ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ THANH NGA Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Thái Nguyên – năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ THANH NGA Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Lớp : 45 - CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hƣớng dẫn: ThS Dƣơng Mạnh Cƣờng Thái Nguyên – năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp, em tiến hành thực đề tài “Phân lập tối ưu số điều kiện sinh trưởng vi khuẩn Nitrate hóa mẫu nước thải trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên” Sau thời gian tham gia nghiên cứu thực đề tài, đến em hoàn thành đề tài nghiên cứu Nhân dịp em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: ThS Dương Mạnh Cường, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Vi Đại Lâm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên dạy dỗ, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời gian học tập Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ủng hộ, động viên để em có tự tin học tập thực tập tốt nghiệp Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận tránh khỏi thiếu sót hạn chế Kính mong nhận bảo, đóng góp ý kiến quý Thầy Cô toàn thể bạn Em xin chân thành cảm ơn Sinh viên Hoàng Thị Thanh Nga ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn nghiên cứu 31 Bảng 4.2 Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn nghiên cứu .32 Bảng 4.3 Ảnh hưởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 33 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn B3 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến dòng A1 36 Bảng 4.6.Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy dòng vi khuẩn B3 37 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 38 Bảng 4.8 Ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp nguồn cacbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 .39 Bảng 4.9 Ảnh hưởng nguồn cacbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 40 Bảng 4.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp với hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 42 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Chu trình Nitơ tự nhiên Hình 4.1 Các dòng vi khuẩn nitrate có hoạt tính môi trường Winogradsky I 28 Hình 4.2 Các dòng vi khuẩn nitrate có hoạt tính môi trường WinogradskyII 29 Hình 4.3 Dòng vi khuẩn nitrite hóa môi trường có chứa thuốc thử Griss 30 Hình 4.4 Dòng vi khuẩn nitrat hóa môi trường có chứa thuốc thử Griss 30 Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc dòng vi khuẩn A1, B2 .31 Hình 4.6 Hình thái tế bào dòng A1, B3 32 Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 .34 Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến phát triển dòng B3 .35 Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn A1 36 Hình 4.10 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn B3 37 Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 39 Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp với nguồn cacbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 .40 Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi khuẩn B3 41 Hình 4.14 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp với nguồn cacbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn B3 .42 iv DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT AMO : Amon Monoxygenase AOB : Ammonium DO : Dissolved Oxygen ATP : Adenosine Tri-Phosphate h : Giờ ĐC : Đối chứng TAN :Total amonia nitrogen AOB : Ammonia Oxidizing Bacteria v MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài .3 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài .3 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.1.1 Chu trình Nitơ 2.1.2 Tác hại việc dư thừa Nitơ đời sống môi trường 2.1.3 Trạng thái tồn trình chuyển hóa nitơ nước thải 2.1.4 Quá trình chuyển hóa nitơ vô vai trò nhóm vi khuẩn nitrate hóa 10 2.1.4.1 Quá trình Nitrate hóa 10 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nitrate hóa 12 2.1.5 Đặc điểm sinh học vai trò vi khuẩn tham gia trình nitrate hóa .14 2.1.5.1 Các dòng vi khuẩn tham gia vào trình nitrate hóa 14 2.1.5.2 Đặc điểm sinh học vai trò vi khuẩn Nitrosomonas 16 2.1.5.3 Đặc điểm sinh học vai trò vi khuẩn Nitrobacter 17 2.1.6 Hiện trạng nước thải trường Nông Lâm Thái Nguyên .19 2.2 Tình hình nghiên cứu nước giới .20 2.2.1 Tình hình nghiên cứu nước .20 2.