ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM (a)(a)(a)(a)(a) VŨ HOÀI NAM TÊN ĐỀ TÀI: THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC ENZYME XÚC TÁC CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP β- carotene TRONG VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ HOÀI NAM TÊN ĐỀ TÀI THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GENE MÃ HÓA CHO CÁC ENZYME XÚC TÁC CON ĐƢỜNG SINH TỔNG HỢP β- carotene TRONG VI KHUẨN Escherichia coli KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Ngành : Công nghệ sinh học Lớp : 43-CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2015 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Dƣơng Văn Cƣờng ThS Ma Thị Trang Thái Nguyên, 2015 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nỗ lực, cố gắng thân, nhân giúp đỡ, hướng dẫn, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hoàn thành khóa luận: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo T.s Dương Văn Cường, người tận tình giúp đỡ hướng dẫn bảo, giải đáp thắc mắc củng cố kiến thức cho Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.S Ma Thị Trang, cán phòng thí nghiệm công nghệ gene trực tiếp bảo kĩ làm việc, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đào tạo dạy dỗ suốt thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng 06 năm 2015 Sinh viên Vũ Hoài Nam ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ CoA : Coenzyme Acetoacetyl Cs : Cộng DNA : Deoxyribonucleic Acid E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic acit IPTG : Isopropyl Thiogalactoside Kb : Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth NCBI : Nation Cetrer for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Recation S chromofuscus : Streptomyces chromofuscus TAE : Tris-acetate-EDTA UV : Ultraviolet X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactoside ROS : Reactive Oxygen Species RNS : Reactive Nitrogen Species iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Hàm lượng carotenoid có thực vật 15 Bảng 3.1: Các thành phần vector pRSET-A 27 Bảng 3.2: Các thành phần vector pET22b(+) 28 Bảng 3.3: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 31 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI HindIII 36 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cắt với KpnI EcoRI 36 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt với EcoRI XbaI 37 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng gắn nối 39 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Công thức cấu tạo β-carotene .4 Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A Hình 2.3: Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 dự kiến đến năm 2018 .9 Hình 2.4: Sinh tổng hợp IPP DMAPP theo đường MAV .11 Hình 2.5: Sinh tổng hợp IPP DMAPP theo đường MEP 12 Hình 2.6: Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP DMAPP 13 Hình 2.7: Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene .13 Hình 2.8: Tổng hợp β-carotene từ lycopene .14 Hình 2.9: Sơ đồ tổng hợp β- carotene BASF .16 Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp β-carotene Roche 17 Hình 2.11: Quá trình chuyển hóa β-carotene tham gia gene Crt 19 Hình 2.12: Cơ chế kiểm soát phiên mã T7 promoter 20 Hình 2.13: Sơ đồ hệ thống vector biểu pRSET 22 Hình 2.14: Sơ đồ hệ thống vector biểu pET 22 Hình 2.15: Tương tác protein tái tổ hợp chứa 6xHis giá thể Niken .23 Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu pRSET .26 Hình 3.2: Cấu trúc vector biểu pET22b(+) 28 Hình 3.3: Quy trình thiết kế vector pR-iEIBY 33 Hình 3.4: Quy trình