MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học ứng dụng tổng hợp sinh hóa học, vi sinh vật học khoa học công nghệ để đạt đến ứng dụng công nghiệp lực vi sinh vật, tế bào, tổ chức nuôi cấy thành phần chúng Công nghệ sinh học thân mà rễ vi sinh vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và vòm với hàng nghìn loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y học, lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường Nhờ ứng dụng thành tựu mẻ công nghệ sinh học kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta tạo giống trồng có suất cao mà chống chịu với sâu bệnh, hạn hán điều kiện nghèo phân bón Nhờ bỏ qua việc lai chéo khắc phục tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn nhiều thời gian Kỹ thuật tái tổ hợp AND kỹ thuật in vitro mở khả lai khác loài làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền Đối với loại trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đem lại hiệu kinh tế rõ rệt Hiện nay, người ta bắt đầu ứng dụng khả nuôi cấy tế bào thực vật tách rời qui mô công nghiệp để thu nhận sản phẩm, hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, ứng dụng nhiều lĩnh vực kinh tế Ý thức triển vọng to lớn ngành khoa học đại này, xin giới thiệu sách công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học quan có liên quan CHỌN VÀ XỬ LÝ MẪU CẤY I Thực Vật Cây sử dụng để lấy mẫu cấy gọi mẹ hay gốc sử dụng nguồn cung cấp mẫu nuôi cấy chọn lọc theo kiểu hình mong muốn Cây lấy mẫu nuôi cấy muốn đạt kết cần lưu ý đến điều kiện sau: - - II Chế độ đinh dưỡng mẹ: mẫu cấy thích hợp cho nuôi cấy mô mẫu cấy lấy cung cấp đủ dinh dưỡng Tình trạng bệnh mẹ: mẹ chọn để lấy mẫu nuôi cấy phải hoàn toàn không bị nhiễm với mầm bệnh Thông thường bị nhiễm bệnh thường tạo chồi phân sinh mô chồi có kích thước nhỏ Thời gian lấy mẫu: yếu tố bên nhiệt độ, độ dài ngày, tình trạng nước cây,…ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng carbohydrate, protein dự trữ chất điều hòa sinh trưởng mô Tùy thuộc mẹ trồng tự nhiên đồng hay chăm sóc đặc biệt nhà lưới mà lấy mẫu nuôi cấy theo mùa lấy mẫu quanh năm Mẫu nuôi cấy ( explants ) Mẫu vật để nuôi cấy mảnh vật liệu thực vật tách từ mẹ để nuôi cấy ( Hình 2.3 ) Phẩm chất mẫu cấy định thành công mẫu vật nuôi cấy vào môi trường Đối với mẫu nuôi cấy cần lưu ý số đặc tính sau: - - Các vị trí thực vật sử dụng làm mẫu nuôi cấy mặt đất vị trí thực vật đất Mẫu nuôi cấy nhỏ càng dễ tránh vấn đề nhiễm bệnh thực vật ( virus, microplasma, bacteria ) giảm mức độ sống sót sau khử trùng Mô bên nhiễm mô bên Tuổi mẫu nuôi cấy tùy thuộc vào tuổi cành lấy mẫu: - Vị trí tuổi cành phía thường non vị trí tuổi cành phía ( Hình 2.4 ) III Sự vô trùng Nuôi cấy mô kỹ thuật nuôi cấy cần điều kiện vô trùng Một số từ chuyên môn cần làm rõ - Sự vô trùng (asepsis): Tránh nhiễm cách sử dụng phương pháp tuyệt trùng Làm quan hệ với sinh vật sống