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 20 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu .22 vi 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Dụng cụ, môi trường 22 3.3.1 Dụng cụ thiết bị .22 3.3.2 Môi trường 23 3.3.2.1 Môi trường Winogradsky I 23 3.3.2.2 Môi trường Winogradsky II 23 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 24 3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 24 3.5.2 Phương pháp phân lập tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 24 3.5.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 24 3.5.2.2 Phương pháp làm tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt lực cao .25 3.5.3 Phương pháp nhuộm gram 25 3.5.4 Phương pháp giữ giống 26 3.5.5 Phương pháp phân tích 26 3.5.6 Xác định số tính chất sinh lý, sinh hóa đến dòng vi khuẩn nitrat hóa 27 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 4.2 Thử nghiệm khả nitrate hóa 29 4.2.1 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa amon thành nitrite 29 4.2.2 Tuyển chọn dòng có hoạt tính nitrite thành nitrate 30 4.3 Định danh vi khuẩn dựa đặc điểm hình thái .31 4.4 Tối ưu số điều kiện pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng đến khả sinh trưởng vi khuẩn nitrate hóa .33 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi khuẩn 33 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn nitrate hóa 36 4.4.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến phát triển vi khuẩn nitrate hóa .38 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước thải - nước sau sử dụng bị nhiễm bẩn từ sinh hoạt, hoạt động công nghiệp, nông nghiệp thải khỏi khu vực sử dụng nguồn nhận ao, hồ, sông, biển Trong dịch chuyển, lượng nước thải định thấm vào đất tạo nước ngầm đem theo chất gây ô nhiễm Tác nhân gây ô nhiễm môi trường nước chất có khả chuyển hoá thành chất khác chất bền tác động đến cân sinh thái môi trường nước nhận Về nguyên tắc, chất bền môi trường coi độc hại không gây hại trực tiếp lên động vât, thực vật sống nước lên người cách gián tiếp tới người thông qua chuỗi thức ăn Có nhiều họ chất hữu bền môi trường có tác dụng xấu gây loại bệnh nan y, đột biến gen với nồng độ thấp Đó số họ chất bảo vệ thực vật, hormon, kháng sinh, dược phẩm, số hợp chất đặc thù khác thâm nhập vào thể người động vật trực tiếp qua thức ăn Rất nhiều hợp chất gây ô nhiễm nước thải có khả chuyển hoá cao môi trường nước tự nhiên thông qua phản ứng hoá học, sinh hoá, quang hoá tác động đến cân sinh thái môi trường Các chất gây đục vô có khả chuyển hoá không lớn, tồn nguồn nước nhận gây đục, gây tượng cản ánh sáng vào nước, hạn chế phát triển thuỷ thực vật sống Hậu kéo theo làm giảm nguồn thức ăn thuỷ động vật, làm giảm nồng độ oxy hoà tan nước trình quang hợp thực vật bị hạn chế, gây khó khăn cho hoạt động động vật thuỷ sinh (Lê Văn Cát, 2007) Nitơ nguyên tố sống, có mặt tất hoạt động liên quan đến sống nhiều ngành nghề sản xuất công nghiệp, nông nghiệp Hợp chất hoá học chứa nitơ thành phần dinh dưỡng phạm trù nước thải đối tượng gây ô nhiễm trầm trọng cho môi trường Nếu hàm lượng nitơ có nước thải xả sông, hồ mức gây tượng ô nhiễm, điển hình tượng phú dưỡng Trong môi trường phú dưỡng, điều kiện sống (pH, oxy tan) biến động liên tục mạnh tác nhân gây khó khăn, chí môi trường sống thuỷ động vật Thời gian hay chu kỳ sống tảo có giới hạn, sau phát triển mạnh (bùng nổ tảo hay gọi nước nở hoa) tảo chết lắng xuống lớp đáy tiếp tục bị phân huỷ điều kiện yếm khí Giống loài tảo phong phú, có loài tảo độc (tiết độc tố), điều kiện phú dưỡng tỷ lệ thành phần tảo thường thay đổi theo chiều hướng bất lợi, hình thành nhiều loại tảo độc (C E Boyd, 1998), phát triển mạnh, tảo che chắn ánh sáng không cho thực vật sống lớp phát triển, gây độc làm nguồn thức ăn cho thuỷ động vật Khi chết tảo lắng xuống đáy, bị vi sinh vật nấm phân huỷ làm cạn kiệt nguồn oxy hoà tan cung cấp cho loài động vật khác Trong phân huỷ tảo, chất dinh dưỡng hữu lại chiết môi trường nước từ trầm tích, yếu tố lại thúc đẩy vi sinh vật phát triển Vi sinh vật phát triển bám vào thân, thực vật làm giảm khả quang hợp thực vật Để giải vấn đề trên, việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước bị ô nhiễm ngày phổ biến Khác với phương pháp vật lý, hóa học… việc sử dụng vi sinh vật giúp tăng cường khả phục hồi, khả tự làm môi trường, có tính ổn định cao thân thiện với môi trường Trong tự nhiên, vi sinh vật loại bỏ hàm lượng Nitơ dư thừa nước cách chuyển hóa nitơ dạng hữu vô thành dạng khí N2 thoát môi trường Quá trình diễn chủ yếu nhờ trình amon hóa, nitrate hóa phản nitrate hóa Dạng tồn phổ biến Nitơ nước NH3 muối NH4+ Trong nitrate hóa trình hiếu khí ( điều kiện có O2), NH4+ Oxi hóa thành nitrite NO2-, sau nitrite NO2- chuyển hóa thành NO3- Các biến đổi thực vi sinh vật, ví dụ vi khuẩn: Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus Do vậy, việc tìm dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrate vi khuẩn phân giải nitrate có ý nghĩa quan trọng việc thiết lập quy trình phục hồi sinh học nhằm làm giảm nồng độ nitơ nước thải Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thuộc Tổ 10, xã Quyết Thắng–Thành Phố Thái Nguyên, nằm phía Tây cách trung tâm thành phố khoảng 5km, có diện 32 Bảng 4.2 Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn nghiên cứu STT Kí hiệu dòng A1 B3 Đặc điểm tế bào Hình que ngắn tròn, có hình bầu dục, rời rạc Gram (-) Hình que ngắn, rời rạc Gram (-) Qua nghiên cứu hình thái tế bào cho thấy hai dòng A1 B3 vi khuẩn Gram âm, rời rạc hình dạng khác Dòng A1 tế bào có hình que ngắn tròn rời rạc, dòng B3 tế bào có dạng hình que ngắn A1 B3 Hình 4.6 Hình thái tế bào dòng A1, B3 Theo Stanley Mandel (1971), vi khuẩn tham gia trình nitrite hóa (AOB) bao gồm có nhóm: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosogloea, Nitrosospira Nitrosococcus Hình dạng tế bào nhóm vi khuẩn hoàn toàn khác Theo nghiên cứu Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) dòng vi khuẩn thuộc giống Nitrosomonas nhóm vi khuẩn sau nhuộm Gram quan sát Gram âm, có hình que ngắn Mặt khác kết thử thuốc thử Griss cho thấy dòng A1 có phản ứng với thuốc thử cho màu hồng đậm từ kết luận A1 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) tế bào vi khuẩn Nitrobacter hình que ngắn Kết hình 4.5b cho thấy tế bào vi khuẩn hình que nhỏ, rời 33 rạc, thuộc vi khuẩn Gram âm kiểm tra có mặt NO3- môi trường cho thấy xuất nồng độ có môi trường cho màu vàng nhạt điều chứng tỏ dòng vi khuẩn có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter 4.4 Tối ƣu số điều kiện pH, nhiệt độ, nguồn dinh dƣỡng đến khả sinh trƣởng vi khuẩn nitrate hóa Từ kết tuyển chọn định danh sơ chúng tối tiếp tục tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng dòng vi khuẩn tuyển chọn 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi khuẩn pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển vi khuẩn nitrate hóa Khi pH môi trường cao dẫn đến việc tạo lượng NH3 môi trường làm ức chế phát triển vi khuẩn oxy hóa amon nitrite Trong trường hợp pH môi trường thấp dẫn đến việc tích tụ lượng lớn axit nitric chất ức chế phát triển vi khuẩn nitrate hóa Do việc xác định giá trị pH phù hợp cho trình nitrate hóa cần nghiên cứu Để tối ưu pH môi trường chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH đến sinh trưởng hai dòng vi khuẩn A1 B3 Chúng khảo sát pH môi trường nuôi cấy giá trị pH=6,5; 7; 7,5; 8; 8,5, đo mật độ sinh khối tế bào máy đo OD ghi kết bảng 4.3 thể