BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - VŨ THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT MỚI HYDROXAMIC ACID TRÊN CƠ SỞ ARTEMISININ VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HDAC Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Kỹ thuật hóa học) NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS Trần Khắc Vũ Hà Nội – Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN Luận văn Thạc sĩ Khoa học chuyên ngành Kỹ thuật Hóa học với đề tài “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất Hydroxamic acid sở Artemisinin hoạt tính ức chế HDAC” hoàn thành hướng dẫn PGS.TS Trần Khắc Vũ – Bộ môn hóa dược hóa chất bảo vệ thực vật –Viện Kỹ thuật Hóa học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin cam đoan kết luận án hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận án Vũ Thị Hà LỜI CẢM ƠN Luận án hoàn thành môn Hóa dược, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Trần Khắc Vũ giao cho đề tài hướng dẫn tận tình, chu đáo tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn quan tâm giúp đỡ thầy cô môn Hóa Dược Hóa chất bảo vệ thực vật, thầy cô giáo trường, ban lãnh đạo viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian làm luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Mạnh Cường anh chị em phòng Hoạt chất Sinh học ban lãnh đạo viện Hóa học hợp chất thiên nhiên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Thảo anh chị phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ hoàn thành nghiên cứu hoạt tính sinh học luận án Cuối muốn cảm ơn tới gia đình bạn bè cổ vũ động viên suốt thời gian qua Luận văn thực với tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED), mã số đề tài:104.01-2013.01 Nhân dịp xin chân thành cảm ơn ủng hộ quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Vũ Thị Hà năm 2015 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ HDAC VÀ ARTEMISININ 11 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYM HISTON DEACETYLASE 11 1.1.1 Định nghĩa HDAC 11 1.1.2 Phân loại HDAC 12 1.1.3 Cấu tạo HDAC chế phản ứng deacetyl hóa 15 1.1.4 Mối liên hệ ung thư HDAC 17 1.1.5 Các chất ức chế HDAC (HDACIs) 17 1.1.6 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC (HDACIs) 20 1.1.7 Liên quan cấu trúc tác dụng chất ức chế HDAC mang cấu trúc acid hydroxamic 21 1.1.8 Thiết kế công thức cho HDACIs 22 1.1.9 Một số nghiên cứu thiết kế , thí nghiệm chất ức chế HDAC gần 23 1.2 TỔNG QUAN VỀ ARTEMISININ 26 1.2.1 Giới thiệu artemisin 26 1.2.2 Các phương pháp sản suất artemisinin 28 1.2.3 Hoạt tính sinh học artemisinin dẫn xuất 29 1.2.4 Một số dẫn xuất artemisinin 31 CHƢƠNG 2: THIẾT BỊ DỤNG CỤ, PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 35 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng tổng hợp .35 2.2 Nội dung nghiên cứu 35 2.3 Các phương pháp dùng tổng hợp tinh chế 36 2.4 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc sản phẩm 36 2.5.1 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase 37 2.5.2 Thử độc tế bào: 38 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 41 3.1 Tổng hợp 10β-azidoartemisinin (3a) 41 3.2 Tổng hợp 10β-aminoartemisinin (4a) 42 3.4 Tổng hợp hợp chất hydoxamic acid 10(a-g) 49 3.5 Thử nghiệm hoạt tính đánh giá sinh học .55 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 Về tổng hợp 10β-azidoartemisinin (3a)(sơ đồ ) .58 4.2 Về tổng hợp 10β-aminoartemisinin (4a) .59 4.4 Về tổng hợp hợp chất acid hydroxamic 62 4.5 Về đánh giá hoạt tính sinh học 64 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC 74 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance spectroscopy) 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học (tính theo phần triệu) MS Phổ khối lượng HRMS Phổ khối phân giải cao TLC Sắc ký mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Ultraviolet S Singlet D Doublet T Triplet Q Quartet Dd double doublet M Multiplet Δ độ dịch chuyển hóa học J số tương tác spin NMR Nuclear Magnetic Resonace HRMS High Resolution Mass Spectrometry RT Nhiệt độ phòng CH3SiCl Trimethylsilyl chloride PPh3 Triphenyl photphin THF Tetrahydrofuran H2N-O-THP O-(Tetrahydropyran-2-yl)hydroxylamin C-NMR DMSO-d6 Dimethylsulfoxid deutri hóa CDI Carbonyl diimidazol EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) DMAP Dimethyl aminoprydin TSA Trichostatin A SAHA Suberoylanilid hydroxamic acid CBHA m-cacboxycinnamic acid bishydroxamid HAT Histon acetyltransferase HDAC Histon deacetylase IC50 Nồng độ ức chế 50% phát triển CS Khả sống sót tế bào tính theo % ADN Acid deoxyribonucleic HCV Hepatitis C virus HBV Hepatitis B virus HCMV Human cytomegalovirus ∆ Solvent heated under reflux TMS Tetramethylsilane DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Bảng 1: Bảng phân loại chất ức chế HDAC 18 Bảng 2: Một số hóa chất sử dụng tổng hợp tinh chế 35 Bảng 3: Kết thử hoạt tính