cần tổng hợp để nhận biết 2.4.Tổng quan về kỹ thuật multiplex PCR Multiplex PCR là phản ứng PCR cải tiến cho phép phản ứng xảy ra để phát hiện đồng thời nhiều gen của một sinh vật hay của nhiều sinh vật khác nhau[26] Multiplex PCR không hề khác so với phản ứng PCR bình thường vẫn sử dụng nguyên lý giống nhau như PCR thường, tuy nhiên... này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch 12 2.2 Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc và trên thế giới 2.2.1 Tình hình nghiên cứu về Staphylococcus aureus 2.2.1.1 Trong nước Ở Việt Nam tình hình nhiễm S.aureus là rất đáng lo ngại Tỷ lệ dương tính với tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và tụ cầu vàng kháng Methicillin... sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang qua đó định lượng nồng độ vi sinh vật trong mẫu vật Năm 2007 Malorny B và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật realtime PCR để phát hiện vi khuẩn Salmonella 19 enteritidis trong thịt gia cầm và trứng Trong đó Gen Prot6e nằm trên S enteritidis đã được sử dụng để thiết kế mồi và mẫu dò Độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình đạt tuyệt... Quốc 8 Nồi khử trùng ALP, Nhật Bản 9 Tủ an toàn sinh học Việt Nam 10 Tủ lạnh -20oC SANYO, Nhật Bản 11 Tủ sấy Memment, Đức 12 Micropipet các loại Gillson, Pháp 13 Bể ổn nhiệt JSR, Hàn Quốc 3.4 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tách chiết DNA tổng số của các chủng vi khuẩn S aureus và P.aeruginnosa Nội dung 2: Nghiên cứu tối ưu phản ứng multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời S.aureus và P.aeruginosa... 10-7 3.5.3 Phương pháp xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR Dịch vi khuẩn đã được xác định nồng độ tế bào được sử dụng để tách chiết DNA tổng số Dung dịch DNA tổng số được pha loãng thành các nồng độ khác nhau và cách nhau 10 lần Dịch DNA ở các nồng độ pha loãng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR Ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR được xác định là số CFU/ml tương... (K2TeO3) và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của enzyme lethinase) [27] Trên môi trường MSA (Manitol salt 7 agar), khuẩn lạc của S.aureus tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) [27] 2.1.1.4.Đặc tính và các yếu tố độc lực Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện. .. hiệu và độ nhạy cao, thí nghiệm đã được thực hiện trên 30 mẫu bệnh thu nhận ở Bệnh viện Hùng Vương, Bệnh viện Da Liễu có 7 mẫu dương trong đó có 4 mẫu dương với HPV(13%) và 2 mẫu dương với Niseria gonorrhoene (6%) và 1 mẫu đồng nhiễm HPV và Niseria gonorrhoene (3%) 22 PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng S aureus và
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh và đồng thời Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) và Trực trùng mủ xanh (Psedomonas aeruginosa)

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Từ khóa liên quan

Nạp tiền Tải lên
Đăng ký
Đăng nhập