biểu đồ hình 4.6 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Thời gian (h) Mật độ (OD620nm) 24 48 72 96 120 144 pH=6,5 0,006 0,043 0,117 0,155 0,233 0,18 0,158 pH=7 0,008 0,044 0,161 0,178 0,294 0,2 0,185 pH=7,5 0,01 0,054 0,243 0,261 0,355 0,25 0,233 pH=8 0,009 0,044 0,181 0,2 0,319 0,195 0,147 pH=8,5 0,005 0,036 0,110 0,145 0,193 0,095 0,049 Từ bảng 4.3 trên, ta thấy ảnh hưởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 qua biểu đồ sau: 34 Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Kết hình 4.7 kết hợp với bảng 4.3 cho thấy dòng vi khuẩn A1 phát triển tốt mức pH = 7,5 Ở pH=7,5 phát triển A1 đạt mức giá trị cao OD620nm 0,355 sau 96h nuôi cấy Khi pH=8,5 sinh trưởng A1 thấp nhất, giá trị OD620nm cao 0,193 sau 96h nuôi cấy Bảng 4.4 Ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn B3 Thời gian (h) Mật độ (OD620nm) 24 48 72 96 120 pH=6,5 0,005 0,013 0,15 0,23 0,181 0,11 pH=7 0,003 0,05 0,173 0,271 0,232 0,2 pH=7,5 0,11 0,076 0,277 0,352 0,332 0,26 pH=8 0,008 0,089 0,185 0,283 0,267 0,095 pH=8,5 0,004 0,032 0,12 0,25 0,132 0,087 Từ bảng 4.4 trên, ta thấy ảnh hưởng pH đến phát triển chủng B3 qua biểu đồ sau: 35 0,4 B3 OD = 620nm 0,35 0,3 pH=6.5 0,25 0,2 pH=7 0,15 pH=7.5 0,1 pH=8 0,05 pH=8.5 0 24 48 72 96 120 Thời gian (h) Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng B3 Kết hình 4.8 kết hợp với bảng 4.4 cho thấy mức pH=7,5 sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 phát triển mạnh nhất, giá trị OD620nm cao 0,352 sau 72h nuôi cấy Ở mức pH=6,5 vi khuẩn sinh trưởng thấp nhất, giá trị OD cực đại đạt 0,23 sau 72h nuôi cấy  Trong thông báo trước ( Hoàng Phương Hà cs, 2010) nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện ngoại cảnh đến sinh trưởng hoạt tính nitrate hóa số dòng vi khuẩn nitrate hóa đề cập Kết cho thấy, dòng vi khuẩn nitrate hóa nghiên cứu thích nghi pH= 7,5-8 Hai dòng vi khuẩn A1 B3 có kết tương tự Cả dòng A1 B3 phát triển tốt pH=7,5-8, nhiên mức độ ảnh hưởng pH khác Hình 4.8 pH có ảnh hưởng lớn chủng B3 Ở pH=7,5 phát triển B3 đạt giá trị cao OD620nm 0,352 sau 72h nuôi cấy Khi pH tăng lên 8,5 hay giảm xuống 6,5 giá trị OD 0,25; 0,271; 0,23 Chủng A1 bị ảnh hưởng pH Hình 4.8 rằng, giá trị pH=7,5-8 phát triển dòng vi khuẩn cao nhất, giá trị OD620nm 0,355 0,319 sau 96h nuôi cấy Đối với chủng, pH=8,5 6,5 không thích hợp cho phát triển, ức chế sinh trưởng chúng Kết phù hợp điều kiện Nitrosomonas Nitrobacter Vi khuẩn nitrosomonas Nitrobacter điển hình cho trình nitrate hóa, việc sử dụng vi sinh vật để xử lý nước thải tốc độ phát triển 36 vi sinh vật đóng vai trò quan trọng vi sinh vật phát triển chúng chuyển hóa chất dư thừa nước thành sinh khối góp phần đáng kể việc làm giảm ô nhiễm 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn nitrate hóa Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy đến dòng A1 Thời gian (h) 24 48 72 96 120 144 T=20oC 0,009 0,122 0,156 0,173 0,2 0,144 0,11 Mật độ T=30oC 0,008 0,248 0,281 0,35 0,375 0,278 0,236 (OD620nm) T=40oC 0,007 0,115 0,207 0,19 0,251 0,19 0,10 T=50oC 0,009 0,1 0,12 0,143 0,105 0,09 0,05 Từ bảng 4.5, ta thấy ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn A1 qua biểu đồ sau: Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Từ bảng 4.5 kết hợp với hình 4.9 cho thấy nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1, vi khuẩn sinh trưởng mạnh nhiệt độ 30°C với giá trị OD620nm cực đại đạt 0,375 sau 96h nuôi cấy Khi nhiệt độ tăng lên 50°C hay giảm xuống 20 mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt với giá trị OD620nm cực đại 0,105; 0,2 sau 96h nuôi cấy 37 Bảng 4.6.Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy dòng vi khuẩn B3 24 48 72 96 120 144 T=20oC 0,012 0,187 0,249 0,28 0,272 0,245 0,211 Mật độ T=30oC 0,015 0,289 0,30 0,381 0,358 0,33 0,27 (OD620nm) T=40oC 0,009 0,25 0,274 0,34 0,323 0,3 0,246 T=50oC 0,007 0,172 0,21 0,261 0,25 0,223 0,12 Thời gian (h) Từ bảng 4.6, ta thấy ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn B3 qua biểu đồ sau: Hình 4.10 Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn B3 Kết bảng 4.6 kết hợp với hình 4.10 cho thấy, dòng vi khuẩn B3 sinh trưởng mạnh nhiệt độ 30°C giá trị cực đại đạt 0,385 sau 72h nuôi cấy Mật độ vi khuẩn bắt đầu giảm nhiệt độ 20°C 50°C So sánh hai hình 4.9 4.10, cho thấy mức độ phát triển dòng vi khuẩn B3 mạnh A1 Dòng A1 mật độ vi khuẩn tăng giảm rõ rệt Khi nhiệt độ tăng lên 50°C hay giảm xuống 20°C vi khuẩn phát triển chậm Thời gian vi khuẩn sinh trưởng A1 B3 phát triển tốt nhiệt độ 30°C thời gian vi khuẩn sinh trưởng đạt mức tối đa lại khác Dòng A1 sinh trưởng mạnh 38 96h nuôi cấy giá trị OD620nm cực đại 0,375 B3 lại đạt mức tối đa sau 96h nuôi cấy với giá trị OD620nm cực đại 0,381 4.4.3 Ảnh hưởng nguồn carbon đến phát triển vi khuẩn nitrate hóa Vi khuẩn nitrate hóa nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, tự dưỡng hóa năng, sinh trưởng chậm nhạy cảm với số chất gây độc thay đổi pH, nhiệt độ Chúng sử dụng CO2 làm nguồn carbon lấy lượng từ trình oxy hóa hợp chất nitrogen cho sinh trưởng Một số loài thuộc chi Nitrosomonas Nitrobacter sử dụng carbon hữu glucose, lactose, sucrose, acetate, pyruvate… trao đổi linh hoạt mà chúng tồn mà chúng tồn môi trường sống khác Vi khuẩn nitrate hóa coi nhóm vi khuẩn quan trọng tham gia vào việc bảo vệ môi trường nhờ có oxy hóa hợp chất nitrogen Dưới tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng phát triển dòng vi khuẩn nitrate hóa Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn carbon hữu đến sinh trƣởng dòng vi khuẩn A1 Thời gian (h) CaCO3 (ĐC) 24 48 72 96 120 144 0,028 0,147 0,291 0,493 0,543 0,372 0,32 Mật độ Glucose 0,044 0,224 0,355 0,543 0,595 0,48 0,414 (OD620nm) Sucrose 0,019 0,126 0,285 0,317 0,44 0,345 0,298 Lactose 0,005 0,109 0,198 0,338 0,46 0,304 0,25 Acetate 0,043 0,143 0,176 0,283 0,27 0,18 0,201 Từ giá trị đo bảng 4.7, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 qua biểu đồ sau: 39 Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Kết bảng 4.7 kết hợp với hình 4.11 cho thấy sử dụng nguồn carbon hữu thay cho nguồn carbon CaCO3 dòng vi khuẩn A1 phát triển bình thường Khi sử dụng Glucose dòng vi khuẩn A1 sinh trưởng mạnh nhất, giá trị OD620nm cực đại đạt 0,595 sau 96h nuôi cấy cao sử dụng nguồn carbon CaCO3 với giá trị OD cực đại 0,54 Từ kết luận chất thay cho mà không thay đổi hoạt tính dòng vi khuẩn nitrate hóa Chúng tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 cách kết hợp nguồn carbon hữu với nguồn carbon vô (CaCO3) Kết thể bảng 4.8 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp nguồn carbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Thời gian (h) Mật độ (OD620nm) CaCO3 (ĐC) Glucose + CaCO3 Sucrose + CaCO3 Lactose + CaCO3 Acetate + CaCO3 24 48 72 0,028 0,147 0,291 0,493 0,543 0,372 0,32 0,374 0,133 0,223 0,166 0,463 0,301 0,233 0,2 0,588 0,373 0,463 0,311 0,683 0,467 0,371 0,48 0,41 0,355 0,261 0,247 0,067 0,05 0,032 0,038 96 120 0,511 0,4 0,35 0,354 144 40 Từ giá trị đo bảng 4.8, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn cacbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 A1 Mật độ OD=620nm 0,8 0,7 0,6 0,5 CaCO3 0,4 Glucose+CaCo3 0,3 Sucrose+CaCO3 0,2 Lactose+CaCO3 0,1 Acetate+CaCO3 0 24 48 72 96 120 144 Thời gian (h) Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp với nguồn carbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Dựa vào hình 4.12 ta thấy sinh trưởng A1 tiếp tục tăng môi trường sử dụng nguồn carbon hữu Glucose kết hợp với nguồn carbon vô Giá trị OD620nm đạt cực đại 0,683 sau 96h nuôi cấy, cao bổ sung Glucose không kết hợp CaCO3 với giá trị OD cực đại 0,543 (Bảng 4.8) Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nguồn carbon hữu đến sinh trƣởng dòng vi khuẩn B3 Thời gian (h) Na2CO3 (ĐC) 24 48 72 96 120 0,014 0,21 0,274 0,33 0,281 0,24 Mật độ Glucose (OD620nm) Sucrose 0,009 0,182 0,2 0,272 