HDAC chất 10(a-g) 64 Bảng 4: Hoạt tính gây độc tế bào acid hydroxamic 10(a-g) acid cacboxylic 9(a-g) 65 Hình 1: Cấu trúc nucleosom, HAT & HDAC điều hòa trình phiên mã kích hoạt 11 Hình 2: Phân loại lớp HDAC .13 Hình 3: Cấu tạo HDAC 16 Hình 4: Mối liên hệ cấu trúc HDAC acid hydroxamic 22 Hình 5: Docking hai hợp chất 10a 10g 66 Sơ đồ 1: Tổng hợp dẫn xuất Benzothiazole acid hydroxamic 24 Sơ đồ 2: Tổng hợp isatin-3-oxime hydroxamic acid 24 Sơ đồ 3: Tổng hợp 2-oxospiro[1,3]dioxolane/dithiolane-2,3-indoline-based acid hydroxamic 25 Sơ đồ 4: Tổng hợp acid hydroxamic từ acid cacboxylic 26 Sơ đồ 5: Quy trình tổng hợp dẫn xuất chalcone ART 33 Sơ đồ 6: Tổng hợp acid hydroxamic 10(a-e) .57 Sơ đồ 7: Tổng hợp acid hydroxamic (10f, 10g) 58 Sơ đồ 8: Điều chế 10β-azidoartemisinin 59 Sơ đồ 9: Tổng hợp hợp chất trung gian chứa nhóm acid cacboxylic 9(a-e) 60 Sơ đồ 10: Tổng hợp hợp chất trung gian chứa nhóm acid cacboxylic (9f, 9g) 61 Sơ đồ 11: Tổng hợp hơp chất acid hydroxamic 10(a-g) 62 MỞ ĐẦU Con người ngày tác động nhiều vào tự nhiên cho môi trường ngày biến đổi theo hướng lợi làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, phá vỡ cân sinh thái, làm phát triển bền vững nhân loại Xã hội ngày phát triển kèm điều thiên tai, dịch bệnh ngày diễn biến phức tạp khó kiểm soát Hiện nay, giới phải đối mặt với bệnh phức tạp, bệnh nan y tình trạng lây lan khó kiểm soát dịch bệnh nguy hiểm, có khả lan rộng thành đại dịch quy mô toàn cầu Bên cạnh đó, tình trạng kháng thuốc dịch bệnh trước ngày phổ biến Có đưa số ví dụ điển HIV/AIDS, bệnh ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, dịch cúm gia cầm gần dịch Ebola… Từ thực tế thúc đẩy tìm kiếm thuốc chữa bệnh có hiệu cao hơn, tác dụng chọn lọc giá thành rẻ Có nhiều đường để tìm hoạt chất có tác dụng chữa bệnh để phát triển thành dược phẩm tổng hợp hóa học từ hóa chất bản, thứ hai bán tổng hợp từ hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng thuốc đông y Hiện tương lai có lẽ đường phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên đường hữu hiệu hứa hẹn mở nhiều tương lai cho ngành hóa dược Thực tế chứng minh nhiều hợp chất có nguồn gốc tự nhiên sử dụng lĩnh vực chữa bệnh … artemisinin chiết từ Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) sử dụng để làm thuốc sốt rét Artemisinin nhà khoa học Trung Quốc phân lập lần đầu tiên, sau hợp chất dẫn xuất ứng dụng hiệu điều trị sốt rét Những năn gần đây, nhà khoa học phát thử nghiệm thành công in vitro hoạt tính gây độc tế bào ung thư artemisinin (ART) Tuy nhiên hạn chế khả tan nước dầu kém, độ nhờn thuốc cao, thời gian bán hủy huyết tương ngắn khả gây độc tế bào thần kinh nên hợp chất có hạn chế sử dụng Vì nhà khoa học tập trung nghiên cứu bán tổng hợp dẫn xuất ART để tìm hợp chất có hoạt tính cao điều trị bệnh hiểm nghèo ung thư Một nghiên cứu mang tính khoa học lớn việc tìm vai trò enzyme histon deacetylase sinh lý bệnh ung thư Quá trình phiên mã biểu bất thường gen mã hóa histon deacetylase hay phần gắn chúng bị đột biến nguyên nhân dẫn đến trình công phát triển ung thư Các chất ức chế histon deacetylase phục hồi lại biểu gen, ức chế phát triển sống sót tế bào ung thư Một loạt chất ức chế histon deacetylase nghiên cứu phát triển, chất acid hydroxamic ví dụ điển hình Với khả ức chế in vitro hoạt tính gây độc tế bào ung thư artemisinin (ART) vai trò to lớn dẫn xuất acid hydroxamic Ngoài nguồn nguyên liệu artemisinin nước tự sản xuất việc nghiên cứu bán tổng hợp dẫn xuất từ khung hợp chất điều thuận lợi Từ lý trên, tiến hành đề xuất đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất Hydroxamic acid sở Artemisinin hoạt tính ức chế HDAC” Đề tài thực với hai mục tiêu:  Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất acid hydroxamic sở artemisinin  Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym histon deacetylase độc tế bào dẫn xuất bán tổng hợp 10 PHỤ LỤC 3: Phổ 1H-NMR aminoartemisinentanoic acid) 13 C-NMR hợp chất 77 9b (10β- PHỤ LỤC 4: Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 9c (10β-aminoartemisinin (3,3-dimethyl) pentanoic acid) 78 PHỤ LỤC 5: Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 9d (10β-aminoartemisinin butenoic acid) 79 PHỤ LỤC 6: Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 9f (10β-aminoartemisinin hexanoic acid) 80 PHỤ LỤC 7: Phổ 1H-NMR aminoartemisinin suberic acid) 13 C-NMR, HRMS hợp chất 9g (10β- 81 PHỤ LỤC 8: Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 9e (10β-aminoartemisinin phtalic acid) 82 PHỤ LỤC 9: Phổ 1H-NMR,13C-NMR HRMS hợp chất 10a 83 PHỤ LỤC 10: Phổ H-NMR,13C-NMR HRMS hợp chất 10b 84 85 PHỤ LỤC 11: Phổ 1H-NMR,13C-NMR HRMS hợp chất 10c 86 PHỤ LỤC 12: Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 10d 87 88 PHỤ LỤC 14: Phổ 1H-NMR,13C-NMR HRMS hợp chất 10g 89 PHỤ LỤC 15: Phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất 10e 90 91