thiết kế vector pET22iEIBY 34 Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pR-iEIY 41 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm cắt kiểm tra có mặt gene crtY .42 Hình 4.3: Hình minh họa sở kiểm tra chiều gắn gen crtY vector pR-iEIY 43 Hình 4.4: Kết điện di sản phẩm cắt kiểm tra chiều gắn gene crtY pRiEIY 44 Hình 4.5: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pR-iEIBY .45 Hình 4.6: Kết điện di sản phẩm cắt kiểm tra có mặt gene crtB 46 Hình 4.7: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pET22-Y 47 Hình 4.8: Kết điện di chọn lọc dòng pET22-Y với enzyme EcoRI 47 v Hình 4.9: Hình minh họa sở kiểm tra chiều gắn gen crtY vector pET22-Y 48 Hình 4.10:Kết điện di kiểm tra chiều gắn crtY vector pET22-Y 49 Hình 4.11: Kết điện di kiểm tra dòng plasmid pET22-iEIBY 49 Hình 4.12: Kết điện di chọn lọc dòng pET-iEIBY với enzyme XbaI EcoRI 50 Hình 4.13: Hình minh họa sở kiểm tra chiều gắn cụm gene iEIB vector pET22iEIBY .51 Hình 4.14: Kết điện di kiểm tra chiều gắn cụm iEIB vector pET22-iEIBY 52 Hình 4.15: Kết biểu vector pR-iEIBY chủng E coli BL21 (DE3) 53 Hình 4.16: Kết biểu vector pET22iEIBY chủng E coli BL21 (DE3) 54 Hình 4.17: Kết so sánh so sánh biểu hai hệ vector pRSET-A pET22b(+) 55 vi MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Mục tiêu nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát sắc tố β-carotene 2.1.1 Cấu trúc tính chất lý hóa 2.1.2 Vai trò sắc tố β-carotene với người 2.1.2.1 Vai trò β-carotene sức khỏe người 2.1.2.2 Ứng dụng β-carotene công nghiệp 2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene 10 2.1.4 Nguồn cung cấp β-carotene 14 2.1.4.1 Nguồn cung từ thực vật 14 2.1.4.2 Nguồn cung từ vi sinh vật 15 2.1.4.3 Nguồn cung từ tổng hợp hóa học 16 2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên 18 2.2 Vi khuẩn E.coli hệ vector biểu sản xuất protein tái tổ hợp 19 2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn E coli sản xuất protein tái tổ hợp 19 2.2.2 Một số hệ thống vector biểu vi khuẩn E coli 21 2.3 Tình hình nghiên cứu nước 23 2.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 23 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 25 Phần VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.1.1 Vi khuẩn 26 3.1.2 Vật liệu 26 3.1.2.1 Enzyme 26 vii 3.1.2.2 Vector 26 3.1.3 Hóa chất 29 3.1.4 Dụng cụ 31 3.1.5 Thiết bị 31 3.1.6 Phạm vi nghiên cứu 31 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 32 3.3 Nội dung nghiên cứu 32 3.4 Phương pháp nghiên cứu 33 3.4.1 Phương pháp thiết kế in silico 34 3.4.2 Phương pháp lập đồ giới hạn 35 3.4.3 Phương pháp điện di DNA gel agarose 37 3.4.4 Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose 38 3.4.5 Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu 38 3.4.6 Phương pháp chuẩn bị tế bào E coli khả biến 39 3.4.7 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến sốc nhiệt 39 3.4.8 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 40 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Thiết kế vector biểu mang policistron gồm gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY tảng vector biểu pRSET-A tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY 41 4.1.1 Kết gắn gene crtY vào vector pR-iEI tạo vector tái tổ hợp pR-iEIY 41 4.1.2 Kết gắn gene crtB vào vector pR-iEIY tạo vector tái tổ hợp pR-iEIBY 45 4.2 Thiết kế vector biểu mang policistron gồm gene idi-crtE-crtI-crtB-crtY tảng vector biểu pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY 46 4.2.1 Kết gắn gene crtY vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp pET22-Y 46 4.2.2 Kết gắn cụm gene idi-crtE-crtI-crtB vào vector pET22-Y tạo vector tái tổ hợp pET22-iEIBY 49 4.3 Kết kiểm tra hoạt động gene 52 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 5.1 Kết luận 56 5.2 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Carotenoid dạng sắc tố tự nhiên xuất chủ yếu thực vật loài sinh vật quang hợp khác nấm, tảo vài loại vi khuẩn (SchmidtDannert, 2000) [57] Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng (Vershinin, 1999) [70] có khả chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003) [63] Ngày có khoảng 600 loại carotenoid tìm thấy 40 loại số cần thiết cho chế độ dinh dưỡng người (Rao and Rao, 2007) [52] β-carotene sắc tố có màu vàng da cam, thuộc nhóm carotenoid Chúng tìm thấy số loại cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry, Netto et al 1998) [18] β-carotene biết đến tiền chất để tổng hợp vitamin A – loại vitamin cần thiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al 2003; Stutz, Bresgen et al 2015) [35, 65] Theo tổ chức WHO FAO năm có hàng triệu trẻ em bị mắc bệnh mắt mà nguyên nhân chủ yếu thiếu provitamin A phần ăn (Harjes, Rocheford et al 2008) [26] Ở động vật, β-carotene sử dụng suốt trình sinh trưởng, chúng tham gia vào loạt trình sinh lý, sinh sản, phát triển biểu bì mô, cấu trúc xương tăng cường khả miễn dịch (Sklan, 1987) [60] Nhiều nghiên cứu β-carotene có tác dụng ngăn ngừa trình oxy hóa cách loại bỏ gốc oxy tự để bảo vệ tế bào thể, ngăn ngừa trình phát triển tế bào ung thư, bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat, Goscianska et al 2015) [29] Trong năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày tăng Theo thống kê công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoid đạt 1,2 tỉ USD năm 2010 tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018 Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao với 262 triệu USD (chiếm 21,8%) năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân năm 1,8% dự kiến đến năm 2018 tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) [11] Để đáp ứng nhu cầu βcarotene sản xuất theo hai đường chính: Một đường tổng hợp hóa 54 không đủ mạnh nên kết promoter phiên mã đoạn gene kháng amp trình tự gene nằm vùng MCS, sau đoạn mRNA dịch mã tạo thành protein  Biểu hệ vector pET22-iEIBY vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Hình 4.16: Kết biểu vector pET22iEIBY chủng E coli BL21 (DE3) Ống 1: Cặn khuẩn sau cảm ứng IPTG Ống 2: Cặn khuẩn trước cảm ứng IPTG Theo kết hình 4.16, điều kiện biến nạp, tế bào E coli BL21 (DE3) mang vector pET22iEIBY biểu màu sắc có cảm ứng IPTG (ống 1) so với ống không cảm ứng Tuy nhiên mức độ biểu màu sắc yếu, màu sắc thể màu sắc độ đậm không cao Từ kết cho thấy vector tái tổ hợp thiết kế hoạt động tốt, đảm bảo trình phiên mã, dịch mã, tạo enzyme xúc tác trình sinh tổng hợp β-carotene (màu vàng vi khuẩn E coli DH5α mang vector pRiEIBY E coli BL21 (DE3) mang vector pET22iEIBY, màu da cam vi khuẩn E coli BL21 (DE3) mang vector pRiEIBY Như vậy, thiết kế thành công hai vector vector biểu pR-iEIBY pET22-iEIBY chứa gene mã hóa cho enzyme xúc tác đường sinh tổng hợp β-carotene vi khuẩn E coli tảng vector biểu pRSET-A pET22b(+) 55  So sánh khả biểu hai hệ vector pR-iEIBY pET22-iEIBY Hình 4.17: Kết so sánh biểu hai hệ vector pRSET-A pET22b(+) Ống 1: Hệ vector pRSET-A Ống 2: Hệ vector pET22b(+) Từ kết hình 4.17, hai hệ vector biểu màu vàng da cam hai màu đặc trưng sắc tố β-carotene Bằng cảm quan thấy, hệ vector pRSET-A (biểu màu da cam) có biểu mạnh hẳn so với hệ vector