khác (Axenic) Tiệt trùng (Sterilization): Giết loại vi sinh vật bào tử nhiệt, lọc, hóa chất chất tiệt trùng khác Nguồn tạp nhiễm Có nguồn tạp nhiễm chính: - Dụng cụ thủy tinh, môi trường nút đậy không vô trùng tuyệt đối - Trên bề mặt bên mô nuôi tồn sợi nấm , bào tử vi khuẩn - Trong trình thao tác làm rơi nấm hay vi khuẩn theo bụi lên môi trường 3.1 Khử trùng bề mặt mẫu cấy Khử trùng bề mặt mẫu cấy thường thực với chất diệt nấm bệnh Sản phẩm dùng để khử trùng tốt sản phẩm rẻ tiền, không độc với mẫu vật người thao tác hiệu loại vi sinh vật phạm vi rộng Các bước thao tác khử trùng mẫu trình bày hình 2.8 3.2 Hóa chất khử trùng: có nhiểu loại hóa chất sử dụng để khử trùng bề mặt Dung dịch hypochloride Ion hypochloride có sodium hypochloride ( NaOCl) Caldium hypochloride (Ca(OCl)2) Sodium hypochloride hòa tan nước dạng lỏng Dung dịch có sản phẩm tẩy rửa nước Javel, Clorox Nồng độ cuối cần thiết thay đổi từ 0,25-2% trọng lượng/thể tích tùy thuộc vào vật liệu thí nghiệm thời gian ngâm mẫu Dung dịch thường với 5-20% thể tích/thể tích dung dịch Javel Clorox Tuy nhên, nên xem kỹ liều lượng dung dung tẩy rửa thương mại Tác dụng diệt khuẩn dung dịch hypochloride hypochloride acid (HOCl) ion OCl- Người ta cho HOCl hiệu OCl- hiệu diệt khuẩn Chlorine tốt dung dịch hypochloride acid nhẹ Dung dịch hypochloride nên sử dụng pH 6-7 Cả sodium calcium hypochloride có quan hệ đến khả oxy hóa Calcium hypochloride bán dạng bột thường rẻ sodium hypochloride Về mặt lý thuyết calcium hypochloride (Ca(OCl)2) chứa 99,2 % Chloride, thực tế chiếm 65-70% độ tinh khiết Dung dịch khử calicium hypochloride chuẩn bị cách hòa tan bột calcium hypochloride vào nước sau lọc qua giấy lọc sử dụng Calcium hypochloride phóng thích chloride hòa tan nước Điều có nghĩa chloride bị bột calcium hypochloride bị ẩm , sodium hypochloride bị hoạt tính theo thời gian đặt nơi ánh sáng mạnh.Nồng độ sử dụng từ 5-10% để ngâm mẫu 20 phút Các hỗn hợp chloride halogen khác - Nước chloride Nước Bromide Iodine Hỗn hợp Chloramine hữu Cồn Trong số loại cồn sử dụng để khử trùng, cồn ethanol sử dụng rộng rãi Cồn giết khuẩn mà lấy chất sáp từ mô mẫu cấy Cồn khử trùng thường sử dụng nồng độ từ 70-95% Cồn Methanol hiệu cồn ethanol Tuy nhiên, số trường hợp cồn isopropanol có hiệu thời gian khử trùng tương đối ngắn 0,5-1 phút nồng độ 100% Ion kim loại nặng - - Trong kim loại nặng Mercuric Chloride (HgCl) chất khử trùng thông dụng Sử dụng hóa chất phải cẩn thận độc cho thực vật lẫn động vật, chất thải sau khử trùng có ảnh hưởng đến môi trường Ở nước phát triển, chất thải sau khử trùng HgCl thu hồi tái sử dụng lại Các chất không thải môi trường tự nhiên chưa chưa xử lý Các ion Ag Cu sử dụng chất diệt khuẩn Các chất khử trùng khác Hai chất oxy hóa mạnh hydrogen peroxide (H2O2) potassium permanganate (KMnO4) báo cáo có hiệu cao khử trùng bề mặt Tuy nhiên, chất thường kết hợp trước