0,246 0,203 0,015 0,078 0,092 0,13 0,111 0,074 Lactose 0,005 0,083 0,09 0,181 0,124 0,06 Acetate 0,01 0,195 0,261 0,284 0,273 0,251 Từ bảng 4.9, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn carbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 41 Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi khuẩn B3 Kết hình 4.13 kết hợp với bảng 4.9 có thay đổi sử dụng nguồn carbon hữu khác Vi khuẩn sinh trưởng tốt môi trường chứa nguồn carbon Na2CO3 đạt giá trị OD620nm cực đại 0,33 72h sau acetate với giá trị OD620nm cực đại 0,284 Từ nhận thấy dùng acetate thay cho Na2CO3 điều kiện phòng thí ngiệm hạn chế B3 sử dụng nguồn carbon từ Lactose Sucrose với giá trị OD620nm cực đại tương ứng 0,18; 0,13 Chúng tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 cách kết hợp nguồn carbon hữu với nguồn carbon vô (Na2CO3) Kết thể bảng 4.10 42 Bảng 4.10 Ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp với hữu đến sinh trƣởng dòng vi khuẩn B3 24 48 72 96 120 0,014 0,21 0,274 0,33 0,281 0,24 Na2CO3+Glucose 0,022 0,21 0,251 0,411 0,389 0,338 (OD620nm) Na2CO3+Sucrose 0,003 0,167 0,25 0,355 0,313 0,293 Na2CO3+Lactose 0,008 0,19 0,12 0,21 0,172 0,158 Na2CO3+Acetate 0,011 0,3 0,345 0,592 0,543 0,410 Thời gian (h) Na2CO3 (ĐC) Mật độ Từ bảng 4.10, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn carbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 Hình 4.14 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp với nguồn carbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn B3 Khi kết hợp nguồn carbon hữu với vô cơ, mật độ vi khuẩn tăng lên, tăng cao sử dụng nguồn carbon hữu Sự sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 mạnh kết hợp Acetate với Na2CO3 với giá trị OD620nm cực đại 0,592 sau 72h nuôi cấy cho thấy kết hợp tối ưu 43 Sau thử nghiệm ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng vi khuẩn nitrate có kết luận sau: Trong môi trường khoáng sở có bổ sung nguồn carbon hữu cơ, dòng vi khuẩn A1 phát triển bình thường số nguồn carbon hữu lại không kích thích sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 (Lactose Sucrose) Dòng vi khuẩn A1 sinh trưởng tốt môi trường có nguồn carbon vô CaCO3 kết hợp với Glucose, dòng vi khuẩn B3 sinh trưởng tốt môi trường có nguồn carbon vô Na2CO3 kết hợp với Acetate Kết cho thấy việc bổ sung số nguồn carbon hữu kích thích sinh trưởng dòng vi khuẩn nghiên cứu Tóm lại, Các dòng vi khuẩn A1, B3 có nhiệt độ tối ưu 30oC, pH cho phát triển từ 7,5 đến giống với nghiên cứu Hoàng Phương Hà (2010) Sinh trưởng vi khuẩn đạt tới pha cần dòng vi khuẩn A1 sau khoảng 96 giờ, dòng vi khuẩn B3 sau khoảng 72 khác với nghiên cứu TRần Liên Hà (2007) Theo nghiên cứu Trần Liên Hả (2007) thời gian vi khuẩn nitrosomonas sinh trưởng đạt cực đại 72 vi khuẩn nitrobacter đạt cực đại sau 96 nuôi cấy Trên số điều kiện tối ưu để thu hồi sinh khối hai dòng vi khuẩn nhằm hướng tới ứng dụng nghiên cứu để xử lí nước thải Tuy nhiên nghiên cứu này, ảnh hưởng yếu tố tới sinh trưởng dòng vi khuẩn khảo sát độc lập, để áp dụng quy mô lớn cần phải khảo sát tương tác yếu tố tới sinh khối thu đưa hàm toán học mối quan hệ yếu tố sinh khối 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu nước thải số địa điểm xung quanh trường Nông Lâm Thái Nguyên, tiến hành phân lập dòng vi khuẩn tự dưỡng nitrate hóa có dòng oxy hóa amon dòng oxy hóa nitrite Đã tuyển chọn dòng vi khuẩn: A1 có hoạt tính oxy hóa amon cao B3 có hoạt tính oxy hóa nitrite cao Qua nghiên cứu hình thái tế bào cho thấy, dòng vi khuẩn A1 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas, dòng vi khuẩn B3 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter Xác định điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn nitrat hóa: hai dòng nitrate hóa A1 B3 sinh trưởng thích hợp nhiệt độ 30oC, pH từ 7,5 đến Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng dòng vi khuẩn nitrate: dòng vi khuẩn A1 sinh trưởng tốt môi trường bổ sung