pET22b(+) biểu màu vàng Như vậy, với kết này, tạm thời kết luận hệ vector có số cao có biểu sắc tố β-carotene mạnh hẳn so với hệ vector có số lượng thấp Tuy nhiên để khẳng định chắn cần phải tiến hành định lượng β-carotene thu phương pháp sắc ký lỏng cao áp 56 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đã tạo thành công hai vector biểu pR-iEIBY pET22-iEIBY chứa gene mã hóa cho enzyme xúc tác đường sinh tổng hợp β-carotene vi khuẩn E coli tảng vector biểu pRSET-A pET22b(+) - Biểu thành công hai vector pR-iEIBY pET22-iEIBY vi khuẩn E coli tạo màu vàng da cam (màu đặc trưng β-carotene) - Bằng cảm quan cho thấy, hệ vector pRSET-A với số lượng có suất biểu sắc tố beta-carotene mạnh hẳn (màu da cam) so với hệ vector pET22b(+) có số thấp biểu màu vàng 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu chuyển gene idi, crtI, crtE, crtB, crtY lên hệ vector biểu khác pET28, pQE30, pGEX - Biến nạp hệ vector tái tổ hợp vào chủng E coli khác để tìm giải pháp tối ưu cho việc biểu β-carotene vi khuẩn E coli - Tiến hành phân tích cặn khuẩn thu từ hệ biểu chủng biểu khác phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) để đánh khả sinh tổng hợp β-carotene 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Xuân Vũ, Ngô Xuân Bình, Dương Văn Cường (2012) “Tạo chủng E coli có khả sản xuất lycopene” Tạp chí Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn –kỳ -tháng 3/2012: 10-14 Nguyễn Thị Lý, T T H V (2010) "Tách tinh dầu carotenoid từ trầu (Piper betle L.)." Hội Nghị Khoa Học & Công Nghệ lần 9, Phân ban Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Bách khoa - Tp.HCM Ha Thi Bich Ngoc, T T H N., Nguyễn Văn Mùi (2007) "Điều tra hợp chất carotenoid số thực vật Việt Nam" Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23: 130-134 II Tài liệu tiếng anh Adetayo O Omoni and R E Aluko (2005) "The anti-carcinogenic and antiatherogenic effects of lycopene: a review." Trends in Food Science & Technology 16(8): 344-350 ANS, E P o F A a N S a t F (2012) "Scientific Opinion on the reevaluation of mixed carotenes (E 160a (i)) and Anupam Singh, Vaibhav Upadhyay, Arun Kumar Upadhyay, Surinder Mohan Singh and A K Panda (2015) "Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process." Microb Fact Cell 14(41): doi: 10,1186 / s12934-12015-10222-12938 Aoki, H., N T Kieu, N Kuze, K Tomisaka and N Van Chuyen (2002) "Carotenoid pigments in GAC fruit (Momordica cochinchinensis SPRENG)." Biosci Biotechnol Biochem 66(11): 2479-2482 Armstrong, G A and J E Hearst (1996) "Carotenoids 2: Genetics and molecular biology of carotenoid pigment biosynthesis." Faseb j 10(2): 228237 58 Baky., H H A E and G S El-Baroty (2013) "Healthy Benefit of Microalgal Bioactive Substances." Journal of Aquatic Science 1(1): 11-23 10 Baneyx, F (1999) "Recombinant protein expression in Escherichia coli." Curr Opin Biotechnol 10(5): 411-421 11 BCC (2011) "The Global Market for Carotenoids." 12 Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto and M A Z Coelho (2011) "Technological Aspects of β-Carotene Production." Food and Bioprocess Technology 4( 5): 693-701 13 Biesalski, H K., G R Chichili, J Frank, J von Lintig and D Nohr (2007) "Conversion of beta-carotene to retinal pigment." Vitam Horm 75: 117-130 14 Britton, G (1995) "Structure and properties of carotenoids in relation to function." Faseb j 9(15): 1551-1558 15 Camps, M (2010) "Modulation of ColE1-like Plasmid Replication for Recombinant 16 Cooper GM (1992) " Elements of human cancer." Boston: Jones and Bartlett Publishers p 16: ISBN 978-970-86720-86191-86728 