sau khử trùng với chất khử trùng khác Chất khử nấm Nhiều chất khử nấm có nguồn gốc thuốc bảo vệ thực vật sử dụng khử trùng Ví dụ Benomyl, Carbendazim, Fenbendazol chất khử nấm thuốc bảo vệ thực vật khử trùng khử trùng bề mặt Nồng độ liều lượng thay đổi theo loại mẫu thực vật Người ta cho chất vào môi trường nuôi cấy Chất kháng sinh Một số chất kháng sinh sử dụng cho khử trùng bề mặt để loại trực tiếp vi khuẩn mẫu cấy Các chất kháng sinh thường sử dụng là: - 0,15% streptomycin 0,01% merthiolate thêm vào 4% NaOCl cho khử trùng bề mặt trái Euterpe 12 100μg/l hỗn hợp penicilin/streptomycin 15 phút chồi Đào 17% Alcide sau rifampicin (50μg/l) để khử trùng nốt thân Naucle 3.3 Thời gian khử trùng Nồng độ hóa chất thời gian khử trùng mẫu quan trọng Nếu nồng độ cao thời gian khử trùng dài mẫu bị tổn thương chết Còn nồng độ thấp thời gian khử trùng ngắn không giết vi sinh vật Nồng độ thấp thời gian khử trùng dài có hiệu nồng độ cao thời gian khử trùng ngắn Một số ví dụ cách khử trùng bề mặt Đoạn cành trồng đồng Pseudotsuga Pinus (Gupta Durzan, 1985) - Rửa nước máy 3-4 phút Ngâm bột giặt 0,1% 5-10 phút, sau rửa lại nước máy Thực tủ vô trùng Ngâm hydrogen peroxide 30% 15 phút, rửa lại nước cất vô trùng lần Ngâm sodium hypochloride 0,53% 10 phút, rửa lại nước cất khử trùng lần Ngâm HgCl 0,53% 10 phút, rửa lại nước cất khử trùng 5-6 lần Một phương pháp khác ( Debergh, 2003) Ngâm mẫu rửa mẫu nước bột giặt - Lắc alcohol vài giây HgCl (0,1-1%) + Teepol giọt/100ml: 3-5 phút Rửa nước cất tiệt trùng Chất tẩy thương mại 7-15% + Teepol giọt/100ml: 10-30 phút Rửa vài lần nước cất tiệt trùng Chú thích: - IV Nước máy bột giặt để lấy phần nhỏ bám dính bề mặt Ethanol 70% hiệu để làm biến tính protein Đối với ethanol 95% sử dụng để hòa tan lớp sáp bề mặt NaOCl (chất tẩy thương mại Javel, Clorox) Ca(OCl)2 hoạt động sở ion Cl- phản ứng oxy hóa khác HgCl hoạt động sở ion Cl- kim loại nặng làm biến tính protein, chất thấm (wetting agar) (ví dụ Teepol) thêm vào để tăng bám dính bề mặt Khử trùng phòng cấy tủ cấy Phòng cấy thường có diện tích hẹp, rộng từ 10 -15 m2 , có hai lớp cửa để tránh đưa không khí chuyển động trực tiếp từ bên đem bụi vào Sàn tường nhà lát gạch men để dễ lau chùi Trước tiến hành cấy cần khử trùng tủ cấy môi trường phòng cấy Các dụng cụ mang vào buồng cấy vô trùng trước: tủ quần áo choàng, mũ vải, trang, dao kéo, … Trên bàn cần thường xuyên có đèn cồn để sử dụng cấy cốc ống nghiệm đựng cồn 96o để nhúng dụng cụ làm việc Trước cấy, thí nghiệm học viên cần rửa tay xà phòng lau kỹ đến khuỷu tay cồn 70o Để đảm bảo mức độ vô trùng cao cần có đèn tử ngoại treo trần Phòng cấy lớn cần khử trùng đèn cực tím Thời gian khử trùng tùy theo kích thước phòng đèn cực tím sử dụng người Phòng khử trùng lau rửa hai lần tháng hóa chất tẩy nấm Phòng nhỏ khử trùng tia cực tím dung dịch khử trùng Tủ sấy thổi gió khử trùng phương pháp thổi quạt