Glucose kết hợp với CaCO3, dòng vi khuẩn B3 sinh trưởng tốt môi trường có bổ sung thêm Acetate kết hợp với Na2CO3 5.2 Kiến nghị Mặc dù đạt kết định việc phân lập tuyển chọn dòng nitrate hóa, nhiên để đưa dòng thí nghiệm vào ứng dụng thực tế cần thêm số nghiên cứu sâu - Tiến hành nghiên cứu, định danh vi khuẩn nitrate phương pháp sinh học phân tử - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố khác đến sinh trưởng hoạt tính chủng như: nồng độ oxy hòa tan, ammonium hay nitrite đến chủng dòng vi khuẩn… Tối ưu điều kiện để tăng số lượng vi khuẩn, bước đầu thử nghiệm khả phân giải nitơ nước thải vi khuẩn nitrate hóa 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt [1] Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị, Nguyễn Thị Kim Cúc (2010), “Một số tính chất sinh học bốn dòng vi khuẩn nitrat hóa phân lập Hà Nội”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2): 241-251 [2] Lê Văn Khoa (1995), Giáo trình Môi trường ô nhiễm, Nxb Giáo dục [3] Lê Văn Khoa (2007), Chỉ thị sinh học môi trường, Nxb Giáo dục [4] Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất Nitơ Phospho, Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội [5] Lê Xuân Phương (2008), Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật, Đại học Đà Nẵng [6] Nguyễn Thị Thanh, Trần Liên Hà (2006), “Phân lập dòng vi khuẩn phản nitrat hóa với mục tiêu ứng dụng xử lý nước hồ nhiễm”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Khoa học lần thứ 20, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội [7] Nguyễn Thị Kim Thái, Lê Thị Hiền Thảo (2003), Sinh thái học Bảo vệ môi trường, Nxb Xây dựng [8] Phạm Thị Tuyết Ngân (2012), Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm bùn ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) Nxb Đh Cần Thơ [9] Trần Hiếu Nhuệ, Trần Đức Hạ, Lê Hiền Thảo (1996), Quá trình vi sinh vật cấp thoát nước Nxb Khoa học kỹ thuật [10] Trần Đức Hạ (2006), chuyên đề: Xử lý Nito nước thải, Đại Học Xây Dựng Hà Nội [11] Trần Văn Nhân, Ngô Thị Nga (1999), Giáo trình công nghệ xử lý nước thải, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Tr 201-202 [12] Trung tâm kỹ thuật môi trường đô thị khu công nghiệp (CEEITA) (2001), Báo cáo hội thảo xử lý hợp chất hữu nước ngầm, trường ĐH Xây dựng Hà Nội 46 II Tài liệu Tiếng Anh [13] A.A.Van de Graaf, A.Mulder, Peter de Bruijn, M.S.M.Jette, L.A.Robertson, J.Gijs Kuenen (1995), Anaerobic Oxidation of Ammonium Is a Biologically Mediated Process, Applied and Environmental Microbiology 61 (4) 1246-1251 [14] Alfred Brown, Heidi Smith (2014), Benson's Microbiological Applications, Laboratory Manual in General Microbiology [15] Boon N., DeWindt, W., Vertraete, W., Top, E.M (2002), Evaluation of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group–specific 16S rRNA primer for the analysis of bacterial communities from different wastewater treatment plants FEMS Microbiology Ecology Vol 39, 101-12 [16] C E Boyd (1998), Pond aquaculture water quality management Cluver Academic Publ Boston, USA [17] Cole J.A (1994), Biodegradation of inorganic introgen compounds in Biochemistry of microbial degradation, Ratledge C.Kluwer Academic publishers, PP.487-512 [18] D.Barnes, P.J.Bliss (1983), Biological Control of Nitrogen in Wastewater Treatment London: E&FN Spon Ldt [19] Thomas B (1994), Biology of microrganic, Englewood, cliffts, New Jersey, PP.738 - 740 [20] Smith A.C., Hussey M.A (2005), “Gram stain protocols”, American society for Microbiology Conference for Undergraduate Educa [21] Stanley,W and M Mandel (1971), Comparison of the morphology and deoxyribonucleic acid composition of 27 strains of nitrifying bacteria J Bacteriol, 107: 563-569 [...]