17 Del Campo, J A., J Moreno, H Rodriguez, M A Vargas, J Rivas and M G Guerrero (2000) "Carotenoid content of chlorophycean microalgae: factors determining lutein accumulation in Muriellopsis sp (Chlorophyta)." J Biotechnol 76(1): 51-59 18 Desobry, S A., F M Netto and T P Labuza (1998) "Preservation of betacarotene from carrots." Crit Rev Food Sci Nutr 38(5): 381-396 19 Dhalla, N S., R M Temsah and T Netticadan (2000) "Role of oxidative stress in cardiovascular diseases." J Hypertens 18(6): 655-673 20 Ernst, H (2002) "Recent advances in industrial carotenoid synthesis." ChemInform 74(11): 2213–2226 21 Fujisawa, M., M Watanabe, S K Choi, M Teramoto, K Ohyama and N Misawa (2008) "Enrichment of carotenoids in flaxseed (Linum 59 usitatissimum) by metabolic engineering with introduction of bacterial phytoene synthase gene crtB." J Biosci Bioeng 105(6): 636-641 22 GBD (2015) "Global, regional, and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death, 1990-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013." Lancet 385(9963): 117-171 23 Goodwin, T W (1980) "The Biochemistry of the Carotenoids." Plants 24 Gordon, J E and M Schooff (2002) "Can high-dose supplementation with vitamins C and E, beta carotene, and zinc slow the progression of macular degeneration?" J Fam Pract 51(2): 105 25 Guerin, M., M E Huntley and M Olaizola (2003) "Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition." Trends Biotechnol 21(5): 210-216 26 Harjes, C E., T R Rocheford, L Bai, T P Brutnell, C B Kandianis, S G Sowinski, A E Stapleton, R Vallabhaneni, M Williams, E T Wurtzel, J Yan and E S Buckler (2008) "Natural genetic variation in lycopene epsilon cyclase tapped for maize biofortification." Science 319(5861): 330-333 27 Heller, F R., O Descamps and J C Hondekijn (1998) "LDL oxidation: therapeutic perspectives." Atherosclerosis 137 Suppl: S25-31 28 Hyung Seok Choi, Sang Yup Lee, Tae Yong Kim and H M Woo (2010) "In Silico Identification of Gene Amplification Targets for Improvement of Lycopene Production." Appl Environ Microbiol 76(10): 3097–3105 29 Igielska-Kalwat, J., J Goscianska and I Nowak (2015) "Carotenoids as natural antioxidants." Postepy Hig Med Dosw (Online) 69(0): 418-428 30 Ikeda, M and R Katsumata (1992) "Metabolic Engineering To Produce Tyrosine or Phenylalanine in a Tryptophan-Producing Corynebacterium glutamicum Strain." Appl Environ Microbiol 58(3): 781-785 31 Invitrogene (2010) "pRSETa,b and c For high-level expression of recombinant proteins in E coli." invitrogene in TM by life technologies 315-20: 25-0213 60 32 Jana, S and J K Deb (2005) "Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli." Appl Microbiol Biotechnol 67(3): 289-298 33 Jones, K L., S W Kim and J D Keasling (2000) "Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria." Metab Eng 2(4): 328-338 34 K L Perry, T A Simonitch, K J Harrison-Lavoie and S T Liu (1986) "Cloning and regulation of Erwinia herbicola pigment genes." J Bacteriol 168(2): 607–612 35 Lampert, J M., J Holzschuh, S Hessel, W Driever, K Vogt and J von Lintig (2003) "Provitamin A conversion to retinal via the beta,beta-carotene-15,15'oxygenase (bcox) is essential for pattern formation and differentiation during zebrafish embryogenesis." Development 130(10): 2173-2186 36 Lee, P C., A Z Momen, B N Mijts and C Schmidt-Dannert (2003) "Biosynthesis of structurally novel carotenoids in Escherichia coli." Chem Biol 10(5): 453-462 37 Lee, P C and C Schmidt-Dannert (2002) "Metabolic engineering towards biotechnological production of