gió lau tất bề mặt cồn 96o 15 phút trước bắt đầu làm việc Phòng nuôi khử trùng trước hết xà phòng bột Sau lau cồn 96o Tất sàn, trần lau tuần Cẩn thận không nên khuấy động nơi bị nhiễm để tránh phát tán bào tử Cần giảm thiểu chuyển động không khí buồng cấy đến mức tối thiểu dụng cụ phục vụ việc cấy phải chuẩn vị đầy đủ để cấy tránh lại vào buồng cấy nhiều lần V Khử trùng môi trường dụng cụ nuôi cấy Thành phần chịu nhiệt hấp khử trùng Thành phần không chịu nhiệt lọc Hấp khử trùng: Môi trường hấp khử trùng cần nhiệt độ chọn sẵn áp suất tương ứng thời gian ẩn định Ví dụ 50kPa tương ứng với 1120C 100kPa tương ứng với 1200C 5.1 Các kiểu nồi hấp khử trùng 5.2 Khử trùng dụng cụ môi trường cấy a Dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh dung cho nuôi cấy mô bào thực vật bình thủy tinh suốt để ánh sáng qua mức tối đa trung tính để tránh kiềm từ bình thủy tinh gây ảnh hưởng đến phát triển mô nuôi cấy Cần rửa dụng cụ thủy tinh trước đưa vào sử dụng, xử lý tiệt trùng dụng cụ thủy tinh Dụng cụ kim loại, giấy nhôm,… cần khử trùng khí nóng (130 – 170oC) – tủ sấy Tất vật dụng phải gói kín trước khử trùng không gói giấy giấy bị phân rã nhiệt độ 170oC Không nên hấp khử trùng kim loại điều kiện nóng ẩm làm cho dụng cụ kim loại bị rỉ sét bị ăn mòn Trước sử dụng dụng cụ khử trùng khí nóng, dụng cụ lấy khỏi giấy gói, nhúng vào cồn 96o đốt lửa đèn cồn Sau dùng xong, dụng cụ phải đốt lửa đèn cồn trước sử dụng tiếp Khi sử dụng cồn cần lưu ý an toàn tối đa dễ bị Autoclave phương pháp khử trùng nước áp suất định Các dụng cụ khác khử trùng nồi hấp Hầu hết tất vi sinh vật chết nước nồi hấp 10 – 15 phút 121oC Nhiệt độ(oC) 160 170 180 190 Thời gian khử trùng(phút) 45 18 7,5 1,5 b Nút đậy: Thường dùng nút đậy làm không thấm nước Nút phải tương đối chật để đảm bào bụi không qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc dễ dàng trình nuôi cấy c Khử trùng môi trường khoáng: Để khử trùng môi trường khoáng thường sử dụng hai phương pháp hấp vô trùng hay sử dụng màng lọc vô trùng Môi trường nuôi cấy, nước cất hóa chất ổn định khác chứa bình thủy tinh đậy nút gòn, giấy nhôm nút nhựa Tuy nhiên môi trường chất không bền nhiệt cần sử dụng phin lọc milipore Nói chung môi trường khoáng hấp nhiệt độ 121oC, atm Với môi trường tích nhỏ (100ml hơn) thời gian khử trùng khoảng 15 -20 phút Còn với lượng môi trường lớn phải khử trùng 30 – 40 phút, áp suất không nên atm, áp suất cao làm phân hủy carbohydrate phức hợp nhạy cảm với nhiệt độ Thể tích môi trường(ml) Thời gian khử trung tối thiểu(phút) 20 – 25 24 50 26 100 28,5 250 31,5 500 35 1000 40 2000 48 3000 55 4000 63 Nhiều loại protein, vitamin, amino acid, phytohormone, … không bền nhiệt nên dùng phin lọc micropore để khử trùng Phin lọc milipore phin lọc seitz sử dụng với kích thước lỗ không lớn 0,25µm Các loại bình đựng thủy tinh cần hấp tiệt trùng trước lọc NUÔI CẤY BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TÚI PHẤN Trong phần lớn chương trình chọn giống việc tạo giống cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn chọn lọc dòng mong muốn hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối tạo dòng đồng hợp tử Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn kỹ thuật hữu hiệu để tạo dòng đồng hợp tử từ hệ (dòng đơn bội kép), tiết kiệm nguồn lực rút ngắn thời gian cần thiết để tạo giống Nuôi cấy bao phấn kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục môi trường dinh dưỡng để tạo đơn bội Số nhiễm sắc thể đơn bội nhân đôi để tạo lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi thể đơn bội kép Việc nuôi cấy bao phấn có ích nhà chọn giống đơn bội kép sử dụng để làm dòng tự thụ phấn giao phấn Thời gian cần thiết để tạo giống hay dòng tự phối phương pháp đơn bội kép rút ngắn nhiều hệ so với phương pháp truyền thống Các dòng đơn bội kép tạo hội để cải thiện hiệu chọn lọc nhiều tính trạng quần thể phương sai trội, đồng thời gene lặn biểu kiểu hình Kỹ thuật áp dụng thành công Trung Quốc việc tạo giống lúa lúa mì Tuy nhiên, hạn chế việc áp dụng rộng rãi phương pháp khả nuôi cấy khó tính đặc thù cao kiểu gene Ví dụ, nhà chọn giống lúa Indica sử dụng kỹ thuật có hiệu nhà chọn giống lúa Japonica kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn bị ảnh hưởng giai đoạn phát triển bao phấn, điều kiện sinh lý cho phấn, điều kiện xử lý trước nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy hiệu lưỡng bội hoá colchicine Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn Guha and Maheshwari nghiên cứu năm 1964 Kỹ thuật ứng dụng tạo cá thể đơn bội cho 200 loài trồng, bao gồm cà chua, lúa, thuốc lá, lúa mạch, phong lữ Kỹ thuật cấy túi phấn I Điều kiện sinh trưởng mẹ Ở túi phấn, tình trạng sinh lý mẹ quan trọng ( Ví dụ: quang kỳ, nhiệt độ sử dụng nông dược).Điều kiện sinh trưởng mẹ sử dụng để cung cấp túi phấn cho nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể thành công việc nuôi cấy Mỗi loài cần chế độ môi trường khác Các yếu tố môi trường bên nhiệt độ, quang kỳ cường độ ánh sáng ,ví dụ nuôi cấy túi phấn thực hoàn hảo Thuốc Lá ( Nicotiana tabacum ) điều kiện quang kỳ ngắn (8 giờ) cường độ ánh sáng cao ( 16000 lux ) có lợi cho nuôi cấy túi phấn Trong đó, lúa mạch (Hordeum vulgare) cần giảm nhiệt độ (12oC) cường độ ánh sáng cao (20000 lux) khuyến cáo II Tuổi mẹ giai đoạn phát triển hoa Người ta khuyến cáo túi phấn lấy giai đoạn hoa, hoa chưa già Mỗi loài hoa theo chu kỳ sống khác nhau, có sau hoa chết, có hoa sau sinh trưởng hoa tiếp Sức sống hạt phấn tùy thuộc vào sức sống mẹ Cây mẹ non cung cấp hoa mang hạt phấn có sức sống mạnh mẹ già Qúa trình hình thành phát triển hoa thay đổi theo loài Đối với thuốc lá, hoa dược lấy giai đoạn (hình 5.2) cấy dễ thành công Giai đoạn đặc biệt giai đoạn phát triển túi phấn thời gian cấy yếu tố