... trưởng, đặc điểm hình thái và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn nirate hóa trong một số mẫu nước thải tại trường Đại Học Nông lâm Thái Nguyên 3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu - Phòng Công nghệ lên men của Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Phòng thí nghiệm Vi Sinh tại Vi n Khoa học sự sống 3.2.2 Thời... tiêu của đề tài Phân lập các dòng vi khuẩn nitrate hóa trong một số mẫu nước, làm cơ sở để tiến hành định danh các chủng và xây dựng các quy trình phục hồi sinh học nhằm giảm thiểu lượng Nitơ trong các mẫu nước thải 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Thu thập một số mẫu nước tại các địa điểm trong trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Phân lập được dòng vi khuẩn nitrate hóa trong các mẫu nước thải - Tối ưu một. .. và làm vi c tại trường Xuất phát từ thực tế đó em tiến hành nghiên cứu đề tài Phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn Nitrate hóa từ một số mẫu nước thải tại trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên Nhằm tiến tới xây dựng quy trình phục hồi sinh học trong xử lý Nitơ, góp phần cải tạo môi trường, giảm thiểu ô nhiễm và bảo vệ cảnh quan nhà trường 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 1.2.1... dân, sinh vi n, nghiên cứu sinh sinh sống học tập và làm vi c trong trường Do đó các hoạt động sinh hoạt và làm vi c trong trường Nông Lâm thường xuyên gây phát sinh một lượng nước thải lớn, lượng nước thải này thải ra môi trường bên ngoài phần lớn chưa qua xử lý gây ô nhiễm nguồn nước các ao, hồ, suối xung quanh trường và ảnh hưởng tới cuộc sống của chính những người đang sinh sống, học tập và làm vi c... thu đƣợc từ Khu kí túc xá sinh vi n Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên 20 2.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc và thế giới 2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Tại Vi t Nam, các nghiên cứu về đặc điểm sinh lý của vi khuẩn nitrate còn rất ít và chưa có hệ thống Vì vậy, (Hoàng Phương Hà và cs, 2010) đã nghiên cứu một số tính chất sinh học của 4 dòng vi khuẩn nitrate hóa PĐ58, PĐ60 (chi Nitrosomonas) và 2NM,... 2,5 ngày đối với Nitrosomonas và 0,3 - 1,5 ngày đối với Nitrobacter 19 2.1.6 Hiện trạng nước thải tại trường Nông Lâm Thái Nguyên Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên thuộc xã Quyết Thắng – TP Thái Nguyên, là khu vực rộng lớn với tổng diện tích 102,85 ha (TUAF, 2015) Trong khu vực trường có rất nhiều sinh vi n, nông dân, sinh sống, nghiên cứu học tập và làm vi c trong trường, bên cạnh đó còn có những... nghiên cứu - Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn nitrat hóa trong mẫu nước thải - Nội dung 2: Thử nghiệm hoạt tính nitat hóa của các dòng đã phân lập - Nội dung 3: Định danh vi khuẩn dựa trên đặc điểm hình thái - Nội dung 4: Tối ưu một số điều kiện pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu Quy trình lấy mẫu phải đảm bảo vô trùng... hiệu quả phân giải TAN đáng kể (khoảng 3,2 mg N-NH4+/l.ngày) 22 PHẦN 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu Dòng vi khuẩn nitrate hóa từ các mẫu nước được phân lập tại một số địa điểm như trại nuôi lợn khoa Chăn Nuôi Thú Y, khu kí túc xá sinh vi n trường Nông Lâm Thái Nguyên 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, ... nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrate hoá Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm hai nhóm nhỏ tham gia vào hai giai đoạn của quá trình này Người đầu tiên nghiên cứu về vi khuẩn nitrate hóa và hoạt động sinh lý của chúng là nhà khoa học Nga Winogradsky Năm 1889, ông chứng minh vi khuẩn nitrate hóa là những loài vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ bằng tổng hợp hóa học. .. được phân lập từ nguồn nước ngọt nhiễm ammonium ở Vi t Nam Cụ thể đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa đến 4 dòng như ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl, các nguồn cacbon hữu cơ, ảnh hưởng của nồng độ ammonium hay nitrite lên sinh trưởng của các dòng đã được phân lập Một nghiên cứu khác của (Trần Liên Hà và cs, 2007) tiến hành nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn nitrate