carotenoids in microorganisms." Appl Microbiol Biotechnol 60(1-2): 1-11 38 Lewin, B (2003) "Gene VIII Book" 39 Lien Ai Pham-Huy, Hua He and C Pham-Huy (2008) "Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health." Int J Biomed Sci 4(2): 89-96 40 Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez, Alejandro Méndez-Zavala and C N Aguilar (2014) "Biotechnological production of carotenoids by yeasts: an overview." Microb Cell Fact 13(12): 1475-2859 41 Lynen, F (1967) "Biosynthetic pathways from acetate to natural products." Pure Appl Chem 14(1): 137-167 42 Maiani, G., M J Caston, G Catasta, E Toti, I G Cambrodon, A Bysted, F Granado-Lorencio, B Olmedilla-Alonso, P Knuthsen, M Valoti, V Bohm, 61 E Mayer-Miebach, D Behsnilian and U Schlemmer (2009) "Carotenoids: actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans." Mol Nutr Food Res 53 Suppl 2: S194-218 43 Mbuyi, J M., J Dequeker, F Bloemmen and E Stevens (1982) "Plasma proteins in human cortical bone: enrichment of alpha HS-glycoprotein, alpha acid-glycoprotein, and IgE." Calcif Tissue Int 34(3): 229-231 44 Mendis, Shanthi;, Puska, Pekka;, Norrving and Bo (2014) "Global atlas on cardiovascular disease prevention and control." Geneva: World Health Organization in collaboration with the World Heart Federation and the World Stroke Organization: pp3-18 45 Misawa, N., S Yamano and H Ikenaga (1991) "Production of beta-carotene in Zymomonas mobilis and Agrobacterium tumefaciens by introduction of the biosynthesis genes from Erwinia uredovora." Appl Environ Microbiol 57(6): 1847-1849 46 Miura, Y., K Kondo, T Saito, H Shimada, P D Fraser and N Misawa (1998) "Production of the carotenoids lycopene, beta-carotene, and astaxanthin in the food yeast Candida utilis." Appl Environ Microbiol 64(4): 1226-1229 47 Moran, A E., M H Forouzanfar, G A Roth, G A Mensah, M Ezzati, C J Murray and M Naghavi (2014) "Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 study." Circulation 129(14): 1483-1492 48 Nagao, A (2009) "Absorption and function of dietary carotenoids." Forum Nutr 61: 55-63 49 Novagen (2006) "pET System Manual." TB055 11th Edition, Rev.B 0403, USA 800-207-0144 50 Olson, J A (1999) "Carotenoids and human health." Arch Latinoam Nutr 49(3 Suppl 1): 7s-11s 62 51 Parker, R S., J E Swanson, C S You, A J Edwards and T Huang (1999) "Bioavailability of carotenoids in human subjects." Proc Nutr Soc 58(1): 155-162 52 Rao, A V and L G Rao (2007) "Carotenoids and human health." Pharmacol Res 55(3): 207-216 53 Reaven, P D., E Ferguson, M Navab and F L Powell (1994) "Susceptibility of human LDL to oxidative modification Effects of variations in betacarotene concentration and oxygen tension." Arterioscler Thromb 14(7): 1162-1169 54 Ribaya-Mercado, J D., C C Maramag, L W Tengco, G G Dolnikowski, J B Blumberg and F S Solon (2007) "Carotene-rich plant foods ingested with minimal dietary fat enhance the total-body vitamin A pool size in Filipino schoolchildren as assessed by stable-isotope-dilution methodology." Am J Clin Nutr 85(4): 1041-1049 55 Robert Mierendorf, Keith Yeager and R Novy (1994) "pET system: Your choice for expression." News letter of Novagen Inc 1(1) 56 Roncone, D P (2006) "Xerophthalmia secondary to alcohol-induced malnutrition." Optometry 77(3): 124-133 57 Schmidt-Dannert, C (2000) "Engineering novel carotenoids in microorganisms." Curr Opin Biotechnol 11(3): 255-261 58 Sies, H and W Stahl (1998) "Lycopene: antioxidant and biological effects and its bioavailability in the human." Proc Soc Exp Biol Med 218(2): 121-124 