quan trọng để đạt thành công thành lập đơn bội Ở hạt kín, có nhiều túi phấn khó xác định cho mầm hoa, chọn vài túi phấn giai đoạn khác phát triển hạt phấn Ở loài có nhiều túi phấn hoa, loạt mầm hoa phải xác định tất giai đoạn phát triển hạt phấn Một số đặc tính quan sát phân biệt dễ dàng sử dụng vào giai đoạn phát triển thích hợp ví dụ giai đoạn 2, cánh hoa lớn đài hoa III Giai đoạn phát triển hạt phấn Giai đoạn tối ưu phát triển hạt phấn vào thời gian thu hoạch mầm hoa quan trọng Ở Thuốc lá, giai đoạn phân bào hạt phấn (Pollen grain mitosis = PGM) cho kết tốt nhất, ngũ cốc Cải (Brassica) giai đoạn tối ưu thời kì đơn nhân (uninucleate) Các báo cáo cho thấy túi phấn rơi vào ba loại: trước phân bào (premitotic), phân bào (mitotic) sau phân bào (postmitotic) Sự đáp ứng tốt từ cấy túi phấn mà vi bào tử hoàn tất giai đoạn gián phân (meiosis), chưa bắt đầu phân chia hạt phấn lần đầu ví dụ Hyoscyamus Đáp ứng tốt từ hạt phấn vào thời điểm phân chia hạt phấn ví dụ thuốc (Nicotiana tabacum) Đáp ứng tốt từ hạt phấn giai đoạn hai tế bào đầu phát triển hạt phấn (Atropa belladonna) Các phương pháp khử trùng Sự khử trùng thực với hóa chất khử trùng Thông thường khử trùng toàn phát hoa trước khử trùng hoa V Tiền sử lý mầm hoa túi phấn Xử lý hoa phát hoa chứa hạt phấn giai đoạn thích hợp cho thấy có cải thiện sản lượng phôi hình thành số Xử lý nhiệt độ trước 2-30 ngày nhiệt độ 3-100C, cấy Nicotiana, Datura 350C Capsicum kích thích tạo phôi Ngân hoa cắt vào nước vài ngày Ly tâm túi phấn 3-5gs-1 Áp dụng chân không VI Phương pháp tách phần nhỏ IV - - Một số loài có túi phấn dễ tách từ hoa Tuy nhiên, số loài lấy hạt vùng nhiệt đới Panicum, Penisetum Setaria việc tách thành phần túi phấn nhỏ khó khăn tốn nhiều thời gian, nên người ta khuyến cáo nên cấy toàn phát hoa đặt môi trường lỏng, lắc chậm Sự phóng thích hạt phấn ngẫu nhiên Hạt phấn lấy từ túi phấn học hay nứt tự nhiên túi phấn Hạt phấn tách ra, cấy vào môi trường agar môi trường lỏng phát triển hạt phấn xảy bên túi phấn Kỹ thuật tách Kỹ thuật bao gồm tách túi phấn để phóng thích bào tử tốt để nứt tự nhiên Kỹ thuật thành công thuốc thành công khác Pennisetum typhoides Túi phấn lấy từ mầm hoa non làm đồng với máy đồng mẫu Theo cách này, dung dịch hạt phấn thô làm Dung dịch lọc, ly tâm gạn lấy phần bên chủng pipette môi trường đĩa petri (Debergh, 1974 trích từ Pierik, 1987) (Hình 5.5) Môi trường nuôi cấy Môi trường rắn lỏng : Trong nhiều năm nghiên cứu, người ta nhận thấy rằng, hầu hết kiểu agar sử dụng để làm cứng môi trường chứa hỗn hợp gây hại cho sức khỏe hạt phấn Một dạng gel đề nghị sử VII - - - - dụng agarose sử dụng môi trường lỏng Tuy nhiên, bất lợi môi trường lỏng yếm khí, tạo nhiều callus khả biến đổi thành thấp Áp suất thẩm thấu: Mặc dù có thông tin vấn đề này, hàm lượng đường cao môi trường (8-12%) hạn chế phát triển mẫu cấy Các kết cho thấy, hàm lượng đường môi