59 Singh, N., A K Dhalla, C Seneviratne and P K Singal (1995) "Oxidative stress and heart failure." Molecular and Cellular Biochemistry 147(1): 77-81 60 Sklan, D (1987) "Vitamin A in human nutrition." Prog Food Nutr Sci 11(1): 39-55 61 Smith, T A (1998) "Carotenoids and cancer: prevention and potential therapy." Br J Biomed Sci 55(4): 268-275 63 62 Snodderly, D M (1995) "Evidence for protection against age-related macular degeneration by carotenoids and antioxidant vitamins." Am J Clin Nutr 62(6 Suppl): 1448s-1461s 63 Stahl, W and H Sies (2003) "Antioxidant activity of carotenoids." Mol Aspects Med 24(6): 345-351 64 Stephanopoulos, G (1994) "metabolic engineering." Curr Opin Biotechnol 5(2): 196-200 65 Stutz, H., N Bresgen and P M Eckl (2015) "Analytical tools for the analysis of beta-carotene and its degradation products." Free Radic Res: 1-31 66 Sugantha priya S, Gowri Shankar J, Thirumalaisamy R and K P (2010) "Over Expression of IPTG inducible GST protein in E.coli BL21." Journal of Biomedical Sciences and Research 2(1): 54-59 67 Tawfiq Abu-Rezq S., Suad Al-Hooti, Dangly Jacob, Mustafa Al-Shamali, Anwar Ahmed and N Ahmed (2010) "Induction and extraction of βcarotene from the locally isolated 68 The QIAexpressionistTM (2003) "A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins." Fifth edition, QIAGEN, Germany 69 Vachali, P., P Bhosale and P S Bernstein (2012) "Microbial carotenoids." Methods Mol Biol 898: 41-59 70 Vershinin, A (1999) "Biological functions of carotenoids diversity and evolution." Biofactors 10(2-3): 99-104 71 Voutilainen, S., T Nurmi, J Mursu and T H Rissanen (2006) "Carotenoids and cardiovascular health." Am J Clin Nutr 83(6): 1265-1271 72 Wolf, G (2001) "The discovery of the visual function of vitamin A." J Nutr 131(6): 1647-1650 73 Yamano, S., T Ishii, M Nakagawa, H Ikenaga and N Misawa (1994) "Metabolic engineering for production of beta-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae." Biosci Biotechnol Biochem 58(6): 1112-1114 64 74 Yoon, S.-H., Hye-Min Park, Ju-Eun Kim, Sook-Hee Lee, Myung-Suk Choi, Jae-Yean Kim, Deok-Kun Oh, Jay D Keasling and S.-W Kim (2007) "Increased β-Carotene Production in Recombinant Escherichia coli Harboring an Engineered Isoprenoid Precursor Pathway with Mevalonate Addition." Biotechnol 23(3): 599-605 75 Yoon, S H., S H Lee, A Das, H K Ryu, H J Jang, J Y Kim, D K Oh, J D Keasling and S W Kim (2009) "Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of beta-carotene in E coli." J Biotechnol 140(3-4): 218-226 76 Young, I S and J V Woodside (2001) "Antioxidants in health and disease." J Clin Pathol 54(3): 176-186 65 PHỤ LỤC Cắt với EcoRI Cắt với EcoRI HindIII HindIII Gắn nối Hình 1: Sơ đồ thiết kế in silico vector pR-iEIY phần mềm Vector NTI 66 Cắt với EcoRI Cắt với EcoRI KpnI KpnI Gắn nối Hình 2: Sơ đồ thiết kế in silico vector pR-iEIBY phần mềm Vector NTI 67 Cắt với EcoRI Cắt với EcoRI HindIII HindIII Gắn nối Hình 3: Sơ đồ thiết kế in silico vector pET22-Y phần mềm Vector NTI 68 Cắt với XbaI Cắt với XbaI EcoRI EcoRI Gắn nối Hình 4: Sơ đồ thiết kế in silico vector pET22-iEIBY phần mềm Vector NTI [...]