trường thấp (2-4%) cho kết tốt Chất điều hòa sinh trưởng: Một số loài không cần chất điều hòa sinh trưởng, số loài khác cần chất điều hòa sinh trưởng, 2,4-D; BAP IAA cần Chất hữu nitrogen khác: Khoai Tây thành phần môi trường thích hợp cho nuôi cấy túi phấn lấy hạt Hỗn hợp khác: Than hoạt tính thành phần chủ yếu khuyến cáo nên sử dụng nuôi cấy túi phấn, chất hấp thụ chất vitamin, phenol, sắt…được phóng thích từ mô già Một khả khác ngoại hấp than 5(hydroxymethyl)-2-furfural, sản phẩm phân hủy đường bị hấp khử trùng Điều kiện ủ Nhiệt độ: Nhiệt độ ủ yếu tố quan trọng trình nuôi cấy Túi phấn hầu hết loài nuôi cấy thường thích hợp 250C Tuy nhiên,ở VIII - - - vài loài đặc biệt cần nhiệt độ 350C thời gian ngắn Brassica Ánh sáng: Ít có chứng hiệu ánh sáng trình nuôi cấy Tuy nhiên kinh nghiệm cho thấy, cấy túi phấn nên để tối thành phôi hay callus Mật số túi phấn: Người ta khuyến cáo cấy môi trường lỏng 60 túi phấn đặt ml môi trường Các tế bào đơn bội thực chứa nhiễm sắc thể đơn Kiểu hình biểu đơn thông tin di truyền Một lãnh vực thường đề cập cấy túi phấn tạo tế bào đực (androgenesis) Tuy nhiên, chúng thường sử dụng theo nghĩa hạn chế để tạo đơn bội đơn bội nhân đôi từ túi phấn Khi bắt đầu nuôi cấy từ tứ bội (tetraploid), kết tạo đơn bội có đôi thông tin di truyền gọi nhị đơn bội (dihaploid) Trước phân bào hình thành hạt phấn xuất hiện, người ta gọi vi bào tử (micropore)và sau gọi hạt phấn IX Lợi ích cấy vi bào tử (micropore) cấy túi phấn Trong trình phát triển vi bào tử thường không tiến triển qua phân chia đầu chất ngăn cản túi phấn Sự sinh sôi nhanh mô vách túi phấn xảy kết nhị bội (diploid) không đồng Bắt đầu với vi bào tử tách rời tạo đồng nhất, chúng diploid (trường hợp hạt cốc khác) triploids (Petunia) Cấy vi bào tử cho quần thể đồng cây, kết từ phát triển vi bào tử từ hạt phấn, lấy mô vách túi phấn X Ưu điểmvà nhược điểm phương pháp Một số ưu điểm phương pháp sau: - Kỹ thuật đơn giản Ở số loài phân chia tế bào dễ dàng tế bào hạt phấn chưa thực chín Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốt với môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm ứng môi trường cao) Có thể sản xuất thể đơn bội với số lượng lớn va nhanh chóng Trong thí nghiệm sử dụng môi trường Datura innoxia, tần suất cảm ứng với môi trường hạt phấn đạt tới 100% điều kiện tối ưu sản xuất 1000 callus từ bao phấn Có thể xác định kết vòng 24 từ tế bào bắt đầu phân chia Một số nhược điểm tạo thể đơn bội nuôi cấy bao phấn là: - Đối với số loài nhiều tạo đơn bội Ở ngũ cốc, thu xanh ít; nhiều bạch tạng bị thể khảm - Dễ vất bỏ bao phấn tạo thể đơn bội Để đạt kết mong muốn cần thiết phải có định hướng cụ thể Nguồn tài liệu tham khảo - Sách Công Nghệ Sinh Học Thực Vật (Trường Công Nghệ TP HCM-Biên soạn: ThS Trịnh Thị Lan Anh) Trang Wed Diễn Đàn Sinh Học Trẻ Trang Wed TaiLieu.vn Tài liệu Nuôi cấy mô tế bào thực vật ( GS Trần Văn Minh )