... tổ hợp 1.2 Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli Kiểm tra ảnh hưởng của số bản copy tới năng suất biểu hiện β-carotene trong vi khuẩn E Coli 1.3 Mục tiêu nghiên cứu - Nội dung 1: Thiết kế vector biểu hiện mang polycistron chứa 5 gene idi-crtEcrtI-crtB-crtY trên nền tảng vector. .. quá trình sao chép  Vector pLUG-B: Là vector tách dòng pLUG mang gene crtB (930 bp) mã hóa cho enzyme phytoene desaturase, xúc tác cho quá trình chuyển hóa phytoene thành lycopene, tách dòng từ vi khuẩn P ananatis  Vector pLUG-Y : Chứa gene crtY (1161 bp) mã hóa cho enzyme lycopene cyclase, xúc tác cho quá trình chuyển hóa lycopene thành β-carotene  Vector pET22b(+) Đây là một vector biểu hiện có các. .. β-carotene ở quy mô nhỏ Vi c sử dụng các hợp chất β-carotene ở Vi t Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: Thiết kế vector biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình sinh tổng hợp β-carotene trong vi khuẩn Escherichia coli nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản... thống vector biểu hiện trong vi khuẩn E coli Vector biểu hiện pRSET Vector pRSET có nguồn gốc là các vector biểu hiện pUC, với kích thước nhỏ (~ 2,9kb) và số lượng bản sao cao (200-500 bản sao); chúng được thiết kế cho sự biểu hiện protein và tinh chế protein ở mức độ cao trong E coli Sự biểu hiện ở mức độ cao của các trình tự DNA được đưa vào vector pRSET do sự điều khiển của T7 promoter Vector biểu hiện. .. trên các loài sinh vật không chứa các gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene như S cerivisiae (Yamano, Ishii et al 1994) [73], C utilis (Miura, Kondo et al 1998) [46], E coli (Yoon, Lee et al 2009) [75]…bằng cách biến nạp các gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene vào vật chủ khác nhau 19 Hình 2.11: Quá trình chuyển hóa β-carotene dƣới sự tham gia các gene Crt 2.2 Vi khuẩn E coli và các hệ vector biểu. .. biểu hiện trong sản xuất protein tái tổ hợp 2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp Hiện nay, trong các kỹ thuật điều hướng trao đổi chất nhằm tập trung tổng hợp protenin tái tổ hợp có rất nhiều chủng chủ được nghiên cứu sử dụng Song trong số các chủng biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram âm E coli vẫn là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm của các. .. ảnh hưởng của gene idi trong con đường tổng hợp β-carotene Gene idi mã hóa cho enzyme IPP isomerase xúc tác chuyển đổi qua lại giữa IPP và DMAPP IPP và DMAPP là các chất trung gian đóng vai trò trung tâm trong con đường tổng hợp βcarotene Kết quả cho thấy thi được thêm gene idi hàm lượng β-carotene tạo thành đạt 135 mg/L cao gấp 4 lần so với vi c không có gene idi 33 mg/L (Yoon, 2007) [75] Trong những... nhiên, các nghiên cứu khi đó chỉ là nghiên cứu về cấu trúc, đặc tính lý hóa, tách chiết và tinh sạch từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên (Armstrong and Hearst 1996) [8] Vào những năm 1960, các nhà khoa học đã nghiên cứu về gene IPP isomerase do gene idi mã hóa xúc tác phản ứng đồng phân hóa từ IPP sang DMAPP ở vi khuẩn Cũng trong năm này, con đường sinh tổng hợp isoprenoid được phát hiện, sau đó các nhà... bản copy trong E coli đại diện cho hệ vector có số bản sao cao Hệ vector pET22b(+) có 15-20 bản copy - đại diện cho hệ vector có số bản sao thấp  Vector pR-iEI (a) Vector pR-iEI Vector pRSET-A Hình 3.1: Cấu trúc vector biểu hiện pRSET 27 Vecotor pR-iEI là vector biểu hiện pRSET-A đã được gắn thành công 3 gene: idi, crtI, crtE trước đó Về cơ bản các gene được gắn vào vị trí đa tách dòng nên các thành... protein tái tổ hợp sẽ được gắn thêm một chuỗi tín hiệu tiết bằng cách đưa một trình tự mã hóa cho chuỗi tín hiệu đó lên vector biểu hiện Chuỗi tín hiệu này được nhận biết bởi hệ thống tiết và được vận chuyển tới đúng nơi Hiện nay, vi c sản xuất các hợp chất carotenoid ở Vi t Nam vẫn còn một vấn đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở vi c tách chiết từ thực vật và phân lập các chủng vi sinh vật sản